摘要：銹菌是最大的一類植物病原真菌，其引起的病害嚴重威脅著全球農業生產安全。銹菌作為活體營養寄生菌，在其與寄主互作過程中，會分泌大量效應子以促進其侵染。開展病菌效應子調控寄主免疫機制的研究將為銹病持久綠色防控提供理論依據。本文主要針對銹菌效應子的功能及其調控寄主免疫機制方面的研究進行了概述，并對銹菌效應子今后的研究方向進行了展望。

　　關鍵詞：銹菌;寄主植物;效應子;植物病原互作

　　銹菌目是真菌界最大的目之一，目前報道該目已有000余種(AimeMcTaggart，2021)。由銹菌引起的病害不僅能夠危害如小麥、大豆和咖啡等作物導致作物產量降低品質下降，也能夠危害楊樹、桉樹和松樹等樹木影響木材產量(Deanetal.，2012;Fisheretal.，2012;Sniezkoetal.，2012)。自1990年以來，大豆銹菌Phakopsorapachyrhizi引起的大豆銹病在南美洲造成每年超過20億美元的經濟損失(Godoyetal.，2016;Goellneretal.，2010)。在非洲、亞洲以及南美洲，由咖啡駝孢銹菌Hemileiavastatrix引起的咖啡葉銹病造成每年20億30億美元的損失(Talhinhasetal.，2017)。

　　由小麥銹菌引起的銹病嚴重威脅著世界糧食安全。據統計，全球每年由小麥銹病造成的經濟損失達到40億50億美元(Figueroaetal.，201)。我國作為小麥條銹病最大的流行區，自1950年以來暴發了次嚴重的小麥條銹病大流行，給小麥生產造成了巨大損失，嚴重威脅著我國的糧食安全(Zengetal.，2021)。銹菌是一類活體營養專性寄生菌，具有復雜的生活史，多數需要在種不同寄主(轉主寄主)上侵染來完成其整個生活史，在不同生長階段會產生性孢子、銹孢子、夏孢子、冬孢子和擔孢子種不同類型的孢子(Aimeetal.，2017)。

　　作為活體營養寄生真菌，銹菌能夠侵入植物組織中，突破植物細胞壁后在壁內擴張，同時內陷周圍寄主質膜，形成管狀的頸部和頂端膨大的吸器(康振生等，1994;Garnicaetal.，2014)。銹菌吸器不僅是病原物吸收營養的主要場所，而且也是分泌蛋白(效應子)大量表達分泌的主要場所(Garnicaetal.，2014;Sperschneideretal.，2015)。一直以來，由于銹菌無法離體培養且缺乏穩定遺傳轉化體系，嚴重制約了其功能基因組學的研究。

　　因此，亟需解析銹菌與寄主植物的互作機制，為銹菌的持久綠色防治提供理論依據。植物與病原菌在長期“軍備競賽”的過程中，發展出了病原相關分子模式(pathogenassociatedmolecularpattern，PAMP)誘導的免疫(PAMPtriggeredimmunity，PTI)與效應子誘導的免疫(ffectortriggeredimmunity，ETI)這個層次的免疫模式。植物細胞表面模式識別受體(patternrecognitionreceptor，PRR)通過識別PAMP如鞭毛蛋白、幾丁質等來激活第一層PTI反應。

　　為了對抗PTI，病菌則通過分泌效應子干擾植物PTI反應，從而促進其在寄主中的定殖。為了應對病原物這一策略，植物會利用抗病(resistance，)蛋白來特異性識別某些效應子，從而觸發ETI反應。ETI與PTI反應的理論框架構成了經典認知的Zigzag模型(JonesDangl，2006)。研究表明，PTI與ETI可以共用一些主要免疫組分(Pruittetal.，2021)，同時ETI與PTI反應也能夠相互促進，從而產生更強的免疫反應(Ngouetal.，2021;Tianetal.，2021;Yuanetal.，2021)。

　　銹菌與寄主的互作也符合“基因對基因”假說，即每個寄主的抗病基因，在病原物中都有其對應的無毒(avirulence，Avr)基因與之識別，從而觸發ETI反應(Flor，1971)。隨著對病菌效應子研究的不斷深入，發現病菌分泌的效應子不僅可以抑制PTI反應，同時也能夠抑制寄主的ETI反應(Bourrasetal.，2015)。在銹菌與植物互作過程中，病菌效應子發揮著重要作用，解析其調控植物免疫機制成為目前的研究前沿和熱點。近年來，隨著基因組學及分子生物學技術的高速發展，銹菌效應子及其調控植物免疫機制解析等方面的研究也取得了一定進展。本文綜述了近年來銹菌效應子功能及其調控植物免疫研究的現狀，并對未來值得關注的重點研究方向進行了探討，以期為植物銹病的持久綠色防控提供策略和理論依據。

　　1銹菌分泌蛋白組

　　廣義上，能夠改變植物細胞結構和功能，從而促進病原菌定殖或觸發寄主防衛反應的蛋白質和小分子都可以定義為效應子，包括了PAMP、無毒蛋白(Avr)、毒素以及一些降解酶等(Hogenhoutetal.，2009)。一般認為，效應子具有一個N端含15~30個疏水性氨基酸殘基構成的信號肽，不具有保守結構域，長度小于300個氨基酸，且富含半胱氨酸以形成二硫鍵增強蛋白質的穩定性(Duplessisetal.，2011;Ganetal.，2013)。隨著越來越多的研究表明，蛋白長度大于300個氨基酸或含有某些酶、酶抑制劑、糖結合蛋白和毒素等保守結構域的病菌蛋白同樣可以發揮效應子功能(Maetal.，2015;Salcedoetal.，2017)。

　　近10年來，隨著測序技術的不斷發展和完善，越來越多的銹菌基因組被公布，為銹菌分泌蛋白組的預測與分析奠定了重要基礎。與其他擔子菌大小約47Mb的基因組相比較(Mohanta&Bae，2015)，侵染單子葉植物的銹菌基因組大小在53~135Mb，而侵染雙子葉植物的銹菌基因組大小在101~1000Mb。與之對應，擔子菌平均基因數量約為15400個(Mohanta&Bae，2015)，而侵染單子葉植物的銹菌基因數量有14321~28801個，侵染雙子葉寄主的銹菌基因數量有13364~16399個。

　　這些結果表明，盡管銹菌缺少一些保守的基因，但是顯然其擁有更為龐大的基因組。借助基因組信息，利用N端信號肽預測、跨膜結構等特征分析，在侵染單子葉植物的銹菌基因組中預測到518~2999個分泌蛋白，而在侵染雙子葉植物的銹菌基因組中預測到615~1184個分泌蛋白。目前現有數據表明，銹菌的分泌蛋白數量相較于白粉菌分泌蛋白數量出現了顯著增加，這可能與銹菌復雜的生活史以及具有轉主寄主現象有關(Barsoumetal.，2019)。亞麻銹菌Melampsoralini在亞麻上可以完成其完整的生活史，而其預測的分泌蛋白只有762個，明顯少于擁有轉主寄主的其他銹菌(Nemrietal.，2014)。

　　另外，楊樹銹菌Melampsoralaricipopulina侵染楊樹及其轉主寄主落葉松，和小麥條銹菌Pucciniastriiformisf.sp.tritici侵染小麥及其轉主寄主小檗的轉錄組測序數據表明，銹菌在2種不同寄主上分別有特異性表達的分泌蛋白(Lorrainetal.，2018;Zhaoetal.，2021)。這些研究為上述的推測提供了證據。盡管目前完成測序的只有少數銹菌，并且大部分為雙核基因組，但隨著組裝技術與測序技術的發展，銹菌的2種單倍型基因組高質量組裝成為可能(Lietal.，2019a;Milleretal.，2018;Schwessingeretal.，2018)，這有助于更加準確地預測銹菌基因組和加速對銹菌功能基因組學的研究進展。

　　2銹菌毒性效應子與植物免疫

　　2.1質外體效應子

　　質外體由細胞壁和外繞共質體的胞外空間組成。質外體中包含的植物細胞壁以及植物分泌的一些蛋白酶和抗菌蛋白等從物理以及化學層面防御病原物的入侵。植物細胞膜上還存在著PRR，能夠識別內源性的損傷相關分子模式(damageassociatedmolecularpattern，DAMP)或PAMP來激發植物PTI免疫(Boutrot&Zipfel，2017)。

　　作為應對策略，病原物分泌質外體效應子來突破物理以及化學防御，并通過各種機制干擾質外體的免疫。蠶豆銹菌Uromycesfabae中的銹菌轉運蛋白1(rusttransferredprotein1，RTP1)是第1個被鑒定到的能夠轉移到植物細胞中的真菌效應子。RTP1在吸器外間質中參與微絲骨架的形成從而穩定真菌結構，并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性(Kemenetal.，2005;2013;Pretschetal.，2013)。

　　植物病程相關蛋白1(pathogenesisrelatedprotein1，PR1)的C末端短肽CAPE1(cysteinerichsecretoryprotein，antigen5andpathogenesisrelatedprotein1(CAP)derivedpeptide1)能夠作為DAMP激發免疫反應(Chenetal.，2014)。小麥條銹菌與葉銹菌中的PNPi(Puccinianonexpresserofpathogenesisrelatedgenes1(NPR1)interactor)被報道可以在質外體中靶向小麥病程相關蛋白(TriticumaestivumPR1a，TaPR1a)的C端，抑制植物免疫(Bietal.，2020)。幾丁質作為真菌典型的PAMP能夠激發植物PTI反應。小麥條銹菌另一個質外體效應子Pst_13661編碼1個多糖脫乙酰化酶，能夠修飾條銹菌細胞壁幾丁質，增加了植物幾丁質酶識別底物的難度，降低幾丁質的激發子活性，最終削弱植物應答幾丁質誘導的免疫反應(Xuetal.，2020)。

　　活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)迸發作為免疫反應標志，也成為了病原物攻擊的靶標。小麥條銹菌中，通過向質外體中分泌鋅過氧化物歧化酶1(superoxidedismutase1，SOD1)以及過氧化氫酶1(catalase1，CAT1)來清除植物產生的活性氧從而幫助自身侵染(Liuetal.，2016a;Yuanetal.，2021b)。在楊樹銹菌中，Mlp124202與突觸結合素(synaptotagminA，SYTA)在細胞膜上互作(Gaouaretal.，2016)。而Mlp124357的GxxG基序幫助其定位于細胞膜上，進而識別擬南芥蛋白二硫鍵異構酶11(Arabidopsisproteindisulfideisomerase11，AtPDI11)發揮其致病功能(Madinaetal.，2020)。盡管質外體效應子的研究取得了一定進展，但目前銹菌中的PAMP分子仍沒有鑒定到，這在一定程度上限制了對銹菌質外體效應子的研究。

　　2.2胞質效應子

　　除了質外體效應子外，許多真菌效應子可以通過分泌至胞間質再轉運到植物細胞內，與細胞質、細胞核以及細胞器內不同成分相互作用，從而促進病原物侵染。例如油菜黑脛病菌Leptosphaeriamaculans無毒效應子AvrLm1最早被認為在胞間質積累(Goutetal.，2006)。

　　然而，最新的研究表明AvrLm1在歐洲油菜中與細胞有絲分裂原活化蛋白激酶9(cytoplasmicmitogen‐activatedproteinkinase9，BnMPK9)互作，增強其穩定性進而增強依賴BnMPK9的細胞死亡(Maetal.，2018)。此外大麥白粉菌Blumeria.graminisf.sp.hordei效應子CSEP0105靶向胞質中的小分子熱休克蛋白(smallheatshockprotein，sHSP)，通過抑制其分子伴侶活性以提高病原菌毒性(Ahmedetal.，2015)。通過免疫熒光定位發現，蠶豆銹菌中的效應子UfRTP1能夠從吸器外間質轉運至植物細胞質與細胞核中，然而其在胞內發揮的功能仍然有待研究(Kemenetal.，2005;2013;Pretschetal.，2013)。

　　在小麥條銹菌中效應子UfRTP1的直系同源蛋白Pst18363靶向小麥防衛反應負調控因子(nucleosidediphosphateslinkedtosomemoietyX，TaNUDX)水解酶23(TaNUDX23)，通過穩定TaNUDX23促進小麥條銹菌侵染(Yangetal.，2020)。小麥條銹菌效應子Hasp8被證明能夠在細胞質中抑制植物基礎免疫(趙聰聰等，2020)。

　　另一個條銹菌中胞質效應子PstPEC6能夠與擬南芥腺苷激酶(Arabidopsisadenosinekinase，ADK)互作，并通過調控ADK活性影響下游細胞分裂素的產生與甲基化轉移，進而促進小麥條銹菌生長(Liuetal.，2016b)。NPR1是介導植物系統獲得抗性(systemacquiredresistance，SAR)的重要調控因子。條銹菌中的PNPi除了能夠在質外體中與植物病程相關蛋白TaPR1a互作調控植物免疫外，還可以借助其N端的RxLRDeerlike結構域轉運至細胞質靶向小麥NPR1，通過競爭性抑制NPR1與TGA2轉錄因子結合，干擾植物的SAR(Wangetal.，2016)。

　　2.3細胞核效應子

　　核靶向效應子一直是真核生物效應子中的研究熱點，目前已發現多例真菌、卵菌效應子能夠進入植物細胞核，并干擾植物核中生物功能。例如卵菌中皺縮壞死(crinklingandnecrosisprotein，CRN)類效應子以植物細胞核核為靶標(RamirezGarcésetal.，2016;Schornacketal.，2010;Stametal.，2013)。銹菌中已鑒定的效應子中帶有核定位信號(nuclearlocalizationsignal，NLS)序列或者鋅指結構等DNA結合區域仍比較少。亞麻銹菌無毒效應子AvrP中存在鋅指結構，這一結構被標注為經典DNA結合區域，隨后的亞細胞定位表明AvrP可能靶向細胞核(Zhangetal.，2018)。

　　一些關鍵的免疫因子被證明能夠在細胞質與細胞核中穿梭(Garcíaetal.，2010)。小麥條銹菌中核質靶向效應子PstGSRE1與ROS正向調控轉錄因子TaLOL2在細胞質中互作，進而干擾TaLOL2進入細胞核內激發下游ROS相關免疫反應(Qietal.，2019)。亞麻銹菌中的效應子Mlp124478能夠在植物細胞核與核仁中積累，并通過結合TGA1a啟動子序列從而抑制防衛反應基因的表達(Ahmedetal.，2018)。

　　3無毒效應子與植物免疫Flor(1971)

　　基于亞麻銹菌亞麻互作系統提出“基因對基因”假說，即寄主R蛋白特異性識別病原菌的無毒蛋白Avr觸發植物ETI免疫。銹菌與植物的互作符合經典的“基因對基因”學說，因這種互作機制在病理學中的重要性而長期成為銹菌領域的研究重點。伴隨著寄主抗銹菌R基因的克隆，銹菌無毒基因的克隆也取得了進展。

　　迄今為止，在銹菌中先后報道了9個位點的無毒基因的克隆。通過對亞麻銹菌雜交F1代菌株CH5的自交群體，通過圖位克隆鑒定到6個無毒基因AvrL567、AvrM、AvrP4、AvrP123、AvrM14和AvrL2(Doddsetal.，2004;Catanzaritietal.，2006;Andersonetal.，2016)。通過對小麥稈銹菌誘變群體及自發突變群體與相應親本菌株進行比較分析，克隆到3個無毒基因AvrSr35、AvrSr50及AvrSr27(Chenetal.，2017;Salcedoetal.，2017;Upadhyayaetal.，2021)。此外，在咖啡駝孢銹菌H.vastatrix中也報道了1個能與寄主抗病基因SH1特異性識別的效應子基因HvEC016(Maiaetal.，2017)。

　　銹菌自然群體及有性群體中無毒基因及其編碼產物的序列多態性在一定程度上反映了其躲避植物免疫系統識別的策略及進化歷程。亞麻銹菌的無毒蛋白AvrL567在群體中的毒性序列與無毒序列的差異集中反映為氨基酸的替換，序列差異最高可達20%，但序列長度始終保持一致，暗示AvrL567的序列完整對病原菌侵染定殖具有正向作用。然而自然群體中部分AvrL567序列可以被L5、L6、L7其中之一識別而不與另外2個抗病蛋白作用，反映了病原菌與植物互作逐步演化的過程(Doddsetal.，2006)。AvrM在亞麻銹菌CH5自交群體中出現了5種無毒序列，除了序列差異外編碼產物長度也出現了差異，而在唯一的毒性蛋白avrM序列上出現兩段缺失以及14個多態性位點(Catanzaritietal.，2006)。

　　對AvrL567及AvrM相關無毒蛋白的晶體結構解析顯示大部分在毒性序列中出現多態性的氨基酸位于蛋白表面，這種改變顯著影響了無毒蛋白表面的理化性質，可能因此影響了與R蛋白的識別(Wangetal.，2007;Veetal.，2013)。AvrP4序列在群體中的差異也反映為氨基酸的替換，且多態性基本集中于C端，并且序列中的6個半胱氨酸在群體中高度保守(Catanzaritietal.，2006)。AvrL567、AvrM和AvrP4的編碼區域在自然群體中的多態性顯著性高于其周圍的基因組序列，暗示無毒基因編碼區域處于更高的自然選擇壓力下(Doddsetal.，2004;Catanzaritietal.，2006)。AvrL2的毒性變化也同時體現在氨基酸的替換與編碼產物長度的多態性上。

　　而染色體的大片段缺失造成AvrM14基因序列丟失是M1、M4無毒菌株產生自發毒性突變的主要原因(Andersonetal.，2016)。對抗病基因Sr35表現為無毒的小麥稈銹菌菌株在經甲磺酸乙酯(ethylmethylsulfone，EMS)處理后，AvrSr35序列上產生了多種非同義單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)，導致毒性突變。而在自然群體無毒菌株中的AvrSr35到毒性菌株中的avrSr35的變化則主要來自于微型反向重復轉座(miniatureinvertedrepeattransposableelement，MITE)元件的插入(Salcedoetal.，2017)。

　　AvrSr50功能的喪失則主要來自大片段插入，目前僅發現少數avrSr50來自于氨基酸序列多態性(Chenetal.，2017)。最新報道的小麥稈銹菌無毒基因AvrSr27在無毒菌株與毒性菌株間存在拷貝數差異，此外毒性菌株中的avrSr273序列編碼產物也可以與Sr27識別并引起過敏性壞死(hypersensitiveresponse，HR)，但其在無毒菌株中的表達量顯著低于AvrSr271，推測無毒基因表達量未達到閾值也可能是造成毒性變異的原因(Upadhyayaetal.，2021)。

　　4展望

　　效應子在病原物與植物互作體系中發揮著重要作用。大量證據表明，效應子可以從多個通路干擾植物免疫從而促進病原物侵染，與此同時，效應子也會被植物免疫系統識別從而觸發植物免疫(Heetal.，2020;Tariqjaveedetal.，2021)。對于效應子功能研究的深入解析，能夠拓展病菌致病機理研究，進而為開辟持久有效的抗病防控策略奠定了基礎。

　　對于銹菌來說，無法進行穩定遺傳轉化是限制其功能基因組學研究的最大阻礙。盡管在亞麻銹菌中報道了一種穩定轉化體系(Lawrenceetal.，2010)，但是迄今為止，這種方法未見成功應用的報道。寄主誘導的基因沉默技術(hostinducedgene silencing，HIGS)的出現為解決銹菌目前研究困境帶來了新的方向(Nowaraetal.，2010)。HIGS技術是在RNA干擾(RNAinterference，RNAi)與病毒誘導的基因沉默(virusinducedgenesilencing，VIGS)技術基礎上發展起來的，通過將病原菌靶基因序列互補的雙鏈RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)導入植物中，被識別后產生21~35nt的小干擾RNA分子(smallinterferingRNA，siRNA)。

　　當病原菌侵入植物時，植物體內的dsRNA或者siRNA通過某種途徑進入病原菌中，特異性沉默病原菌靶基因。因此可以利用HIGS技術快速篩選致病相關效應子，例如小麥條銹菌效應子PstGSRE1、Pst18363以及Pst_13661等(Qietal.，2019;Xuetal.，2020;Yangetal.，2020)。同時，利用轉基因HIGS技術沉默病原菌致病因子已獲得了一批穩定的小麥抗條銹病材料，為植物抗銹病資源的開發及應用提供了新途徑。

　　可預見的是，由于效應子的遺傳多樣性，利用HIGS技術沉默重要保守效應子以創制抗病材料為銹病綠色防控的重要策略之一。近年來，銹菌效應子的鑒定及其調控植物免疫機制的研究已取得了一定進展，但關于銹菌效應子轉運問題仍然亟待解決。卵菌效應子中存在著一類RxLREER基序，被證明參與效應子的轉運(Wawraetal.，2017)，然而真菌中對于效應子的轉運信號知之甚少。通過免疫膠體金試驗證實了蠶豆銹菌效應子RTP1以及亞麻銹菌效應子AvrM能夠進入植物細胞內(Kemenetal.，2005;2013;Rafiqietal.，2010)。通過免疫熒光試驗證明楊樹銹菌中的幾個效應子可以在吸器周圍檢測到(Hacquardetal.，2012)。

　　盡管免疫膠體金與免疫熒光試驗可以證明效應子的轉運，但也面臨著單抗制備周期長且價格昂貴、免疫信號檢測困難等問題。近期關于效應子的報道中，大都借助于酵母、煙草以及植物原生質體等異源系統來觀察效應子的分布。值得關注的是，目前效應子在稻瘟菌Magnaporthegrisea中的轉運研究已經開展了一系列的工作，多個效應子能夠在吸器與生物營養界面復合體(biotrophicinterfacialcomplex，BIC)以及植物中被檢測到(Kimetal.，2020)。

　　同時，在禾谷鐮刀菌Fusariumgraminearum中效應子Osp24的研究中，通過將帶有核定位信號Osp24NLSGFP融合熒光蛋白在禾谷鐮刀菌中表達后接種小麥，通過在小麥的細胞核中檢測到GFP熒光信號證明了Osp24可以轉運到植物細胞內部(Jiangetal.，2020)。

　　借助于稻瘟菌/禾谷鐮刀菌體系，將銹菌效應子在該體系中表達為研究者們提供了一種證明效應子轉運的思路。效應子的研究工作為植物病理學的研究開啟了新的大門，銹菌作為活體營養專性寄生菌擁有大量潛在的效應子，只有少部分的效應子功能被解析，在許多方面的研究仍處于起步階段。PAMP作為被植物第一層免疫系統識別的分子，在植物病原物分子互作研究中具有重要意義。

　　近年來，不斷有其他病原物中的PAMP分子被鑒定，如尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum中的FoEG1、蘋果樹腐爛病菌Valsamali的VmE02等(Nieetal.，2019;Zhangetal.，2021)。鑒定并解析銹菌中的PAMP效應子將是未來研究熱點之一。研究發現，大麥白粉菌中的Avrk1和Avra10，大麗輪枝菌Verticilliumdahliae中的Vdlsc1以及玉米瘤黑粉菌Ustilagomaydis中的Cts1均不含有N端信號肽序列，被證明為非典型分泌的效應子(Ridoutetal.，2006;Liuetal.，2014;Terfrüchteetal.，2017)。

　　目前對銹菌效應子的研究仍然集中在含有N端信號肽并通過經典高爾基體內質網系統分泌的效應子，銹菌中的非典型分泌蛋白還未見報道。無毒效應子的鑒定與功能解析，有助于加速解析病原物毒性變異的分子機理，能夠為銹病的防控提供重要的理論支撐。目前銹菌無毒效應子克隆的報道仍然只集中在亞麻銹菌與小麥稈銹菌中。

　　通過銹菌有性群體的創制，借助于傳統圖位克隆或全基因組重測序，以及通過EMS誘變等方法創制突變菌系等方法，能夠加速無毒效應子的鑒定。對銹菌無毒基因的鑒定與功能解析以及對參與或干擾植物ETI反應效應子的研究將是未來銹菌效應子的研究熱點。這些研究將為深入了解銹菌與植物互作機制帶來新的視角，并為創制廣譜抗銹病材料及病害的綠色持久控制開辟新的視野。

　　作者：郭嘉錢朝偉朱浩川郭軍康振生