摘要為研究猴樟CbP5CS1蛋白的序列結(jié)構(gòu)和功能，以猴樟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用PCR技術(shù)克隆猴樟CbP5CS1基因CDS序列，構(gòu)建表達載體。結(jié)果表明，克隆得到的序列具有一個2163bp完整的ORF框，編碼720個氨基酸，與沉水樟中收錄的RWR86140.1基因序列一致性達98.47%，GenBank登錄號為MW813958;生物信息學分析結(jié)果表明，CbP5CS1蛋白化學分子式為34355609963105022，相對分子量77.91kD，理論等電點6.16，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無明顯無序化特征，為脂溶性和親水性蛋白，磷酸化氨基酸位點有95個;CbP5CS1蛋白具有PLN02418家族結(jié)構(gòu)域，具備δ吡咯啉羧酸合成酶的功能，在樟屬植物中具有較高的保守性;CbP5CS1蛋白亞細胞定位預測為細胞質(zhì)，為跨膜蛋白，但不存在信號肽;重組質(zhì)粒用XbaI酶切后，獲得兩條帶片段，與預期的2226bp和11516bp的大小一致，表明目的基因已經(jīng)成功插入并連接到植物表達載體pCAMBIA1301上。

　　關(guān)鍵詞猴樟;CbP5CS1;基因克隆;表達載體

　　猴樟CinnamomunbodinieriLevl.)為樟科樟屬常綠喬木，主要分布于中國南方地區(qū)，是中國重要的精油加工樹種、綠化樹種和林用樹種。近年來的研究表明，猴樟的生長速度和抗寒性優(yōu)于香樟，猴樟比普通香樟具備更強的耐鹽堿脅迫能力，堿脅迫下猴樟體內(nèi)的脯氨酸明顯高于普通香樟，脯氨酸在猴樟耐堿脅迫過程中起重要作用韓浩章等,2019)。植物體內(nèi)的脯氨酸含量對環(huán)境變化敏感，在櫸樹韓浩章等2021)、銀杏孫聰聰?shù)?017)、白沙蒿王麗等2018)上的研究結(jié)果也表明，鹽堿脅迫條件下植物體內(nèi)的脯氨酸含量會大大提高，抗性強的樹種中含有更高的脯氨酸含量。

　　外源施用脯氨酸能夠促進植物光合能力和水分利用能力(Noreenetal.,2018;Waeletal.,2020)，還能通過誘導紫花苜�？寡趸�酶活性提高抗鹽堿脅迫能力鄧鳳飛等2016)。Igarashi等(1997)研究表明，鹽脅迫下水稻抗鹽品種的δ吡咯啉羧酸合成酶OsP5CS基因表達量和脯氨酸積累量均增加，而鹽敏感品種中兩者變化不明顯。過量表達脯氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶P5CS會導致植物體內(nèi)脯氨酸的積累(Mattiolietal.,2008)，研究P5CS蛋白理化特性，構(gòu)建超表達載體，能為進一步研究脯氨酸在猴樟耐堿脅迫過程中的作用機理提供依據(jù)。

　　1結(jié)果與分析

　　1.1猴樟CbP5CS1基因的克隆以猴樟的cDNA為模板，通過PCR擴增得到一條約2000bp左右的條帶，片段大小與預期一致，通過測序得到長2226bp的CDS序列。

　　PCR產(chǎn)物送公司測序，測序結(jié)果與沉水樟中收錄的RWR86140.1基因進行比對，序列一致性高達98.47%，具備脯氨酸合成酶的活性。將克隆獲得的基因編碼蛋白通過NCBIBLASTProtein與數(shù)據(jù)庫進行比對，根據(jù)比對結(jié)果顯示，所克隆得到的序列具有一個2163bp完整的ORF框，推導編碼720個氨基酸，將獲得的目的基因命名為CbP5CS1，獲得GenBank登錄號為MW813958。

　　1.2猴樟

　　CbP5CS1蛋白的生物信息學分析

　　1.2.1猴樟

　　CbP5CS1蛋白的理化性質(zhì)分析利用Protparam軟件對猴樟CbP5CS1蛋白的理化性質(zhì)進行分析，猴樟CbP5CS1蛋白相對分子量77.91kDa，理論等電點6.16，表明CbP5CS1基因編碼蛋白為弱酸性，化學分子式為34355609963105022，原子總數(shù)為11079，不穩(wěn)定指數(shù)值為29.24，不穩(wěn)定系數(shù)大于40時為不穩(wěn)定蛋白，因而該蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的。CbP5CS1蛋白脂溶指數(shù)為106.83，脂肪族氨基酸比例(28%)高于芳香族氨基酸(5%)，為脂溶性蛋白，其中帶負電荷的殘基(asp+glu)總數(shù)為91，帶正電荷的殘基(arg+lys)總數(shù)為82。

　　CbP5CS1蛋白具有PLN02418家族結(jié)構(gòu)域，具備P5CS的功能。利用ProtScale(web.expasy.org/protscale/)對猴樟CbP5CS1蛋白的親水性進行分析圖，得出總平均親水性值(GRAVY)為0.008。通常認為，蛋白序列中氨基酸分值越低親水性越強，分值越高疏水性越強，猴樟CbP5CS1氨基酸序列中第73位氨基酸分值最低為2.589，親水性值最強;第411位氨基酸分值最高，為2.789，疏水性最強，親水性氨基酸均勻分布在整個多膚鏈中，沒有明顯的疏水性區(qū)域，因此，推測猴樟CbP5CS1蛋白為親水性蛋白。

　　1.2.2猴樟

　　CbP5CS1蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預測根據(jù)PRABI(npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl)在線軟件預測結(jié)果圖，該蛋白的組成為46.67%無規(guī)則卷曲、33.33%α螺旋和20.00%延伸鏈，因而猴樟CbP5CS1蛋白可能具備較復雜的功能，其穩(wěn)定性主要依賴于氫鍵。利用FoldIndex預測猴樟CbP5CS1蛋白序列折疊無序化圖，分析得出該蛋白無序化比例為2.5%，存在個氨基酸無序化結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域可能具備特殊的功能。

　　利用NetPhos3.1預測猴樟CbP5CS1蛋白磷酸化位點圖，分析得出該多肽鏈包含60個絲氨酸(S)、29個蘇氨酸(T)和個酪氨酸(Y)磷酸化位點，該蛋白可能主要通過蛋白激酶發(fā)生磷酸化。利用SwissModel(www.Swissmodel.expasy.org)進行CbP5CS1蛋白三級結(jié)構(gòu)預測分析，利用SwissModel同源建模圖，經(jīng)過比對CbP5CS1編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)與PDB：6rtr.1.A的氨基酸序列一致性達61%，6rtr.1.A序列的編碼蛋白為SemialdehydedehydrogenasePcd(半醛脫氫酶。

　　1.2.3猴樟

　　CbP5CS1蛋白亞細胞定位與跨膜結(jié)構(gòu)預測利用CellPLoc2.0在線分析軟件(www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/CellPLo2/)和LocTree3在線分析軟件進行猴樟CbP5CS1蛋白的亞細胞定位預測，結(jié)果表明該蛋白定位于細胞質(zhì)。利用TMpred(www.expasy.org/resources/tmpred)預測猴樟CbP5CS1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)圖，分析得出該蛋白在93~113aa、248~264aa處各有一個從內(nèi)到外的跨膜螺旋，其中心位點為105aa和256aa處。

　　在54~73aa、248~267aa、421~440aa處各有一個從外到內(nèi)的跨膜螺旋，其中心位點為65、256、431aa處;其中248~264aa處從內(nèi)到外的跨膜螺旋和248~267aa處從外到內(nèi)的跨膜螺旋分值超過500，具有生物學意義，推測可能是跨膜蛋白。利用SignalP5.0Server(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽預測圖，分析得出該蛋白Sec/SPⅠ型信號肽概率為0.084%，即猴樟CbP5CS1蛋白中極大可能不存在信號肽，不屬于分泌蛋白。

　　1.3pCAMBIA1301

　　CbP5CS1表達載體構(gòu)建及酶切驗證將pCAMBIA1301空載體和含有CbP5CS1基因的載體質(zhì)粒分別用NcoI和BglII雙酶切，回收具有相同酶切位點的目的條帶和載體，之后，將連接產(chǎn)物pCAMBIA1301CbP5CS1轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，菌液PCR篩選陽性克隆提取質(zhì)粒后進行序列測定，測序比對正確的質(zhì)粒用XbaI酶切該基因不含XbaI酶切位點，但在載體插入位置兩端各有一個XbaI酶切位點，因此選擇XbaI酶切驗證載體中是否正確插入了目的基因，用XbaI酶切后，獲得兩條帶片段，一條約2300bp，一條帶約11000bp左右，與預期的2226bp和11516bp的大小一致圖，酶切結(jié)果表明目的基因已經(jīng)成功插入并連接到植物表達載體pCAMBIA1301上。

　　2討論

　　脯氨酸不僅是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還與光合作用、呼吸作用密切相關(guān)，其合成場所為細胞質(zhì)和葉綠體，分解場所為線粒體丁澤紅等2016)。在滲透脅迫和氮素不足情況下，植物體內(nèi)脯氨酸的合成以谷氨酸途徑為主，P5CS是脯氨酸谷氨酸合成途徑中的關(guān)鍵限速酶王紅艷2016)，P5CS基因的表達特性對研究脯氨酸在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中的作用機理非常重要。Hu等(1992)首次從豇豆中克隆得到高等植物P5CS基因，該基因全長2417bp，包含單一開放閱讀框，編碼一個73.2kD多肽。

　　之后，研究者陸續(xù)從木薯付莉莉等2016)、擬南芥王翠平和華學軍2017)、甜菜張皓等2019)、鹽角草郝曉燕等2021)中克隆了P5CS基因，并對其耐鹽特性及其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)進行了分析，認為P5CS的蛋白結(jié)構(gòu)在不同物種之間并不一致，但基本功能是一致的。本試驗以猴樟cDNA為模版克隆的P5CS基因片段，具有一個2163bp完整的ORF框，編碼720個氨基酸序列，與沉水樟P5CS蛋白序列同源性為98.47%。通過MEGA7.0軟件構(gòu)建CbP5CS1蛋白系統(tǒng)進化樹的結(jié)果表明，猴樟CbP5CS1蛋白在進化上與同為樟科樟屬的沉水樟聚為一類，說明其親緣關(guān)系最近，樟科樟屬植物中該類蛋白具有較高的保守性。

　　利用NCBI的CCD工具進行蛋白結(jié)構(gòu)域預測結(jié)果表明，CbP5CS1蛋白具有PLN02418家族結(jié)構(gòu)域，具備δ吡咯啉羧酸合成酶的功能。CbP5CS1蛋白相對分子量77.91kD，理論等電點6.16，化學分子式為34355609963105022，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、無明顯無序化特征，為脂溶性、親水性蛋白，與周利霞等(2019)結(jié)果一致。CbP5CS1蛋白多肽鏈中0.500以上分值的磷酸化氨基酸位點為95個，而磷酸化作用在植物信號轉(zhuǎn)導、生長發(fā)育以及抗逆脅迫等方面發(fā)揮重要作用，說明P5CS的功能與逆境脅迫有關(guān)(Mogamietal.,2015)。

　　CbP5CS1蛋白的亞細胞定位預測為細胞質(zhì)，很可能為跨膜蛋白，但信號肽預測分析得出該蛋白極大可能不存在信號肽，不屬于分泌蛋白。本實驗將獲得的重組質(zhì)粒用XbaI酶切后，獲得兩條帶片段，一條約2300bp，一條帶約12000bp左右，與預期的2226bp和11516bp的大小一致，酶切結(jié)果表明目的基因已經(jīng)成功插入并連接到植物表達載體pCAMBIA1301上，為進一步通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究脯氨酸代謝在猴樟耐鹽堿脅迫中的作用提供支持。

　　3材料與方法

　　3.1試驗材料

　　試驗材料為耐鹽堿猴樟品系標注為HJHZ)3年生種苗，于2018年月上旬播種，2020年月上旬進行種苗表型鑒定與標記，同時移入鹽堿土壤環(huán)境試驗區(qū)進行栽培，株行距均為1.5。試驗區(qū)土壤pH值8.17，電導率153μS/cm，可溶性鹽含量15.89mg/g。于2020年月20日，取猴樟枝條頂部幼嫩葉片進行液氮速凍后，用RNAperpPurePlantKit(天根,北京試劑盒提取材料的總RNA，按照PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(TaKaRa,大連方法去除基因組DNA后，用TRPrimeMix(andomprimer)進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得的cDNA產(chǎn)物作為模板。

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　　3.2基因克隆

　　根據(jù)猴樟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得具備P5CS蛋白功能的CDS序列，將其命名為CbP5CS1，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計擴增引物，PCR反應(yīng)體系參照CloneUFOTMOneStepCloningKIT說明書，采用25μL體系：2×ProofastTMMasterMix12.5μL、10μmol上下游引物各1μL、模板0.6μL，用ddH補齊至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預變性180s;95℃變性10，55℃退火30s，72℃延伸60s，35個循環(huán);72℃延伸480s。PCR產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分離，之后，使用DpnⅠ(2n/50μL擴增產(chǎn)物消化后進行重組反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細胞(TSINGKE,北京，挑單菌落進行PCR鑒定，將PCR陽性菌落培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒送擎科生物技術(shù)有限公司測序。

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　　作者：韓浩章張麗華李素華趙榮王芳王曉立蔣亞華