摘要為進一步探究苦茶特異性狀形成的遺傳基礎，基于PacBio對苦茶進行Iso-Seq，最終得到Polishedconsensus序列132334個，其中有26184個為已知基因的新轉錄本，7115個為新基因，同時鑒定得到21106個SSR位點;基因結構分析結果中，4892個基因發(fā)生了可變剪切事件，其中內含子滯留事件占比最大;預測得到1918個新的轉錄因子，778個LncRNA。比較KEGG(10976+5626)、KOG(6296+1896)、GO(6221+575)三大數(shù)據(jù)庫功能注釋情況，發(fā)現(xiàn)注釋到KEGG的轉錄本數(shù)最多，其中多個轉錄本注釋到與茶葉品質和苦茶特異性狀形成相關的代謝途徑，如苦茶堿等嘌呤生物堿代謝(74+17)、氨基酸代謝(409+69)、苯丙烷生物合成(70+18)和萜類物質生物合成(152+31)等(括號內數(shù)值為未比對到基因組的轉錄本和新轉錄本數(shù)量)。這些發(fā)現(xiàn)將有助于苦茶特異性狀相關基因標記的開發(fā)、并為其形成的機理及遺傳機制的研究奠定基礎。

　　關鍵詞苦茶;全長轉錄組測序;LncRNA;可變剪切

　　苦茶(Camelliasinensis)是中國的一種特異茶樹種質資源[1]，由其制成的茶葉感官品質表現(xiàn)極苦，且與其他茶類的苦味不同，因此，被命名為苦茶。苦茶多分布于云南、四川，以及廣東、湖南、江西毗鄰區(qū)，尤以云南以及南嶺山脈兩側最多[2-3]。在苦茶的原生地，苦茶成為當?shù)厝嗣裆�活的必須品，將它作為一種藥物飲用，認為長期飲用苦茶具有“退火發(fā)汗、解毒、治病”的功效[2]。

　　農業(yè)論文投稿刊物：《西南農業(yè)學報》主要刊登農牧業(yè)各個學科應用基礎研究、應用技術、區(qū)域綜合開發(fā)和軟科學方面的研究報告、專題論文、研究簡報、學科進展述評等文章，立于大西南、面向全國、系學科地、及時地、有見地反映西南地區(qū)農業(yè)科學研究新成果、前沿動態(tài)，以推動農業(yè)科研、教育和生產的發(fā)展。

　　研究已證實，苦茶嘌呤生物堿的組分與常規(guī)茶樹差異較大，其以苦茶堿(1，3，7，9-四甲基尿酸)為主，其次是咖啡堿、可可堿[3-4]，苦茶堿具有鎮(zhèn)靜催眠[5]、抗抑郁[6]等藥理活性，并且毒理試驗鑒定苦茶堿為無毒[6]，其還可以削弱咖啡堿的興奮作用[7]，這使得苦茶的價值不斷提升，消費需求連年增加。苦茶除含有高含量的苦茶堿外，還有非兒茶素類茶多酚[8]。

　　同時，苦茶中還具有高含量的表沒食子兒茶素(EGC)，EGC含量與紅茶中關鍵品質成分茶黃素的含量呈極顯著正相關[2，9]，所以苦茶可以作為選育和培育特異高級紅茶茶樹品種的育種材料;以往的研究表明，苦茶茶葉中存在一種具有丁香香氣的特殊物質丁子香酚甙[2]。這說明苦茶還具有多種不同于常規(guī)栽培茶樹的特異性狀，這些性狀形成的機理、性狀相關基因標記的開發(fā)以及遺傳機制的研究，都需要借助于苦茶資源。當前，大多數(shù)轉錄組測序是基于Illumina平臺的第二代測序(SGS)技術生成的[10]。

　　但是，SGS技術不能產生較長的轉錄本，并且SGS無法獲得可變剪接等信息，從而限制了該技術在轉錄組測序中的利用[11]。而全長轉錄組測序是基于第三代測序(TGS)平臺進行的，該方法可以產生長讀段，因此可以直接測序全長轉錄本[12]，在這方面全長轉錄測序優(yōu)于短讀測序;另外，它還可用于選擇性剪接事件及初級-前體-成熟RNA結構的分析，以幫助更好地理解RNA的加工過程;此外，其可以在轉錄水平上全面分析由交替剪接和基因融合產生的結構變異，比SGS更準確地檢測結構變異(SV)，使其適合于多倍體物種或具有高重復序列和高雜合性的物種的轉錄組分析[13]。

　　由于茶樹基因組具有高的重復序列(至少包含64%的重復序列)和高的雜合度[14]，以及苦茶特異性狀形成機制需進一步解析。因此，本研究以苦茶為材料，利用PacBio平臺進行Iso-Seq，對所獲得序列與參考基因組比對、同時對其進行功能注釋、基因結構分析等，為苦茶特征形狀遺傳分析提供基礎數(shù)據(jù)，為更好地了解和利用這一重要的特異茶樹資源提供幫助。

　　1材料與方法

　　1.1試驗材料

　　用于測序分析的苦茶資源‘老曼娥苦茶’來源于云南省農業(yè)科學院茶葉研究所試驗基地，其6個不同組織(芽、葉、花芽、花蕾、莖和幼果)的樣品采摘后用液氮冷凍，并置于-80℃冰箱，之后送至諾禾致源科技股份有限公司(北京)進行測序。

　　1.2RNA提取與構建文庫

　　參照張亞真等[15]的方法，分別提取苦茶芽、葉、花芽、花蕾、莖、幼果不同部位的總RNA，檢測合格后進行等量混勻。利用帶有Oligo(dT)的磁珠從混勻后的RNA樣品中分離出mRNA，并利用SMARTerPCRcDNASynthesisKit將其反轉錄為cDNA，接著用BluePippin對cDNA進行片段篩選，對全長cDNA進行損傷修復、末端修復，并連接SMRT啞鈴型接頭，最終使用核酸外切酶消化獲得文庫。

　　1.3Iso-Seq及組裝分析

　　采用軟件SMRTLinkv5.0對輸出進行過濾和處理，參數(shù)：--minLength=200，--minRead-Score=0.75，最終得到的數(shù)據(jù)即為有效數(shù)據(jù)，校正后獲得CCS序列(CircularConsensusSe-quence，參數(shù)：--minPasses=1，minPredictedAc-curacy=0.8)。

　　通過檢測CCS是否包含5′-prim-er、3′-primer、poly-A對CCS進行分類找出FLNC(full-lengthnonchimera)序列，之后對FLNC進行聚類和校正，最終獲得polishedcon-sensus序列用于后續(xù)分析。使用MISA(http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)軟件對單、二、三、四、五和六核苷酸的最低重復次數(shù)分別設置為10、6、5、5、5和5，進行SSR搜索。

　　2結果與分析

　　2.1Iso-Seq分析

　　2.1.1測序結果與組裝全長

　　轉錄組測序共獲得8730808個Subreads(10G)，平均Subreads的長度為1145bp，N50為1741。通過校正，CCS序列(環(huán)形一致性序列)有418424個，含有5′端引物的reads數(shù)有338306個，含有3′端引物的reads數(shù)目為368458個，含有PolyA尾的reads數(shù)目為351952個;全長序列數(shù)目為295803個，F(xiàn)LNC序列的數(shù)目有217701個，且FLNC的平均長度為1836bp;最終獲得Pol-ishedconsensus序列132334個，用于后續(xù)分析。

　　2.1.2SSR分析

　　利用MISA對苦茶全長轉錄組測序獲得的25735條(大于500bp)轉錄本序列進行搜索，共在12926條轉錄本序列中發(fā)現(xiàn)符合標準的21106個SSR位點，其中5227個轉錄本含有大于1個SSR位點，SSR的發(fā)生頻率為50.22%，SSR出現(xiàn)率為82%，平均2.4kb出現(xiàn)1個SSR。

　　在檢測到的苦茶轉錄組SSR中，單、二和三核苷酸重復類型的比例較大，分別占總SSR的32.49%、47.91%和16.18%;其他3種重復類型所占比例相對較少，只占總SSR的3.42%。苦茶轉錄組SSR重復單元的重復次數(shù)分布在5～46，其中5～10次重復的SSR位點有13625個，占位點總數(shù)的64.56%;11～20次重復的SSR位點有7299個，占總數(shù)的34.58%;20次重復以上的SSR位點有0.86%。

　　3討論與結論

　　目前，PacBio-Iso-Seq測序手段已在多種植物中得到了廣泛的應用，該方法相比于二代測序具有讀長長、無需組裝轉錄組就可以直接獲得全長轉錄本、更準確地檢測結構變異和適合于具有高重復序列和高雜合性的物種的轉錄組分析等優(yōu)勢[11-13]。本試驗利用Iso-Seq技術，結合生物信息學分析，獲得了苦茶全長轉錄組數(shù)據(jù)。

　　本研究共得到8730808個Subreads，平均Subreads的長度為1145bp，N50為1741，可以看出全長轉錄組測序讀長長且連續(xù)性較高。全長非嵌合(FLNC)reads有217701個，通過對FLNC-reads的聚類及校正分析，最終獲得pol-ishedconsensus序列132334個。龐丹丹等[17]對不同葉色的6份茶樹材料進行二代測序，共獲得112233個Unigene，平均長度為759bp，N50為1081bp。

　　Li等[18]采用RNA-seq對龍井43的根、莖、4個不同嫩度的葉片及花蕾和果實等13個組織進行測序分析，共獲得347827條Unigene(>200bp)，平均長度為791.2bp，N50為1342bp。上述結果表明在獲得的序列質量和基因數(shù)等方面，三代測序結果均優(yōu)于二代測序。苦茶的全長轉錄組測序在很大程度上補充了現(xiàn)有茶樹基因資源，并為發(fā)現(xiàn)新的或以前未被識別的蛋白質的編碼基因和轉錄亞型提供了優(yōu)勢。

　　與茶樹參考基因組比對，分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)PacBio轉錄本是已知基因的新亞型(59.32%)，有16.12%的轉錄本為7115個新基因提供了證據(jù)。分析表明，新的轉錄組數(shù)據(jù)對探究苦茶的注釋具有巨大的潛力。Unmapped轉錄本在NR數(shù)據(jù)庫中的比對結果顯示，共比對上311個物種，比對到最多的物種仍是茶樹，其次是葡萄，這表明比對所用到的參考基因組可能還需進一步完善。

　　比較KEGG(10976+5626)、KOG(6296+1896)、GO(6221+575)3大數(shù)據(jù)庫功能統(tǒng)計情況，發(fā)現(xiàn)注釋到KEGG的轉錄本數(shù)最多(括號內數(shù)值為未比對到基因組的轉錄本和新轉錄本數(shù)量，下同)，這些轉錄本中包含多個轉錄本與茶葉品質和苦茶特征性狀形成相關的代謝途徑，如苦茶堿等嘌呤生物堿代謝(74+17)、氨基酸代謝(409+69)、苯丙烷生物合成(70+18)和萜類物質的生物合成(152+31)等。Wang等[19]對3個苦茶品種進行轉錄組測序，通過與嘌呤生物堿代謝的KEGG通路富集分析，篩選出一批與苦茶堿和咖啡堿生物合成相關的關鍵基因。同樣，本研究新注釋到的一些轉錄本亦能夠為后期對苦茶性狀形成的研究提供基因資源。

　　可變剪切(AlternativeSplicing，AS)，即某些基因的一個mRNA前體以不同的剪接方式，形成不同的mRNA異構體[20];其能夠調控基因的表達水平和促進蛋白質組的多樣性，在植物生長、發(fā)育和脅迫響應中發(fā)揮著關鍵作用[21-23]。選擇性剪接的亞型具有基于組織或時間的優(yōu)先表達特征，并且它們也受環(huán)境條件的影響[24]。在茶樹中，研究發(fā)現(xiàn)可變剪切亞型在高溫、干旱、低溫等不同環(huán)境脅迫條件下的表達模式存在明顯差異[25-26]，同時可變剪切事件還參與了黃酮、類黃酮和花青素等重要物質的次生代謝過程中[24，27-28]。

　　因此，對基因結構進行分析，發(fā)現(xiàn)4892個基因發(fā)生了選擇性剪接，其中內含子滯留事件占比最大，這為進一步研究可變剪切在苦茶特異成分代謝中的作用奠定了基礎。以往的研究表明，轉錄因子(TF)參與植物多種生長代謝過程中。在茶樹中，發(fā)現(xiàn)它們不僅參與葉片花等器官的發(fā)育[29-30]，以及脅迫反應[31]，還參與兒茶素[17]、茶氨酸[32]和花青素[33-34]等多種次生代謝過程。

　　本研究還預測得到1918個TF，在獲得的TF家族中，bHLH家族有96個、C3H家族有80個、bZIP家族有70個、MYB-re-lated家族有66個、C2H2家族有66個、MYB家族有57個。這些轉錄因子的預測與分析，為之后研究苦茶特異性狀(苦茶堿[3-4]、丁子香酚甙[2]和高EGC[9]等)相關基因表達以及詳細的基因家族分析提供數(shù)據(jù)。此外，本研究還預測得到778個LncRNA，它們可能在茶樹次生代謝的調控中起著特殊的作用。本研究為苦茶品質和特異性狀形成機制的研究提供了基礎數(shù)據(jù)，上述結果將有助于進一步開展苦茶特異性狀相關基因標記的開發(fā)、并為其形成的機理及遺傳機制的研究奠定基礎。

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　　作者：龐丹丹1，2，劉玉飛1，2，孫云南1，2，田易萍1，2，宋維希1，2，陳林波1，2