摘要：茶樹為山茶屬多年生常綠木本植物，內(nèi)含茶葉多酚類物質(zhì)具有廣泛的應用。然而在茶樹組織培養(yǎng)過程中，褐化是一個棘手的問題，阻礙茶樹快繁體系的建立。為研究茶樹外植體褐化過程中的分子機制，以輕、重兩種不同褐化程度的茶樹外植體為研究材料，運用RNA-Seq技術(shù)對樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序和功能分析，共篩選出872個差異表達基因(DifferentiallyExpressedGenes，DEGs)，其中507個顯著上調(diào)，365個顯著下調(diào)。通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫，對DEGs進行功能注釋分析，顯示茶樹組培褐化過程中與衰老、酶氧化和脂膜代謝等過程密切相關(guān)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在872個DEGs中，2個酶褐化相關(guān)基因、2個細胞色素P450轉(zhuǎn)錄因子和2個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其表達水平在兩個樣本間顯著差異調(diào)控。因此，本研究發(fā)現(xiàn)了茶樹葉片在組培過程中與酶促褐化相關(guān)的潛在基因，為解析茶樹組織培養(yǎng)褐化過程的分子調(diào)控提供了理論依據(jù)。

　　關(guān)鍵字：茶樹(Camelliasinensis(L.)O.Ktze.);褐化;轉(zhuǎn)錄組測序;組培

　　茶樹(Camelliasinensis(L.)O.Ktze.)為山茶屬多年生常綠木本植物，內(nèi)含茶多酚、氨基酸、咖啡堿等多種對人體有益的物質(zhì)，具有降脂減肥(袁野等,2016)、抗氧化(郭金龍,2010)、助消化和調(diào)理腸胃(屠幼英等,2002;呂曉華等,2017;李解等,2015)等功效，是世界三大無酒精飲料之一。近年來，隨著國家鄉(xiāng)村振興和扶貧產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，茶葉產(chǎn)業(yè)得到穩(wěn)步提升，茶樹新品種在茶葉加工、品質(zhì)形成過程中的作用與日俱增，產(chǎn)業(yè)對于優(yōu)良無性系茶苗的需求也更為迫切。茶樹組培快繁體系具有周期短、繁殖系數(shù)高、易繼承親本的優(yōu)良性狀等優(yōu)勢，但茶樹內(nèi)含較高的多酚類物質(zhì)，褐化現(xiàn)象嚴重，成為茶樹快繁體系的瓶頸。

　　目前，研究者通過篩選植物生長調(diào)節(jié)劑(邱璐等,2000)，運用各類抗氧化劑和吸附劑(黃燕芬等,2009)，改善茶樹組培過程中的培養(yǎng)方式和培養(yǎng)環(huán)境(鄔秀宏等,2012)等技術(shù)手段能夠降低和延緩褐化影響，但褐化損傷的分子機尚不清楚，問題也未得到實質(zhì)性解決。隨著Illumina測序技術(shù)的快速發(fā)展，國內(nèi)外研究者開展了關(guān)于植物褐化分子調(diào)控機理的研究，Gao等(2020)在牡丹組織培養(yǎng)愈傷組織褐變的遺傳調(diào)控研究中發(fā)現(xiàn)，包括MYB、bHLH和WRKY在內(nèi)的6個轉(zhuǎn)錄因子以及包括PsCYP71A、PsI2ʹH、PsSTH-21、PsUGT和PsGST在內(nèi)的其他基因可能參與調(diào)節(jié)牡丹愈傷組織褐變。

　　Zhou等(2020)通過對低溫貯藏過程中褐變的“旺角”梨核進行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出5121個DEGs(DifferentiallyExpressedGenes)，并進行功能注釋，鑒定出一些參與氧化還原反應、膜脂代謝和酶褐變的褐變相關(guān)DEGs。本研究利用Illumina測序技術(shù)對輕、重兩種不同褐化程度的茶樹葉片外植體進行研究重兩種不同褐化程度的茶樹葉片外植體進行研究，篩選影響茶樹外植體褐化的相關(guān)基因進行表達分析和功能鑒定，以期發(fā)掘茶樹葉片在組培過程中與褐化相關(guān)的潛在基因，為解析茶樹組織培養(yǎng)褐化過程的分子調(diào)控提供了理論依據(jù)。

　　1結(jié)果與分析

　　1.1測序數(shù)據(jù)質(zhì)控和參考基因比對結(jié)果

　　通過對不同程度褐化的茶樹葉片進行轉(zhuǎn)錄組高通量測序獲得Rawreads，經(jīng)過Rawreads數(shù)據(jù)過濾，獲得Cleanreads和數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果。輕度褐化組(LightBrowning，LB)和重度褐化組(HeavyBrowning，HB)分別獲得46864566、45008534條Cleanreads，樣品Q20、Q30值均分別高于97%、93%，且與參考基因組對比率達到89%以上，其中與基因組外顯子區(qū)域的reads數(shù)對比率高于60%，表明此次轉(zhuǎn)錄組測序錯誤率低、整體測序質(zhì)量高、與參考基因組比對覆蓋率高，可以進行下一步分析。

　　1.2差異基因分析

　　以|log2(FoldChange)|>0&padj<0.05為差異基因篩選標準，通過對不同程度褐化樣品的DEGs進行篩選，統(tǒng)計篩選所得的DEGs數(shù)量，檢測所得差異表達基因為872個，其中上調(diào)表達的有507個，下調(diào)表達的有365個。表明茶樹組培葉片在褐化程度不斷加深的過程中，組培葉片的部分調(diào)控機制伴隨發(fā)生改變。

　　1.3差異基因的GO功能富集分析

　　對DEGs進行GO功能注釋，872個差異基因中被富集在620個GO功能類別，選取主要富集的30個GO功能條目，其中，屬于生物過程的主要有光合作用(Photosynthesis)、氧化應激反應(Responsetooxidativestress)、小分子分解代謝過程(Smallmoleculecatabolicprocess)、細胞碳水化合物代謝過程(Cellularcarbohydratemetabolicprocess)以及多元醇等多個分解代謝過程(Catabolicprocess)。

　　屬于細胞組成的主要有光系統(tǒng)(Photosystem)、光合膜(Photosyntheticmembrane)、類囊體(Thylakoid)、光系統(tǒng)I(PhotosystemI)、光系統(tǒng)II(PhotosystemII)，且差異基因均為下調(diào)表達;屬于分子功能的主要有輔因子結(jié)合(Cofactorbinding)、血紅素結(jié)合(Hemebinding)、輔酶結(jié)合(Coenzymebinding)、氧化還原酶活性(Oxidoreductaseactivity,)、抗氧化活性(Antioxidantactivity)、水解酶活性(Hydrolaseactivity)。

　　1.4差異基因的KEGG富集分析

　　通過對872個DEGs進行KEGGPathway富集分析，發(fā)現(xiàn)共有116個差異基因被注釋到74個通路中，DEGs注釋率為13.3%。其中主要富集下調(diào)表達的有光合作用(Photosynthesis)10個基因、光合作用-觸角蛋白(Photosynthesis-antennaproteins)6個基因，上調(diào)表達的有類黃酮生物合成(Flavonoidbiosynthesis)8個基因、苯丙素生物合成(Phenylpropanoidbiosynthesis)11個基因、二萜類生物合成(Diterpenoidbiosynthesis)3個基因、酪氨酸代謝(Tyrosinemetabolism)3個基因、苯丙氨酸代謝(Phenylalaninemetabolism)2個基因。

　　2討論

　　基因表達具有時間特異性，茶樹葉片組織培養(yǎng)過程中，不同程度褐化條件下，存在表達水平顯著差異的基因或轉(zhuǎn)錄本。本研究基于高通量測序技術(shù)，對褐化程度輕、重的茶樹組培葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過生物信息學分析，篩選所得差異表達基因為872個，其中上調(diào)表達的有507個，下調(diào)表達的有365個，這些基因大多數(shù)參與生物過程，如代謝、細胞過程和生物過程，其中多數(shù)具有催化活性和結(jié)合功能。

　　KEGG通路分析表明，注釋基因主要參與光合作用、類黃酮生物合成、苯丙素生物合成、二萜類生物合成、酪氨酸代謝、苯丙氨酸代謝。以上結(jié)果表明，在組培葉片褐化過程中存在氧化還原狀態(tài)、脂膜穩(wěn)定性和底物組成的一些變化，這些結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致，即植物褐化與許多過程相關(guān)，包括衰老、酶氧化和脂膜代謝等過程(Dongetal.,2015;Francketal.,2006;Linetal.,2016)。苯丙烷代謝途徑中的酚類合成受幾種關(guān)鍵酶的調(diào)控，包括PAL(Phenylalanineammonia-lyase)、CHS(Chalconesynthase)和CHI(Chalconeisomerase)，是植物體內(nèi)多酚和黃酮類化合物形成的重要開關(guān)，當新鮮切割的植物組織暴露于外界空氣中時，會導致組織褐變(Alegriaetal.,2016;Suehiroetal.,2014)。

　　茶樹中苯酚和醛的合成也始于苯丙烷途徑衍生的苯丙烷，由苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為查爾酮和一系列酶催化共同完成，本研究在872個差異基因中，對組培葉片褐化可能相關(guān)的幾種關(guān)鍵酶PPO(Polyphenoloxidase)、PAL(Phenylalanineammonia-lyase)(李南羿等,2009)和Tyrosinase(Wichersetal.,2003)相關(guān)基因進行了分析，結(jié)果顯示PPO等基因表達量在褐化程度輕、重的2個樣品中未呈現(xiàn)與前人研究結(jié)果相似的趨勢。

　　但實驗中我們檢測到苯丙氨酸代謝中AMP-binding(TEA034012)、酪氨酸代謝中ADH_N(TEA007219)2個酶相關(guān)基因表達活性與褐化程度具有明顯的關(guān)聯(lián)性，二者在茶樹組培褐化過程中基因的上調(diào)高表達與褐化程度呈正相關(guān)規(guī)律。細胞色素P450在植物體內(nèi)黃酮生物合成中起著重要作用。有研究表明，細胞色素P450相關(guān)基因表達量與植物組織褐變呈正相關(guān)規(guī)律，研究者分別在荷花與蝴蝶蘭實驗中發(fā)現(xiàn)，細胞色素P450的高表達會導致荷花組織和蝴蝶蘭外植體的褐化(Wangetal.,2013;Xuetal.,2015)。

　　本研究中，發(fā)現(xiàn)2個細胞色素P450轉(zhuǎn)錄因子基因(TEA033874、TEA030439)與茶樹組培葉片褐化相關(guān)，且均表現(xiàn)為基因高表達與組織褐化程度加深的規(guī)律，這與前人的研究結(jié)果保持一致。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是增加活性氧途徑中相關(guān)植物基因在生物、非生物和氧化應激反應中表達的重要誘導因子(Eulgemetal.,2007;Eulgemetal.,2000)。Zhang等(2019)在綠色核桃殼褐變研究中發(fā)現(xiàn)，一個含有保守WRKY結(jié)構(gòu)域以及C2H2型鋅指的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因在褐變綠色核桃殼中顯著表達，證實了WRKY轉(zhuǎn)錄因子與植物組織褐變的相關(guān)性。

　　與前人的研究相互印證，本研究中我們發(fā)現(xiàn)2個WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因(TEA027312、TEA023720)上調(diào)高表達與組織葉片褐化程度表現(xiàn)為正相關(guān)規(guī)律，首次揭示了WRKY轉(zhuǎn)錄因子與茶樹組培褐化程度的相關(guān)性。而針對候選基因與茶樹組培的褐化程度有因果關(guān)系，還需后續(xù)對基因的結(jié)構(gòu)和功能表征研究來進一步證實。本研究比較了不同褐化程度茶樹組培之間的轉(zhuǎn)錄組，共篩選出872個差異表達基因，其中顯著上調(diào)507個，顯著下調(diào)365個。通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫，對差異基因進行功能注釋分析，顯示茶樹組培褐化過程中與衰老、酶氧化和脂膜代謝等過程相關(guān)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在872個差異基因中，2個酶褐化相關(guān)基因、2個細胞色素P450轉(zhuǎn)錄因子和2個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其表達水平在兩個樣本間顯著差異調(diào)控。本研究為解析茶樹組織培養(yǎng)褐化過程的分子調(diào)控提供了理論依據(jù)。

　　茶葉種植論文范例：唐代長江流域的茶葉種植與飲茶習俗

　　3材料與方法

　　3.1試驗材料

　　選取重慶市農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所茶樹資源圃(105º89’20’’E，29º38’04’’N)栽種的福鼎大白茶為供試材料，以當年生健康無病蟲害的同株茶樹葉片作為外植體，經(jīng)MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得茶樹葉片組培褐化材料。以褐化面積小于葉片面積1/3的樣本作為輕度褐化組選擇不同程度褐化茶樹葉片作為輕度褐化組(LightBrowning，LB)，以褐化面積大于葉片面積2/3的樣本作為重度褐化組(HeavyBrowningBrowning，HB)，液氮速凍，保存于-80℃冰箱中，用于后續(xù)做轉(zhuǎn)錄組測序分析，為了排除誤差干擾，樣品設置3個生物學重復，每個重復包含4-5個組培葉片。

　　參考文獻：

　　AlegriaC.,GoncalvesE.M.,Moldao-MartinsM.,Cisneros-ZevallosL.,andAbreuM.,2016,Peelremovalimprovesqualitywithoutantioxidantloss,throughwound-inducedphenolicbiosynthesisinshreddedcarrot,PostharvestBiology&Technology,120:232-239

　　DongY.,LiuL.Q.,ZhaoZ.,ZhiH.H.,andGuanJ.F.,2015,Effectsof1-mcponreactiveoxygenspecies,polyphenoloxidaseactivity,andcellularultra-structureofcoretissuein'yali'pear(pyrusbretschneiderirehd.)duringstorage,HorticultureEnvironment&Biotechnology,56(2),:207-215

　　EulgemT.,andSomssichI.E.,2007,NetworksofWRKYtranscriptionfactorsindefensesignaling,Curr.opin.plantBiol,10(4):366-371

　　EulgemT.,RushtonP.J.,RobatzekS.,andSomssichI.E.,2000,TheWRKYsuperfamilyofplanttranscriptionfactors,TrendsinPlantence,5(5):199-206

　　作者：李解1,2翟秀明1,2楊娟1,2唐敏1,2*侯渝嘉1,2*