摘要：017年11月(秋季)，在遼寧省大連市青堆子海域(N39.78°，E123.32°)的自然納潮、微孔曝氣和養(yǎng)水機(jī)調(diào)水種管理方式的矩形海參(Apostichopusjaponicus)養(yǎng)殖池塘中，按照《國家海洋調(diào)查規(guī)范》(GB/T12763)規(guī)定的方法采集水樣和泥樣，用高通量測(cè)序技術(shù)研究了秋季不同水質(zhì)調(diào)控方式下刺參養(yǎng)殖池塘水體和底泥中菌群群落結(jié)構(gòu)特征。試驗(yàn)池塘面積為5.1ha，南深北淺，泥沙池底，實(shí)驗(yàn)期間各池塘不投餌和藥。結(jié)果顯示：三種池塘的底泥菌群多樣性要高于水體中;養(yǎng)水機(jī)池塘水體中的菌群多樣性高于其他兩種池塘，微孔曝氣池塘底泥中菌群多樣性最高。水樣和泥樣中第一優(yōu)勢(shì)菌門都是變形菌門(Proteobacteria);次優(yōu)勢(shì)菌門有所不同，養(yǎng)水機(jī)、微孔曝氣和自然納潮池塘中，水樣和泥樣分別為：厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和綠灣菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。三種池塘內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群群落構(gòu)成相同，但其各自門、綱和屬的相對(duì)豐度有所不同。本結(jié)果為選擇刺參養(yǎng)殖池塘的水質(zhì)管理方式提供了一定理論依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞：刺參;管理方式;高通量測(cè)序;菌群結(jié)構(gòu)

　　刺參(Apostichopusjaponicus)營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，已經(jīng)成為遼寧和山東等地的重要養(yǎng)殖對(duì)象之一[13]。2018年全國海參產(chǎn)量約1.74萬，養(yǎng)殖面積達(dá)到2.38萬ha[4]。刺參多以池塘養(yǎng)殖為主。為打破制約刺參養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸，近年來大力推廣微孔曝氣裝置，輔助調(diào)控水質(zhì)取得了很好的效果。如快速增氧和去除底泥中有機(jī)質(zhì)等，但在使用過程中存在易堵塞和維護(hù)費(fèi)用高的缺點(diǎn)[56]。本研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)了養(yǎng)水機(jī)輔助水質(zhì)調(diào)控設(shè)備，在實(shí)際調(diào)控水質(zhì)中較于前兩種方式具一定優(yōu)勢(shì)[79]。

　　在生產(chǎn)中，可通過換水和水質(zhì)調(diào)控設(shè)備輔助保持較好養(yǎng)殖水質(zhì)，但環(huán)境中微生物在養(yǎng)殖池塘中物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)、改善水質(zhì)環(huán)境以及刺參健康中起到了關(guān)鍵作用[10]。如假交替單胞菌Pseudoalteromonasnigrifaciens、假單胞菌Pseudoalteromonas和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)等都可使刺參患病[1113]。而枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和乳酸菌(Lacticacidbacteria,LAB)等，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境水質(zhì)的改善、提高養(yǎng)殖生物的非特異性免疫酶活性以及促進(jìn)養(yǎng)殖生物生長等都有明顯的作用[1416]。秋季是刺參重要的生長期，養(yǎng)殖環(huán)境的變化會(huì)對(duì)刺參的生長有一定的影響。

　　因此，對(duì)秋季刺參養(yǎng)殖池塘環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)的研究具有重要的意義。 傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法存在一定局限性，無法滿足細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究的需要[1718]。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展，是研究環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)的重要手段[1920]。目前對(duì)刺參池塘養(yǎng)殖中菌群結(jié)構(gòu)的研究，多利用DGGE指紋圖譜技術(shù)[2122]，其存在反應(yīng)優(yōu)勢(shì)菌信息少和操作繁瑣等問題。而利用16SrDNA高通量技術(shù)研究刺參養(yǎng)殖池塘的菌群結(jié)構(gòu)，則應(yīng)用優(yōu)勢(shì)明顯[10]。所以本研究利用該技術(shù)研究了自然納潮、微孔曝氣和養(yǎng)水機(jī)種水質(zhì)管理方式下，參池環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)，為參池管理方式的選擇提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　試驗(yàn)在大連市青堆子海域(N39.78°,E123.32°)的自然納潮、微孔曝氣和養(yǎng)水機(jī)池塘種海參養(yǎng)殖池中進(jìn)行。試驗(yàn)池均為矩形，面積都為5.1ha，池塘內(nèi)南深北淺，泥沙池底。實(shí)驗(yàn)期間各池塘不投餌和藥，統(tǒng)一管理。養(yǎng)水機(jī)是本研究團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的新型水質(zhì)調(diào)控裝置(專利號(hào)：ZL200610077526.5)見圖。其工作原理是通過進(jìn)水管道把池塘表層溶氧量相對(duì)較高的水引入到底層動(dòng)力泵，通過動(dòng)力泵把表層高溶氧量的水射入底層水體中，實(shí)現(xiàn)表底層水體強(qiáng)制交換，使得養(yǎng)殖池塘水體的流動(dòng)加快，并增加底層水體的溶氧量。

　　此外，水體的強(qiáng)制交換過程有利于養(yǎng)殖池塘水體表底層的混合均勻，對(duì)于養(yǎng)殖池塘水體會(huì)出現(xiàn)的溫度和鹽度的分層具有一定的破壞作用，可以降低因水體分層造成養(yǎng)殖池塘底層水體缺氧現(xiàn)象的發(fā)生。養(yǎng)水機(jī)位于池塘進(jìn)水口最低處，水泵功率750W，噴頭出水量為12m/h，每天21:00—次日9:00工作12h。微孔曝氣主要由供氣裝置、氣體傳輸管道和微孔曝氣管三部分組成。其工作原理是將空氣壓縮后通過安裝在池底的曝氣管，以微氣泡的形式向水中擴(kuò)散。微孔曝氣設(shè)備在池塘水體缺氧時(shí)開啟，如陰雨天和夏季高溫期適當(dāng)增加開機(jī)時(shí)間。

　　1.2方法

　　1.2.1樣品采集2017年11月按照《國家海洋調(diào)查規(guī)范》(GB/T12763)的方法采集三種實(shí)驗(yàn)池塘水樣和泥樣，樣品標(biāo)記信息見表。樣品立即放入80℃液氮冷凍后，再用干冰冷凍運(yùn)送到北京諾禾致源科技股份有限公司測(cè)定。具體的樣品采集步驟見參考文獻(xiàn)郭超等23]。每個(gè)樣品采集點(diǎn)采集兩個(gè)平行樣品。

　　1.2.2樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序用CTAB法提取樣本DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA，確保取得樣品DNA的完整性。條帶清晰完整無拖尾則視為采集的樣品質(zhì)量合格。使用NanoPhotometer®ClassicLaunched(IMPLEN,GER)測(cè)定其純度，提取成功樣品的DNA保存于20℃下備用。應(yīng)用含有Illumina接頭和barcode序列的引物341F806R(MichelsenCF)，擴(kuò)增樣品中DNA的16SrRNA基因的V3~V4可變區(qū)。最后應(yīng)用IlluminaMiseq測(cè)序平臺(tái)完成序列測(cè)序。

　　1.2.3數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析首先，處理獲得的原始序列，保留有效序列。接著使用FLASH和QIIME[2425]軟件將序列拼接為tags，然后對(duì)tags進(jìn)行聚類。根據(jù)Greengenes數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類學(xué)注釋。最后，計(jì)算各個(gè)樣品的細(xì)菌群落相對(duì)豐度。應(yīng)用PAST軟件[24]計(jì)算個(gè)樣品中的細(xì)菌群落的α多樣性。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1細(xì)菌群落分類學(xué)注釋

　　個(gè)樣品中總tags平均值為81111，可分類的tags平均值為70794，無法分類的tags平均值為，非沉余tags平均值為10315，運(yùn)算分類單元平均值為926。在養(yǎng)水機(jī)池塘水體和底泥中分別檢測(cè)出47個(gè)門、100個(gè)綱、448個(gè)屬和56個(gè)門、107個(gè)綱、362個(gè)屬的細(xì)菌。微孔曝氣池塘水體和底泥中分別檢測(cè)出44個(gè)門、127個(gè)綱、386個(gè)屬和60個(gè)門、128個(gè)綱、450個(gè)屬的細(xì)菌。自然納潮池塘水體和底泥中分別檢測(cè)出44個(gè)門、98個(gè)綱、398個(gè)屬和55個(gè)門、107個(gè)綱、440個(gè)屬的細(xì)菌。

　　2.2細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

　　在門水平上，三種池塘個(gè)樣品中相對(duì)豐富度占比前10的門分別為：變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinocteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)。

　　其占比為92.96~99.05%。三種池塘底泥和水體中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門都是變形菌門，相對(duì)豐富度占55.86%70.86。在綱水平上，個(gè)樣品中相對(duì)豐富度占比前10的綱占比67.22~92.76%。三種池塘底泥和水體中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門都是變形菌門，相對(duì)豐富度占比55.86~70.86。在水樣中三種池塘的Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria都是占比前兩位的優(yōu)勢(shì)菌綱，相對(duì)豐度占比42.13~63.45%。

　　三種池塘的底泥樣品中Gammaproteobacteria和Deltaproteobacteria都是占比前兩位的優(yōu)勢(shì)菌綱，相對(duì)豐度占38.54~50.56%。在屬水平上，個(gè)樣品中相對(duì)豐富度占比前30的屬占比15.16%~47.04%。在個(gè)樣品中各自的第一優(yōu)勢(shì)菌屬有所不同，養(yǎng)水機(jī)池塘水樣中未確(unidentified)的Chloroplast(相對(duì)豐度為7.37%)，微孔曝氣和自然納潮池塘是Lentibacter(相對(duì)豐度為13.17%和7.70%)。養(yǎng)水機(jī)池塘底泥樣品中是Desulfobulbus(相對(duì)豐度分別為1.94%)，微孔曝氣和自然納潮池塘是Sulfurovum(相對(duì)豐度分別為5.84%和4.88%)。

　　2.3菌群多樣性

　　2.3.1α-多樣性分析個(gè)樣品的文庫覆蓋率均大于0.970，說明本試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有較高的可信度。三種不同池塘底泥和水體樣本細(xì)菌群落的α多樣性指數(shù)值見表。由表可知，養(yǎng)水機(jī)池塘水樣中Chao、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)最高。微孔曝氣池塘水樣的Chao、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)最低。

　　養(yǎng)水機(jī)池塘泥樣中Chao和ACE指數(shù)最低。自然納潮池塘的Shannon指數(shù)最低。微孔曝氣池塘的Chao、ACE和Shannon指數(shù)都最高，而Simpson指數(shù)最低。三種池塘的Simpson指數(shù)一致。 隨著隨機(jī)抽取的序列總數(shù)的增加，Chao1、observedspecies和Shannon曲線圖，各個(gè)樣品的三種曲線到達(dá)60000這個(gè)臨界值時(shí)都趨于平緩，表示測(cè)序結(jié)果已經(jīng)可以反映當(dāng)前樣品所包含的多樣性。繼續(xù)增加測(cè)序深度已不能檢測(cè)到數(shù)量較多且尚未發(fā)現(xiàn)的新類型OUT。

　　3討論

　　3.1不同水質(zhì)調(diào)控方式下參池環(huán)境中菌群多樣性

　　Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)可用于評(píng)價(jià)細(xì)菌群落多樣性、物種豐富度和均勻度。根據(jù)保險(xiǎn)假說(Insurancehypothesis)，高生物多樣性有利于提高生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[27]。表中三種池塘的Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)都是底泥中高于水中，這與閆法軍等[28]和Zhao等[29]的研究結(jié)果一致。這是因?yàn)楹Ｑ蟪练e物表層環(huán)境微生物量約占到海洋微生物總量的70%[30]。

　　三種池塘水環(huán)境中，養(yǎng)水機(jī)池塘的Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)均最高，微孔曝氣池塘最低。這是因?yàn)轲B(yǎng)水機(jī)池塘長時(shí)間的水體循環(huán)，使得池塘內(nèi)各水層間的浮游植物量和菌群分布相較于其它兩個(gè)池塘更為均勻[31,32]。浮游植物光合作用產(chǎn)生的有機(jī)質(zhì)會(huì)促進(jìn)細(xì)菌的大量繁殖[31]。其次，養(yǎng)水機(jī)長時(shí)間的工作使水體擾動(dòng)，底泥中的細(xì)菌隨著再懸浮顆粒進(jìn)入水體。養(yǎng)水機(jī)池塘水中樣品離底泥樣品比其它兩種池塘更近，可能與這個(gè)原因有關(guān)。

　　雖然，微孔曝氣池塘同樣會(huì)造成水體擾動(dòng)，但其在實(shí)際生產(chǎn)使用主要是為了快速給池塘增氧，開機(jī)時(shí)間相對(duì)較短，不會(huì)產(chǎn)生像養(yǎng)水機(jī)池塘那樣明顯的效果。高溶氧量會(huì)抑制厭氧細(xì)菌[10]。但三種池塘底泥中的結(jié)果反之。有研究表明，有機(jī)物含量對(duì)環(huán)境中菌群的多樣性和豐度有正相關(guān)關(guān)系[30,3436]。因此，養(yǎng)水機(jī)池塘水環(huán)境中菌群多樣性最高。這對(duì)于水體較淺易受外界環(huán)境影響的刺參池塘，有利于養(yǎng)殖水體環(huán)境的穩(wěn)定，可以一定程度抑制病原菌的大量繁殖，有利于刺參的存活。

　　3.2不同水質(zhì)調(diào)控方式參池環(huán)境中菌群特征

　　近年來，對(duì)刺參池塘環(huán)境中菌群群落組成已有報(bào)道。譚八梅等[37]、丁斯予等[38]和Zhao等[29]研究發(fā)現(xiàn)，秋季刺養(yǎng)殖池塘水體和底泥中，第一和第二優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門和擬桿菌門，前者為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門。這與本研究的種刺參養(yǎng)殖池塘的水體和底泥中菌群組成結(jié)果相似，其中，三種池塘的第一優(yōu)勢(shì)菌門一致，為變形菌門(相對(duì)豐度為55.86%以上)。在刺參養(yǎng)水機(jī)池塘水體的第二優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門，其他兩種池塘都為擬桿菌門。這可能是因?yàn)樗疁氐慕档褪沟灭B(yǎng)水機(jī)池塘水體中厚壁菌門相對(duì)豐度變大[36]。

　　微生物在分解底泥中有機(jī)質(zhì)時(shí)釋放熱量會(huì)使間隙水水溫升高.5℃[39,40]。夜間養(yǎng)水機(jī)設(shè)備工作時(shí)，將表層的低溫水與底層高溫水交換，使得池塘內(nèi)底層水體溫度加速下降。而芽孢桿菌綱內(nèi)的物種具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性[41]。因此養(yǎng)水機(jī)池塘內(nèi)第二優(yōu)勢(shì)菌門有別于其它兩種池塘。董春光等[14]發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門的枯草芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖水體中的NO和NO有一定的去除作用，提升養(yǎng)殖水質(zhì)的同時(shí)促進(jìn)了刺參的生長。養(yǎng)水機(jī)池塘水體環(huán)境在一定程度上要優(yōu)于其他兩種池塘。

　　在養(yǎng)水機(jī)、微孔曝氣和自然納潮種水質(zhì)調(diào)控方式下刺參養(yǎng)殖池塘底泥中，第二優(yōu)勢(shì)菌門分別為擬桿菌門、綠灣菌門和厚壁菌門。養(yǎng)水機(jī)池塘和微孔曝氣池塘與其他人的研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)樵黾铀�體溶氧量時(shí)對(duì)水體產(chǎn)生擾動(dòng)有關(guān)。姚麗平[42]研究發(fā)現(xiàn)，不同曝氣強(qiáng)度影響底泥中細(xì)菌結(jié)構(gòu)分布和其在物質(zhì)循環(huán)過程中的作用。如流速為0.247m/s、對(duì)應(yīng)溶氧為6.18mg/L、雷諾數(shù)為1311的曝氣條件下，以厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌群，且對(duì)硫酸鹽還原菌生長有促進(jìn)作用。

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　　自然納潮池塘厚壁菌門中的芽孢桿菌綱(Bacilli)和梭菌綱(Clostridia)為主要優(yōu)勢(shì)菌綱，其相對(duì)豐度分別為：7.07%和3.83%。孫永旭等[43]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧組花鱸(Lateolabraxmaculatus)腸道菌群變形菌門相對(duì)豐度顯著下降，而梭菌綱和擬桿菌綱明顯上升。自然納潮池塘相較于其他兩種池塘，細(xì)菌豐度變化趨勢(shì)與缺氧組花鱸腸道菌群豐度一致。說明自然納潮池塘的溶氧要低于其他兩種池塘。三種池塘中優(yōu)勢(shì)菌門、綱和屬是一致的，其差異主要表現(xiàn)在各優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度有所不同。這可能是養(yǎng)殖池塘內(nèi)環(huán)境不同所致[44,45]。說明刺參養(yǎng)殖池塘管理方式的不同，不能改變養(yǎng)殖環(huán)境中優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)，但可以改變優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度。

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　　作者：王玉龍，林青，孫亞慧，王文琳，張津源，周瑋