摘要：目的基于高通量測序獲得藥用資源植物密花香薷Elsholtziadensa葉綠體基因組序列，分析了葉綠體基因組結構及特征，為研究密花香薷資源分類及系統進化奠定了基礎。方法以密花香薷葉片為材料，利用改良的CTAB法提取DNA;采用二代測序技術IlluminaNovaSeq平臺對葉綠體基因組進行測序;以廣藿香葉綠體基因組為參考序列，進行序列組裝和矯正，得到完整葉綠體基因組序列;利用生物信息學方法分析密花香薷葉綠體基因組特征并進行系統發育分析。結果獲得密花香薷完整葉綠體基因組序列全長149095bp，GC含量37.92%，注釋到130個基因，其中包括85個蛋白質編碼基因，8個rRNA基因和37個tRNA基因;密花香薷葉綠體基因組中共檢測到28個散在重復序列，串聯重復序列共檢測到191個，單核苷酸重復序列最多，共114個;系統發育結果表明，密花香薷和其他唇形科植物聚合在一起形成一個分支結構，紫蘇屬植物和香薷屬植物親緣關系較近。結論建立了適于香薷屬植物葉綠體基因組測序及其特征分析的方法，豐富了唇形科植物遺傳資源，為密花香薷分子標記開發及唇形科屬種間系統發育分析研究提供了理論基礎。

　　關鍵詞：密花香薷;葉綠體;基因組;分子標記;系統發育

　　葉綠體是綠色植物特有細胞器，是細胞能量轉換和儲存的場所，遺傳方式以母系為主，所以在植物中具有種的特異性，其自身擁有一套完整的基因組，重組率低，后代遺傳穩定[1-2]。葉綠體基因組在被子植物中具有獨立的蛋白表達系統，大小介于1.20×105～1.80×105bp，一般為共價閉合的環狀結構，其結構由4部分組成：包含2個反向重復區(invertedrepeats，IRs)、大單拷貝區(largesinglecopy，LSC)和小單拷貝區(smallsinglecopy，SSC)4個部分[3]。

　　葉綠體基因組相比核基因組包含信息量較小，由于進化模式和分布區域的差異，不同類群物種間基因組有時會發生插入/缺失、重復、倒位、重排等多種類型的結構變異和基因丟失現象，但是，從組成結構、基因類型和數目及排列順序來看，葉綠體基因組較穩定，具有保守性，長度較小，易于測序，而且葉綠體基因組核苷酸進化速率較低，因此在植物不同分類階段的系統發育分析中具有廣發的應用，葉綠體基因組和其CDS基因片段變異分析常被用于分析物種種群遺傳結構分化及動態歷史發展規律[4-7]。

　　煙草NicotianatabacumL.[8]和地錢MarchantiapolymorphaL.[9]2個物種葉綠體基因組測序報道，是人類首次獲得綠色植物葉綠體基因組序列信息。二代測序技術的不斷完善和推廣，為植物葉綠體基因組相關研究提供了技術支持，為后續植物資源分類和鑒定、系統發育、譜系地理學、及野生植物資源利用和保護方面的研究提供了有效的途徑[10-12]。

　　密花香薷ElsholtziadensaBenth.在中國西北地區，如陜西、四川、云南、甘肅、青海、西藏等地廣泛分布，其外觀形態和紫蘇接近，所以又稱之為野紫蘇，屬唇形科(Labiatae)香薷屬ElsholtziaL.一年生草本植物，生境多樣化，農田、林緣、高山、草地邊緣、林下、河邊、荒地等海拔1800～4200m的范圍內均有分布[13-14]。經研究發現，密花香薷全草可入藥，具有發汗解暑、行水散濕、溫胃調中的功效，且據現代藥理研究，香薷類植物揮發油具有廣譜抗菌和殺菌作用，并有直接抑制流感病毒的作用[15-16]。密花香薷亦可作為蜜源，養蜂價值極高[17]。所以密花香薷具有重要的藥用和經濟價值。

　　目前，有關密花香薷生藥學或化學成分提取和分離相關研究較多[16,18-24]，蜜腺的解刨學結構研究比較古老[25]，但關于密花香薷資源分類、居群分布規律、生理特性，尤其是分子生物學方面的相關研究還無人涉及。本研究以分布在青藏高原的密花香薷為材料，使用二代測序技術獲得密花香薷葉綠體全基因組序列信息，利用生物信息學相關軟件，分析其葉綠體基因組構成和特征，不僅可豐富唇形科植物遺傳信息，也為后續密花香薷資源分類和鑒定、遺傳多樣性、種群歷史動態發展和香薷屬植物間的系統發育與親緣關系研究奠定了基礎。

　　1材料

　　用于本研究的密花香薷樣本，采于青海省共和縣青海湖二郎劍景區(N100.4911°，E36.5785°，海拔3194m)，采取生長狀況良好的幼嫩葉片，液氮冷存，帶回青海民族大學于−80℃冷凍保存，用于DNA提取。植物憑證樣本保存于青海民族大學生態環境與資源學院(FGE20197201)。

　　2方法

　　2.1全基因組DNA提取及測序

　　經典CTAB法用于樣品DNA提取，瓊脂糖凝膠電泳判斷樣本DNA的完整性，微量核酸測定儀(NanoDrop2000)檢測其質量和DNA含量。若樣品基因組DNA檢測結果符合實驗要求，對基因組DNA進行片段化處理，用到的方法一般為機械打斷法即超聲波法，下一步是對片段化DNA進行純化和末端修復，還需在3′端加A、連接測序接頭，對上述處理完的DNA片段需進行片段長度分選，最后進行PCR擴增構建測序文庫，對測序完成的文庫需進行質量檢測，質檢合格的文庫用IlluminaNovaSeq平臺進行測序，測序讀長為PE150。

　　為確保序列組裝過程中的準確性，必須對原始獲得的rawreads序列進行一系列處理，主要是去除測序時連接的接頭以及擴增時的引物序列;篩選出高質量的數據，保證數據質量(質量值Q≤5的堿基數占整個read的50%以上的reads)。通過前期處理和質量控制之后最終獲得高質量的cleandata。

　　使用bowtie2v2.2.4比對南京集思慧遠公司自建的葉綠體基因組數據庫，將比對上的測序序列當作樣品的葉綠體基因組測序序列(cpDNA序列)。組裝核心模塊采用SPAdesv3.10.1軟件組裝葉綠體基因組，組裝不依賴參考基因組。使用SPAdes軟件對上述cleanreads進行基因組拼接，將拼接結果與PogostemoncablinBenth.葉綠體基因組(MF287372.1)進行blast比對，基因組比對參考序列，查看基因組的保守與重排等共線性分析;基因組比對參考序列結構信息，比較兩者間的差異。

　　2.2葉綠體基因組注釋和基因分析

　　使用blastv2.2.25軟件比對NCBI數據庫的葉綠體基因組cds序列，手工校正后得到葉綠體基因組基因注釋結果。使用hmmerv3.1b2軟件比對NCBI數據庫葉綠體基因組rRNA序列，得到葉綠體基因組的rRNA注釋信息。使用aragornv1.2.38軟件對葉綠體基因組序列進行tRNA的預測，得到葉綠體基因組tRNA注釋信息。最后使用OGDRAW制作葉綠體基因組完整圖譜。利用CodonW1.4.2軟件對密花香薷葉綠體基因組密碼子偏好性(RSCU，relativesynonymouscodonusage)進行分析和統計。

　　2.3散在重復序列及cpSSR

　　分析葉綠體基因組中的重復序列根據不同的分布模式分為2種類型即散在重復序列和串聯重復序列，散在重復序列多是失活的轉座元件，在基因組中呈分散式分布，簡單重復序列(simplesequencerepeats，SSR)標記，是一類由幾個核苷酸(一般為1～6個)為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列。使用vmatchv2.3.0軟件鑒定散在重復序列。葉綠體基因組中含有不同重復類型的串聯重復序列，一般稱之為稱之為cpSSR。

　　使用MISAv1.0(MIcroSAtelliteidentificationtool)軟件進行cpSSR的分析，參數1-8(單堿基重復8次及以上)、2-5、3-3、4-3、5-3、6-3，2個SSR序列之間的最小距離設置為100bp。

　　2.4基于葉綠體基因組序列系統進化分析

　　搜索NCBI數據庫，選取已公開的唇形科，不同屬植物共18種[虎尾紫蘇Perillafrutescensvar.hirtellaMakinoetNemoto(KT220691.1)、檸檬紫蘇P.citriodoraNakai(KT220690.1)、P.setoyensisG.Honda(KT220692.1);海州香薷E.splendensNakaiexF.Maekawa(MH700782.1);OcimumtenuiflorumL.(NC043873.1)、羅勒O.basilicumL.(NC035143.1);丹參SalviamiltiorrhizaBge.(JX312195.1)、鼠尾草S.japonicaThunb.(NC035233);夏枯草PrunellavulgarisL.(NC039654.1);掌葉青蘭DracocephalumpalmatumC.Y.Wu(NC031874.1);留蘭香MenthaspicateL.(NC037247.1)、歐薄荷M.longifoliaL.(NC032054.1)、黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi(MF521633.1)、S.insignisNakai(NC028533.1);廣霍香P.cablinBenth.(MF287372.1);棉毛水蘇StachysbyzantinaC.KochNC029825.1)、林地水蘇S.sylvaticaL.(NC029824.1、紅花水蘇S.coccineaJacq.(NC029823.1)，下載其序列，以茄科的黑果枸杞LyciumruthenicumMurr.(NC039651.1)為外類群。

　　3結果與分析

　　3.1葉綠體基因組結構基本特征

　　密花香薷葉綠體基因組經測序，去掉低質量reads后得到cleanreads22864493個片段，Q20為96.91%，GC含量為39.64%[26]。GC含量也可反應葉綠體基因組組成特征，本研究檢測到密花香薷葉綠體基因組GC含量37.92%，遠低于AT含量(62.08%)，說明具有綠色植物葉綠體基因組普遍AT偏向性的特征[26]。

　　其中IR區序列包含有4個編碼rRNA的基因，所以GC含量(43.16%)明顯高于LSC區(35.96%)和SSC區(31.92%)[26]。使用SPAdes軟件進行基因組片段的拼接，拼接完成的序列與參考序列(accession：MF287372.1)比對，進行組裝完成后的質量檢控。最終得到密花香薷葉綠體基因組，全長149095bp，其結構與大多數被子植物相同，為環狀雙鏈分子，呈典型的四段式結構(圖1)。其中，LSC結構區長度為81497bp，SSC結構區長度為17364bp，2個反向互補重復區IR分別長25117bp[26]。

　　3.2基因注釋及歸類分析

　　密花香薷葉綠體基因組共檢測到129個基因，其中包括84個蛋白質編碼基因，8個rRNA基因和37個tRNA基因。其中有17個基因在IRs區重復，包含6個蛋白編碼基因(ndhB、rpl2、rpl23、rps12、rps7、ycf2)，4個rRNAs基因(rrn16、rrn23、rrn4.5、rrn5)7個tRNA基因(trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG、trnV-GAC);SSC區包括12個蛋白編碼基因，1個tRNA基因;LSC區包含60個蛋白編碼基因，22個tRNA基因。

　　密花香薷葉綠體基因組中大多數蛋白質編碼基因由1個外顯子組成，共有15個基因(atpF、ndhA、ndhB、petB、petD、rpl2、rpl16、rpoC1、trnA-UGC、trnG-UCC、trnH-GUG、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC)包含1個內含子，3個基因(rps12、clpP、ycf3)包含2個內含子。編碼基因根據其產物功能的不同分為以下幾種類型：(1)光合作用相關基因;(2)自身翻譯相關基因;(3)其他基因;(4)未知功能相關基因。

　　3.3葉綠體基因組密碼子偏好性分析

　　對密花香薷葉綠體密碼子研究發現，共檢測到26160個密碼子，其中編碼亮氨酸(Leu)的密碼子數量最多，有3397個，占總密碼子數的12.99%;編碼半胱氨酸Cys的最少，有299個，占總密碼子數的1.15%。相對同義密碼子(relativesynonymouscodonusage，RSCU)使用度最高的為AUG(2.9901)，最低的是CUG/GUG(0.0048)。32個密碼子RSCU值大于1.00，其中，29個密碼子堿基構成以A或U結尾，其余4個以G或C結尾。

　　3.4葉綠體基因組重復序列分析

　　28個散在重復序列在密花香薷葉綠體基因組中被檢測到。串聯重復序列共檢測到191個，單核苷酸重復序列最多，共114個，主要以A(51)和T(56)堿基重復為主，單核苷酸T重復序列最長，為14bp，單核苷酸串聯重復序列長度占總序列長度的0.6855%，3堿基串聯重復序列總數為55個，2堿基重復序列和4堿基重復序列最少為5個，復合型重復序列12個，串聯重復序列長度介于8～26bp，串聯序列總長度為1885bp，占葉綠體基因組序列總長度的1.2643%。

　　基因編碼區包含的SSR序列位點總數達84個和分布于基因間隔區(IGS)的SSR序列位點數相同，位于內含子區域(Intron)的為21個，其余2個分布于間隔區和基因編碼區。密花香薷SSRs位點在葉綠體基因組中分布不均勻，多態性較高，為后續SSR分子標記的開發提供了理論依據。

　　3.5基于葉綠體基因組的密花香薷系統發育分析

　　總共選取了唇形科10個屬，共18種植物葉綠體全基因組序列(括號內為物種數目)，紫蘇屬(3)、香薷屬(1)、羅勒屬(2)、鼠尾草屬(2)、夏枯草屬(1)、青蘭屬(1)、薄荷屬(2)、黃芩屬(2)、刺蕊草屬(1)、水蘇屬(3)，外類群1個，加上本研究所測密花香薷葉綠體基因組共20個種，構建了NJ系統發育樹。系統發育樹結果顯示，“密花香薷”與其他唇形科植物聚在一起形成一個大的分支。

　　19種唇形科植物形成2個大亞支，且分支支持率高(BP=100)，第I大亞支(BP=100)由2個分支構成，其中一個分支包含2個亞支，一個亞支由2個分支構成，紫蘇屬3個物種形成一個單獨分支聯合海州香薷和密花香薷形成1個分支，另一 分支由羅勒屬2個物種單獨構成;另一亞支由鼠尾草屬2個物種單獨形成的一個分支和夏枯草屬、青蘭屬和薄荷屬6個物種形成的另一分支構成。第II大亞支(BP=100)由黃芩屬2個物種單獨形成的一個分支和刺蕊草屬1個物種、水蘇屬3個物種聯合形成的另一姐妹分支構成。除密花香薷和海洲香薷Elsholtziasplendens外，同屬物種均匯聚在一起形成姐妹分支。

　　4討論

　　被子植物質體DNA通常為母系遺傳，因其在進化過程中不經歷基因重組，通過對其序列結構組成，特征及變異分析，可以很好地揭示物種系統發育過程[27]。尤其二代高通量測序技術的不斷優化，極大地提高了測序效率，降低了測序費用，使植物葉綠體基因組測序在許多物種遺傳研究中被頻繁使用。

　　有報道研究表明，葉綠體基因組結構為雙鏈環狀DNA分子結構，由4部分構成，包含LSC、SSC和2個IR，其中2個IR區序列相同，方向相反[8]。測序獲得的基因組長度介于1.20×105～1.80×105bp，檢測到的編碼基因數為100～130，蛋白編碼基因數最多為70～80，30～32種不同類型的tRNA編碼基因被檢測到，rRNA編碼基因數比較穩定，通常有4種[28]。

　　本研究所獲得密花香薷葉綠體基因組大小和結構與上述被子植物研究結果相符。香薷屬植物約有40余種，我國分布有33種，但是有關本屬葉綠體基因組測序的報道較少，目前只有2個物種被報道，一個是海州香薷，另一個是本研究所測得密花香薷，比較兩個物種葉綠體基因組組成和特征發現，各個區段組成及GC含量差異不大。密花香薷基因組GC含量為37.92%，海州香薷為37.8%[29]，葉綠體基因組的總體進化速度較慢，在同屬內植物表現出保守性。對測得的葉綠體基因組進行了基因功能注釋，共注釋到130個基因，檢測到了84個蛋白編碼基因，其中有4種rRNA基因被檢測到。密花香薷tRNAs基因數(37)與海州香薷(38)僅相差1個。

　　前人研究表明，不同植物所檢測到的tRNAs基因數變異較大，同一科內其tRNA基因數目存在較大差異，如殼斗科(Fagacea)植物葉綠體基因tRNA基因數目介于29～46[4]，五加科(Araliaceae)植物葉綠體基因組tRNA基因數目介于29～38[30]，但rRNA基因數目比較保守，如裸子植物臭柏JuniperussabinaAnt.[5]、惠水金橘CitruserythrosaHort.exTan.[31]、鹽樺BetulahalophilaChingexP.C.Li[32]、殼斗科(Fagacea)植物[4]等rRNA基因數目和類型相同，均為為4種(rrn4.5、rrn5、rrn16、rrn23)，分布在IRs區，先前報道的海州香薷和本研究檢測到的密花香薷rRNA基因數目和類型與上述研究相同。葉綠體基因組差異主要是由反向重復區的變異引起的，而IR在穩定葉綠體基因組結構和影響葉綠體基因組大小方面起著非常重要的作用[5]。

　　位于IRs的ycf1、ycf15、ycf68基因編碼區內有終止密碼子，所以被稱為假基因[33]，這幾個假基因在不同種之間表現出廣泛的變異性，密花香薷和海州香薷主要差異也分布在IRs區，本研究密花香薷未檢測到ycf15、ycf682個基因，但在海州香薷中被檢測到。密花香薷基因分布和很多被子植物研究結果一致，編碼基因主要分布在LSC區，大多數的基因只含有一個外顯子，單拷貝基因居多，17個基因在IRs區重復。

　　編碼蛋白和其他被子植物一樣，根據其功能主要分為3類，(1)光合作用相關基因;(2)自身翻譯相關基因;(3)其他基因;(4)未知功能相關基因[34]。唇形科(Lamiaceae)全球分布有245屬7500余種，被認為是被子植物的第6大科，其中包含許多常見的芳香族植物和藥用植物，具有巨大的經濟價值。葉綠體基因組因具有較強的穩定性和保守性，所以常被用于系統發育樹的構建。

　　Li等[35]基于葉綠體基因組對Harley等2004年提出的唇形科的分類進行了糾正，但是唇形科內部的許多種屬系統進化關系還需進一步得到解決。目前有關唇形科植物葉綠體全基因組測序報道較少，相關科及亞科內部系統進化關系構建主要利用葉綠體基因組內部的個別功能基因如Matk、rbcl、ndhF。

　　本研究以已測得的密花香薷葉綠體基因組聯合NCBI下載的18種唇形科植物葉綠體基因組序列構建了NJ進化樹，結果表明，該進化樹的分辨率較高，各節點也獲得了較高的支持率，唇形科內屬間呈現出較為明確的發育關系，同一屬內物種呈明顯的姐妹關系。

　　本研究所下載的18個物種序列中，除羅勒屬2個物種為羅勒亞科(Ocimoideae)外，其余均為野芝麻亞科(Lamioideae)，進化樹上并沒有將2個亞科明顯區分，羅勒屬2個物種和紫蘇屬及香薷屬聚合形成一個分支，表現出較近的親緣關系，但分支支持率較低(BP=75)。

　　沈立群[36]對唇形科藥用植物葉綠體基因組進行系統進化分析時發現，羅勒OcimumbasilicumL.和PerillasetoyensisL.(紫蘇屬植物)兩者之間呈姐妹關系，ML分析及MP分析給出的支持率均不高(LB=75，PB=75)，這一結論與本研究相同。香薷屬和紫蘇屬2個物種表現出較近的親緣關系，這一結果和已報道海州香薷葉綠體基因組系統進化關系分析一致。海州香薷和密花香薷雖為同一屬物種，但并未形成姐妹分支，可能是2個種形態和分布差異較大的原因。

　　本研究首次對密花香薷葉綠體基因組進行測序組裝，并對其基因結構、密碼子偏好性、SSRs數量及分布和基因功能等進行了分析，結合已公布的唇形科物種葉綠體基因組序列，構建了系統發育樹，闡明了密花香薷和唇形科內不同屬物種之間的系統發育關系，不僅豐富了唇形科植物的遺傳資源，也為從分子水平進行植物分類和深入了解植物進化和系統發育提供了有效的途徑，這對于密花香薷植物的分類和開發研究提供了理論依據。

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　　作者：富貴1,2,3，劉晶1，李軍喬1,2,3*