摘要：栽培大豆起源于我國黃淮海地區，我國具有悠久的大豆種植歷史和豐富的大豆遺傳資源。然而，近年來我國大豆進口依賴度極高，嚴重威脅到我國的糧食安全，因此培育高產優質的大豆品種至關重要。株高，籽粒大小等是影響大豆產量的重要農藝性狀，因此，挖掘調控這些農藝性狀的基因，及解析其分子機制具有重要意義。FRUITFULL(FUL)基因屬于MADS-box類轉錄因子，在植物的開花，生長發育，果實成熟等方面起著重要的作用。本研究通過生物信息學分析發現，在大豆中含有6個FUL基因，它們均具有一個保守的MADS-box和一個較為保守的K-box結構域，并主要在豆莢中表達，說明該基因家族可能能夠調控大豆種子相關性狀。其中，只有GmFUL3b基因在葉片中高度表達，說明該基因在進化過程中功能可能產生了分化。此外，還發現6個FUL之間的進化規律不同。為進一步確定其生物學功能，利用CRISPR/Cas9技術，分別構建6個FUL基因的敲除突變體載體，轉化大豆毛根進行靶點驗證，并成功鑒定出其中5個基因的有效靶點，為進一步獲得穩定的大豆突變體材料及解析GmFULs家族基因的功能提供了重要的理論基礎。

　　關鍵詞：大豆;FUL基因;生物信息學分析;CRISPR/Cas9技術

　　大豆(Glycinemax)是世界上重要的糧食兼經濟作物之一，也是人類主要的植物蛋白來源[1]。大豆具有非常高的營養價值[2]，例如，大豆蛋白中所含人體必需氨基酸的含量與肉類相近，同時大豆油脂中的人類必需脂肪酸也較為豐富。栽培大豆起源于我國黃淮海地區[3]，目前主要種植在西北地區、東北地區、黃淮海地區和南方地區[4-5]。我國生產的大豆僅能滿足國內食品加工消費需求，飼料使用的大豆仍然需要依賴大量的進口來維持，從2015年至今對外依存度始終超過80%，年均進口量超過8000萬噸左右。因此，提高大豆產量具有重大的戰略意義[6]。通過分子育種技術能夠更加有目的性，更加快捷地培育新品種，因此找到控制大豆生長發育相關基因，并理清這些基因之間的調控機制是培育高產量大豆品種的關鍵。

　　農作物論文范例：重茬大豆高產栽培技術

　　MADS-box類轉錄因子家族在植物的生長發育與信號轉導過程中發揮著重要的作用[7]。MADS-box家族蛋白具有一個由56~58個氨基酸組成的高度保守區域——MADS-box，和一個約由70個中度保守結構域氨基酸組成的K-box。MADS-box類轉錄因子一般能夠形成同源或異源二聚體，例如，擬南芥中MADS-box家族的AGAMOUS(AG)、APETALA1(AP1)、AGAMOUS-LIKE(AGL)和NMHC5的蛋白能夠與自身形成同源二聚體[8]，而APETALA3(AP3)/PISTILLATA(PI)、NoduleMADS-boxHomologue7(NMH7)/NGL9能夠形成異源二聚體[9-10]，從而能夠結合特定的DNA序列調控基因的表達。

　　在花器官發育的ABCDE模型中[11]，絕大部分控制花發育的基因都屬于MADS-box家族，例如，AP1、CAULIFLOWER(CAL)和FRUITFULL(FUL)同屬于MADS-box的AP1/FUL亞家族的A類基因，且三者在控制花分生組織特異性發育的功能方面具有冗余性[12]。其中，FUL基因在控制植物的生長發育具有非常重要的作用，且在不同物種中的功能上存在差異。例如，在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中只含有1個FUL基因，FUL不僅參與控制開花時間，而且對于維持花序分生組織繼續發育成花的過程具有調控作用，并能夠抑制其逆轉為營養分生組織[13]。

　　此外，FUL基因還參與調控擬南芥葉片的發育[14]，角果的伸長[15]以及裂片細胞的發育[16]。在番茄(Solanumlycopersicum)中有3個FUL的同源基因，分別為TM4[17]，SLMBP7[18]和SLMBP20[19]。其中，TM4與擬南芥FUL同源性最高，它能夠和SEPALLATA-LIKE(SEP-like)編碼的蛋白RIPENINGINHIBITOR(RIN)相互作用，同時也能和SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1-LIKE(SOC1-like)編碼的蛋白TM3相互作用，協同控制番茄開花時間和果實成熟[20]。FUL基因在不同植物組織中的表達也存在著差異，例如在水稻(Oryzasativa)中存在2個FUL同源的基因，分別為OsMADS18[21]和OsMADS14[22]。OsMADS18在水稻所有的組織中均有表達，OsMADS14只在花發育的特定階段表達[23]。在陸地棉(Gossypiumhirsutum)中，FUL-like基因GhMADS22在發育中的莖尖、苞片和萼片中高度表達，可以促進開花和延緩衰老[24]。

　　黃瓜(Cucumissativus)中有兩個FUL的旁系同源基因Csa004592和Csa004120。它們主要在黃瓜的花與初期的果實中表達，可能通過細胞周期相關基因來控制細胞分裂與細胞大小，從而調控黃瓜果實的長度[25]。盡管FUL基因對植物的生長發育至關重要，但在大豆中的FUL基因的功能尚未見報道。CRISPR/Cas9基因編輯技術廣泛應用于植物突變體的創制，對深入解析基因的功能具有重要的作用。目前，在擬南芥[26]、煙草[27]、水稻[28]、小麥[29]、大豆[30-31]、玉米[32]、番茄[33]等多種模式植物及農作物中成功實現了基因定向敲除。

　　例如，Cheng等[30]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術成功創制了大豆LATEELONGATEDHYPOCOTYL(LHY)四突突變體植株，發現純合四突變體植株導致株高降低，節間距縮短。Chen等[31]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術成功構建了大豆GmAP1純合四突變體，并發現GmAP1對大豆開花與株高具有重要的影響。本研究利用蛋白質同源比對和進化樹分析的方法鑒定出大豆中含有6個GmFUL基因，參照Cao等[34]將其命名為GmFUL1a、GmFUL1b、GmFUL2a、GmFUL2b、GmFUL3a、GmFUL3b，并通過生物信息學分析，對該家族基因的功能進行了初步分析，同時，利用CRISPR/Cas9技術成功構建了GmFUL家族基因的敲除載體，為創制穩定大豆GmFUL家族基因的多突變體及進一步研究該基因家族在大豆中的生物學功能提供了理論基礎。

　　1材料與方法

　　1.1試驗材料

　　植物材料為大豆品種Williams82(W82)、發根農桿菌菌株為K599，由廣州大學分子遺傳與進化創新研究中心實驗室保存。CRISPR/Cas9載體構建質粒AtU3d、AtU3b、AtU6-1、AtU6-29、CRISPR/Cas9，由華南農業大學劉耀光實驗室提供。DH5α感受態細胞購買自深圳康體生命科技有限公司，BsaI酶、T4連接酶購買自NewEnglandBiolabs公司，DNA提取試劑盒購買自北京康為世紀生物科技有限公司，高純度小量質粒試劑盒購買自北京全式金生物技術有限公司。

　　1.2同源比對及進化樹分析

　　在Phytozome12數據庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/)中，搜索擬南芥AtFUL基因在大豆中的同源基因，并獲取同源基因的氨基酸序列。在NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用BLAST比對與CD-Search功能，獲取與大豆中FUL家族基因同源性較高的其他豆科基因序列及其結構域相關信息。利用DNAMAN軟件(Highlighthomologylevel設為大于50%)，對FUL蛋白的氨基酸序列進行同源比對。利用NCBI數據庫查詢各個同源基因的UTR和CDS以及其蛋白序列的結構域，最后利用MEGA_X軟件中Neighbor-Joiningtree法(Bootstrap值設為1000)構建系統進化樹。

　　1.3共線性化分析

　　從Phytozome12數據庫上下載擬南芥品種ArabidopsisthalianaTAIR10與大豆品種W82的基因組序列，利用TBtools[35]軟件對這兩個物種進行共線性化分析，標注出AtFUL基因與大豆GmFUL1a、GmFUL1b、GmFUL2a、GmFUL2b、GmFUL3a、GmFUL3b基因之間的聯系。

　　2結果與分析

　　2.1進化樹與同源比對

　　在Phytozome12數據庫中，搜索并下載與擬南芥生物鐘基因AtFUL(AT5G60910)同源的大豆基因序列，發現在大豆中存在6個FUL基因，分別命名為GmFUL1a(Glyma.04G159300.1)、GmFUL1b(Glyma.06G205800)、GmFUL2a(Glyma.05G018800.2)、GmFUL2b(Glyma.17G081200.1)、GmFUL3a(Glyma.08G250800.1)、GmFUL3b(Glyma.18G273600.1)。為了進一步分析大豆中的FUL基因家族蛋白的功能是否具有保守性，在NCBI數據庫中搜索并下載與AtFUL基因同源的其他豆科植物的氨基酸序列。

　　利用DNAMAN軟件與MEGA軟件，將6個FUL與4個豆科植物，分別為菜豆(Phaseolusvulgaris，XM_007138315.1)、非洲相思子(Abrusprecatorius，XP_027339183.1)、豇豆(Vignaunguiculata，XP_027942348.1)、木豆(Cajanuscajan，XP_020234496.1)的氨基酸序列進行同源比對及系統進化樹分析。結果表明，在不同的豆科植物中，FUL蛋白均存在2個保守結構域：MADS-box結構域和K-box結構域。其中MADS-box結構域位于1~77位氨基酸，保守率達92.89%。K-box結構域位于88~174位氨基酸，保守率達82.65%。

　　從系統進化樹中可以看出，GmFUL1a和GmFUL1b聚類在一個分支中，且與豆科植物聚類在一起，說明GmFUL1a/1b編碼的蛋白可能是豆科作物中比較保守的蛋白，而擬南芥AtFUL與GmFUL2a/2b親緣關系較近，說明GmFUL2a/2b可能與AtFUL的生物學功能較為相似，GmFUL3a和GmFUL3b聚類在一個分支中，且并未與其他FUL蛋白聚類在一起，說明GmFUL3a和GmFUL3b編碼的蛋白可能與其他的FUL蛋白功能不同。用MEME網址對該11個蛋白進行基因結構分析，發現11個FUL基因可分為2大類，其中GmFUL2a/b、GmFUL3a/b與AtFUL被歸為為一類，GmFUL1a/b與菜豆、豇豆、木豆的FUL基因被歸為一類。

　　3討論

　　在MADS-box轉錄因子家族中，一般存在兩個結構域，MADS-box結構域能夠與特異的DNA序列結合，并調控下游基因的表達。K-box主要參與蛋白二聚體和多聚體的特異性結合。C末端是序列和長度最具變化的結構域，主要負責轉錄激活和參與蛋白多聚體復合物形成，這3個關鍵的結構域在維持轉錄因子活性、發揮正常功能起重要作用[39]。大豆GmFULs蛋白屬于MADS-box轉錄因子家族的成員。

　　與其他植物的FUL同源蛋白相比，大豆GmFULs蛋白在MADS-box與K-box結構域的氨基酸組成與序列長度上都十分保守，但GmFUL3a/b在C末端的氨基酸序列具有較大差異，推測GmFULs在功能上會呈現一定的保守性，同時GmFUL3a/b與GmFUL1a/b、GmFUL2a/b可能會呈現一定的功能分化。在被子植物系統發育過程中，單子葉植物和基部被子植物的MADS-box基因只有FUL-like進化支，伴隨核心真雙子葉植物的起源與演化而產生了序列重復和功能分化成euAP1、euFUL和FUL-like3個分支[40]。而真雙子葉植物euFUL型基因是由祖先的FUL-like基因通過1次主要的基因重復后產生的[41]。

　　在大豆與擬南芥、大豆自身的共線性分析中表明，GmFUL1b、GmFUL2b、GmFUL3a可能來自于擬南芥的FUL基因，而GmFUL1a、GmFUL2a、GmFUL3b可能通過自身FUL基因發生的一次基因重復事件而產生。植物中MADS-box基因不同的表達模式與其功能有明顯的相關性。例如，豆科植物苜蓿(Medicagotruncatula)中有3個FUL-like型基因，其中MtFULa和MtFULb在生長發育階段均有表達，但在開花前表達量最高，主要參與促進植物開花;而MtFULc在開花后表達量最高，主要參與促進花的發育[42]。

　　禾本科植物小麥(Triticumaestivum)具有3個FUL同源基因，分別是WFUL1、WFUL2和WFUL3，它們之間也存在著功能分化。WFUL1在葉片中表達，WFUL2調控花分生組織特性決定、外稃和內稃的發育，WFUL3則參與調控果實的發育[43]。而油菜(Brassicanapus)的FUL-like基因則具有參與調控長角果開裂的功能[44]。不同植物中的FUL-like基因可能由于氨基酸序列或基因結構的差異，導致表達模式產生差異，并主要參與其表達量最高的組織內的發育與調控。

　　我們的研究中發現，GmFUL1a/b、GmFUL2a/b、GmFUL3a的組織特異表達較為相似，主要在花器官和豆莢的表達較高，而GmFUL3b與其他的GmFULs基因不同，它在葉片的表達量遠高于其在花器官和豆莢中的表達量。推測GmFUL1a/b、GmFUL2a/b、GmFUL3a這五個基因在果實發育的過程中，可能起著重要的作用。而GmFUL3b可能在調控開花等途徑中具有重要功能。

　　通過對FUL家族基因的深入生物信息學分析后，發現盡管不同的FUL之間在氨基酸序列及基因結構中較為相似，但其進化規律及表達模式并不相同，因此推測它們之間可能在功能上存在差異，為了更加深入解析不同FUL之間的功能差異，在今后的研究中將進一步獲得不同FUL基因的單突變體，并觀察其農藝性狀，為應用到大豆育種中，提供重要的理論依據。

　　目前CRISPR/Cas9系統已經成功在各種重要作物中實現了基因編輯，如擬南芥、水稻、玉米及大豆等[45]。盡管CRISPR/Cas9技術較傳統方法更加高效便捷，但是在大豆的應用中仍然會出現編輯效率較低的情況。因此在構建Cas9載體時，需要設計兩個或兩個以上的敲除靶點，再通過發根轉化實驗對靶點效率進行驗證檢測，確保大豆的編輯效率。

　　本研究成功利用CRISPR/Cas9技術成功構建用于誘導大豆GmFULs突變的Cas9載體，同時結合根毛轉化系統與CRISPR/Cas9技術，驗證了3個靶點GmFUL1T1、GmFUL2T1、GmFUL3T1能夠有效編輯5個基因(GmFUL1a/b、GmFUL2a/b、GmFUL3a)，提高了檢測靶點的編輯效率，為挑選編輯效率高且特異性好的靶點再進行大豆全株轉化節省了大量時間。而GmFUL3b基因未被靶點GmFUL3T2、GmFUL3T3成功編輯，證明設計的這兩個敲除靶點脫靶率較高，需要重新設計GmFUL3b基因的特異性靶點并進一步進行靶點效率的驗證。

　　參考文獻

　　[1]高運來,姚丙晨,劉春燕,李文福,蔣洪蔚,李燦東,張聞博,胡國華,陳慶山.黑龍江省主栽大豆品種遺傳多樣性的SSR分析.植物學報,2009,44(5):556-561GaoYL,YaoBQ,LiuCY,LiWF,JiangHW,LiCD,ZhangBW,HuGH,ChenQS.Analysisbysimplesequencerepeatsofsoybean(Glycinemax)varietiesfromHeilongjiang.ChineseBulletinofBotany,2009,44(5):556-561

　　[2]MohantyBP,GangulyS,MahantyA,SankarTV,AnandanR,ChakrabortyK,PaulBN,SarmaD,SyamaDJ,VenkateshwarluG,MathewS,AshaKK,KarunakaranD,MitraT,ChandaS,ShahiN,DasP,DasP,AkhtarMS,VijayagopalP,SridharN.DHAandEPAcontentandfattyacidprofileof39foodfishesfromIndia.BioMedResearchInternational,2016,4027437

　　作者：黎永力，杜浩，李泰，甘卓然，侯智紅，董利東，劉寶輝，程群