摘要 為研究我國凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)商業苗種的遺傳多樣性特征，于河北、山東、廣東、海南等地采集了6個有代表性的凡納濱對蝦品牌苗種，分別命名為黃驊R、東營M、廣州P、廣州Z、海南S和海南Z，以8個微衛星標記檢測其遺傳多樣性‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 結果顯示，6個品牌的凡納濱對蝦在8個位點呈現不同程度的多態性，其平均等位基因數(Na)、期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)和多態信息含量(PIC)分別為4.5~9.5、0.516~0.733、0.346~0.550和0.472~0.700，各品牌遺傳多樣性豐富程度從高到低分別為黃驊R>廣州Z>廣州P>海南Z>東營M>海南S‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 哈迪–溫伯格平衡(HWE)檢驗顯示，4.17% (2/48)的檢測結果表現為顯著的偏離(0.01 分子變異方差分析(AMOVA)發現，12%的變異來自品牌間，24%的變異來自品牌內個體間，其余64%的變異均來自所有品牌個體。 UPGMA聚類分析結果顯示，6個品牌的凡納濱對蝦聚為2個明顯的分支，廣州P和廣州Z聚為一支，東營M、黃驊R、海南Z和海南S聚為一支。 主成分分析(PCA)結果顯示，各品牌凡納濱對蝦無法單獨進行聚類。 本研究初步分析了當前國內養殖凡納濱對蝦的遺傳背景，實驗結果可為凡納濱對蝦良種選育提供數據支撐。

　　關鍵詞 凡納濱對蝦; 商業苗種; 微衛星; 遺傳多樣性

　　凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)原產地主要為中、南美的秘魯北部至墨西哥太平洋沿岸，尤其以厄瓜多爾沿岸分布最為密集(王興強等, 2004)。 凡納濱對蝦為世界三大養殖對蝦之一(張偉權, 1990)，其產量約占全球對蝦產量的70%(張龍等, 2019)，具有成活率高、食性廣、生長快、適應能力強等優點。 凡納濱對蝦于1988年從美國引入，之后迅速在全國范圍內普及(于洋, 2014; 唐揚等, 2018)，成為我國海水養殖動物中養殖發展最快的一個種類(馬春艷等, 2011)。 目前，我國已成為世界上凡納濱對蝦養殖產量最高的國家(頡曉勇等, 2008; 童馨等, 2009)。

　　農藝師論文投稿刊物：漁業科學進展(雙月刊)是由中國水產科學研究院黃海水產研究所和中國水產學會主辦、國內外公開發行的學術期刊。

　　隨著我國凡納濱對蝦市場需求量的增大，對蝦苗種培育方式也出現了轉變。 目前，在集約化苗種培育技術已達峰值的背景下，有些育苗場為了進一步降低成本，種蝦不經選育，長期近交繁殖，隨著養殖產量的增大，隨之而來的問題也越來越多。 最大的問題莫過于養殖對蝦遺傳多樣性下降，加之外來親本得不到更新，國內養殖對蝦出現了種質退化、病害暴發頻繁的現象。 從長遠角度來看，查清我國凡納濱對蝦遺傳背景，對進一步培育優良品種和促進可持續健康養殖具有重要指導意義。

　　分子標記目前已廣泛運用于水產動物育種中(張瓊等, 2011; 孫苗苗等, 2017; 王軍等, 2018)，其中，又以微衛星(Microsatellite或Simple Sequence Repeats)分子標記應用最為普遍。 微衛星標記是2~6個堿基為核心的短串聯重復序列，重復單位的重復次數在個體間呈高度變異性且數量豐富，分布于生物體整個基因組中(Tautz, 1989; Schl? tterer et al, 1992)。 微衛星標記具有多態性高、重復性好、操作簡單、共顯性遺傳等優點，被廣泛用于對蝦群體遺傳多樣性分析(Bringmann et al, 1996; Postlethwait et al, 1998; 張天時等, 2005; 曾地剛等, 2008)。 本研究利用8個擴增穩定的微衛星位點，對國內6個商業品牌凡納濱對蝦苗種進行遺傳多樣性分析，初步分析當前國內養殖凡納濱對蝦的遺傳背景，為凡納濱對蝦優良品種的選育提供基礎數據。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗材料

　　選用我國有代表性的6個品牌凡納濱對蝦商業苗種[平均體長為(49.73±1.53) mm，平均體重為(1.41± 0.11) g]，分別命名為黃驊R、海南Z、海南S、廣州Z、廣州P和東營M。 每個品牌取30尾個體進行肌肉組織DNA提取，共計180尾凡納濱對蝦個體。

　　1.2 實驗方法

　　采用天根海洋動物組織DNA提取試劑盒進行肌肉組織DNA提取，利用紫外分光光度計(BioImaging ystems, UVP)進行DNA濃度測量，并根據測量結果將DNA稀釋至50 ng/μl。 將稀釋得到的DNA利用 8個微衛星位點進行PCR擴增。 PCR反應體系：總體積為20 μl，其中，模板DNA 1.5 μl，(Vazyme) 2 × Taq Master Mix (Dye Plus) 10 μl，正向和反向引物 (10 mmol/L)各0.8 μl，滅菌超純水6.9 μl。 PCR反應程序：95℃預變性3 min; 95℃變性30 s; 72℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環; 72℃延伸5 min; 4℃保存。 PCR產物微衛星分型于生工生物工程(上海)股份有限公司，利用ABI 3730XL測序儀完成。

　　1.3 數據處理

　　對6個品牌凡納濱對蝦商業苗種進行哈迪–溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)檢測和遺傳多樣性分析。 利用GENEPOP version 3.4軟件進行HWE檢驗，得到精確P值(PH-W)。 通過Cervus 3.0計算各位點的等位基因數目(Number of alleles, Na)，觀測雜合度(Observed heterozygosities, Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosities, He)、8個微衛星位點的多態信息含量(Polymorphism information content, PIC)和無效等位基因頻率[Null alleles frequency, F(Null)]。

　　利用GenAlEx 6.51軟件計算6個品牌凡納濱對蝦在各位點的香農多樣性指數(Shannon's diversity index)、8個位點每個品牌特有等位基因(Private alleles)平均值、各品牌間的遺傳分化程度和基因流(包括總的FST值以及兩兩品牌間的FST值); 分子變異方差分析(Analysis of molecular variance, AMOVA)，估測遺傳變異在品牌內和品牌間的分配情況; 6個品牌間Nei’s無偏遺傳距離、遺傳相似性系數、品牌間遺傳距離矩陣、個體間遺傳距離矩陣; 利用品牌間和個體間遺傳距離矩陣進行主成分分析(Principal coordinate analysis, PCA)。 利用NTSYSpc 2.1軟件按照遺傳一致度進行6個品牌凡納濱對蝦UPGMA聚類。

　　2 結果

　　2.1 6個商業品牌凡納濱對蝦苗種遺傳多樣性分析

　　在8個微衛星位點中，6個品牌凡納濱對蝦總等位基因數為36~76個，最大為黃驊R，最小為東營M。 各品牌平均等位基因數為4.5~9.5個。 黃驊R平均每個微衛星位點存在1.625個特有等位基因，在所有品牌中最多。 東營M平均每個位點存在0.125個特有等位基因，為各品牌中最少。 8個微衛星位點的多態信息含量(PIC)值為0.343~0.925，最高為TuMXLv7.56位點，最低為M1103位點，除M1103位點外，其他7個微衛星位點PIC都大于0.5。 黃驊R、廣州Z和海南Z的香農多樣性指數較高，其他3個品牌較低。 8個微衛星位點的無效等位基因頻率范圍為0.031~0.403，5個位點存在無效等位基因。 8個微衛星位點分別對6個品牌凡納濱對蝦進行了48次HWE檢驗。 其中，4.17%(2/48)的檢測結果表現為顯著的偏離(0.01 0.05)。

　　2.2 6個商業品牌凡納濱對蝦的遺傳分化

　　分子變異方差分析(AMOVA)發現，僅有12%的遺傳變異來自品牌間，24%來自品牌內個體間，其余64%的變異均來自所有品牌個體，這表明遺傳變異主要存在于個體間。

　　6個品牌凡納濱對蝦商業苗種的F統計量分別為0.359 (FIT)，0.273 (FIS)，0.118 (FST)。 兩兩品牌間的值FST在0.034和0.111之間，均 <0.15，且明顯的分成兩部分。其中，小于0.05的為4組，占全部15組的26.67%，沒有出現遺傳分化(FST <0.05);介于0.05和0.15之間的為11組，占全部15組的73.33%，為中等程度分化(0.05 另外，從基因流分布情況來看，兩兩群體間Nm>1，范圍為1.806~7.027。

　　2.3 6個商業品牌凡納濱對蝦的遺傳聚類

　　東營M和海南Z品牌間的遺傳距離最近(0.128)，遺傳相似性系數最大(0.880)，親緣關系最近; 廣州P和海南S品牌間的遺傳距離最遠(0.549)，遺傳相似性系數最小(0.578)，親緣關系最遠。 6個品牌的凡納濱對蝦聚為2個明顯的分支，廣州P和廣州Z聚為一支，東營M、黃驊R、海南Z和海南S聚為一支。

　　2.4 6個商業品牌凡納濱對蝦遺傳關系主成分分析

　　主成分分析(PCA)結果顯示，6個品牌凡納濱對蝦商業苗種產生了明顯的遺傳歧化。 其中，廣州P和廣州Z最為聚集，其次為東營M和海南Z，之后為黃驊R和海南S，主成分1 (Coord.1)和主成分2 (Coord.2)共解釋了總遺傳變異的71.22%‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 在個體水平上，主成分1 (Coord.1)和主成分2 (Coord.2)共解釋了總遺傳變異的20.05%。 6個品牌的180尾凡納濱對蝦個體聚集較為集中，其中，廣州P、廣州Z和黃驊R 3個品牌的凡納濱對蝦交集最大。 同時，每個品牌的凡納濱對蝦個體無法單獨聚為一類。

　　3 討論

　　微衛星分子標記在種內有高度的遺傳變異，是群體遺傳分化分析的有效標記(孫效文等, 2008)。 微衛星分子標記廣泛分布于基因組中，數量眾多，容易檢測，在分子輔助育種和物種多樣性檢測等方面被廣泛應用(張麗娟等, 2014)。 群體的遺傳多樣性來源于物種適應復雜環境和生存進化(Li et al, 2016)，其主要表現在等位基因數的豐富和均勻程度、遺傳雜合度的大小、多態信息含量的高低3個方面(Beardmore et al, 1997; 王鶴等, 2016)。

　　研究發現，等位基因越豐富，遺傳雜合度數值越大，多態信息含量越高，則群體遺傳變異更高，更能應對環境變化，也更能產生優質的種質資源(Eschenroeder et al, 2016)。關于凡納濱對蝦微衛星標記開發和篩選的工作已有大量報道(Meehan, et al, 2003; 馬寧等, 2013; 楊銘等, 2017)。 本研究從實驗室發表過的文章(李東宇等, 2016)中篩選出8個擴增穩定的微衛星位點，分析了6個國內品牌的凡納濱對蝦商業苗種的遺傳多樣性、遺傳結構和親緣關系。 結果顯示，87.5% (7/8)的位點平均多態信息含量(PIC)都在0.5以上。

　　根據Botstein等(1980)提出的衡量標準，當PIC>0.5時，意味著該位點為高度多態位點，這也說明本研究所引用的微衛星標記的多態性較高。 基因雜合度是衡量群體遺傳變異水平的理想參數(王日芳等, 2017)，8個微衛星位點中的觀測雜合度(Ho)平均為0.486，期望雜合度(He)平均為0.745，觀測雜合度小于期望雜合度，也從一個側面說明了國內商業苗種凡納濱對蝦出現了雜合子缺失、純合子過剩的情況。

　　在進行微衛星分型的8個位點中，有5個(62.5%)位點顯著偏離HWE (P <0.05)。產生該結果的原因：一方面為實驗對蝦純合子過剩、雜合子缺失; 另一方面為水產動物生物結構較為簡單，從而導致的遺傳變異度也較高。 因此，造成微衛星位點在同一物種不同個體中發生堿基形態和數目的變異，無法擴增正確的等位基因，擴增的無效等位基因會導致分型結果顯著偏離HWE (舒妙安等, 2011; 宋忠魁等, 2013)。

　　親緣關系的遠近可以用遺傳距離來反映(陳子桂等, 2016; 劉洪濤等, 2018)。 在本研究中，遺傳距離最大的2個品牌是廣州P和海南S，遺傳距離最小的2個品牌是東營M和海南Z，并且針對個體的遺傳關系主成分分析(PCA)表明，6個品牌的凡納濱對蝦無法依照每個品牌單獨聚集，品牌間親緣關系較為接近。 這種結果表明，當前國內不同品牌的凡納濱對蝦來源存在一定的相似性，也可能是二代、三代苗種導致部分品牌對蝦出現近交情況，使其親緣關系逐漸接近。

　　種苗處于對蝦產業鏈上游，其質量對養殖成敗起關鍵作用(黃小帥等, 2019)。 本研究所分析的6個品牌凡納濱對蝦商業苗種中，黃驊R與廣州Z具有較高的遺傳多樣性，不同品牌的商業苗種間的遺傳特征存在一定差異。 在當前凡納濱對蝦養殖規模不斷擴大的情況下，研究遺傳因素與養殖生產性能之間的關聯尤為重要，只有充分掌握對蝦群體的遺傳背景，才能合理利用雜交優勢進行良種選育。

　　作者：方振朋1,2 孟憲紅2① 李旭鵬2 欒 生2 曹家旺2 陳寶龍2 孔 杰2 閆茂倉3 胡利華3