摘要:按照NCII遺傳交配設計構建測交群體，考察包括產量性狀在內的9個農藝性狀，對水稻農藝性狀表型、配合力和雜種優勢進行通路分析，以期為水稻品種的培育和改良提供理論基礎。結果表明，主穗實粒數與生物調控、千粒重與半胱氨酸和蛋氨酸代謝、主穗長與SNARE相關囊泡運動、主穗一/二次枝梗與依賴DNA的轉錄、株高與大分子代謝過程、主穗穎花數與花粉識別、有效穗數與水解酶活性、單株實粒重與嘌呤核苷結合等通路相關。為獲得優良性狀，高配合力，雜種優勢可以從某一性狀的相關通路進行研究，找到調控該通路的相關基因，以期為改良水稻一般配合力和獲得雜種優勢提供一定幫助。

　　關鍵詞:雜交水稻;GWAS;通路分析;配合力;雜種優勢

　　水稻論文投稿刊物：中國水稻科學所設欄目包括研究報告、研究簡報、研究快報、研究簡訊、實驗技術、學術專論、文獻綜述等。《中國水稻科學》堅持科學技術面向經濟建設的方針和雙百方針辦刊，以盡量多地發表高質量的論文為辦刊的出發點，以把刊物辦成“對外開放型”的學術期刊為辦刊目標，進行著不懈的努力。

　　水稻農藝性狀包括株高、穗長、有效穗數、穗粒數、穗實粒數和千粒重等，通過研究和改良農藝性狀可以提高產量，培育高產品種。隨著高通量測序技術的發展，水稻全基因組測序的完成成為水稻品種改良重要轉折點。全基因組關聯分析(genomewideassociationstudy，GWAS)是一種對全基因組范圍內常見遺傳變異(單核苷酸多態性和拷貝數)總體關聯分析的方法。自植物中第一篇使用高分辨GWAS鑒定數量性狀相關基因/QTL的報道[1]以來，在水稻中進行全基因組關聯分析的報道越來越多，Yonemaru等[2]對抽穗期、粒長、千粒重、籽粒表面積、每穗粒數、抗病6個產量相關的性狀進行全基因組關聯分析，鑒定到8個顯著相關位點。Huang等[3]對517份實驗材料進行高通量測序，對株高等14個農藝性狀進行GWAS分析，鑒定出了37個顯著關聯的變異位點，且每個位點能夠解釋大約36%的表型變異，給水稻的遺傳育種研究提供了重要的理論基礎。

　　GWAS的出現加快了學者對各種性狀遺傳機制的認識，但該方法也存在以下局限性[4]:(1)目前，GWAS利用SNP芯片技術檢測的SNP大多是根據高密度單倍型圖譜數據得來的，或者是以一定物理位置間隔選擇的SNP。因此，關聯分析所獲得的SNP位點不一定真正與性狀有關，或位置有所偏差。(2)為防止假陽性關聯，GWAS分析采用非常嚴格的P值，因而很可能漏掉一些P值未達到GWAS要求的閾值但實際上有關聯的SNP。(3)GWAS分析通常局限于單個位點的邊際效應[5]，但很多性狀的調控機制是由多個基因相互作用引起的。針對GWAS存在的缺點，也出現了很多相應的方法。如基于Wang等[6]提出的多位點隨機SNP效應混合模型方法，編寫了mrMLM軟件包(https://cran.rproject.org/web/packages/mrMLM/index.html)。Hirschhorn[7]提出了基于通路的研究方法，利用基因功能、代謝通路等相關信息對GWAS結果進行深入挖掘。當前以SNP為對象的GWAS通路分析算法分為非核算法和核算法兩大類[8]，其中非核算法主要包括基因功能富集分析(genesetenrichmentanalysis，GSEA)和分層貝葉斯優取(hierarchicalBayesprioritization，HBP)，核算法包括線性核(linearkernel，LIN)、狀態認證核(identity-by-statuskernel，IBS)和尺度不變核(poweredexponentialkernel，PEK)。

　　GSEA是目前GWAS通路分析最常用的方法之一，GSEA的結論基于一組相關基因而非單個基因，因此富集分析增加了研究的可靠性，且能識別出與生物現象最相關的生物過程，相比于單基因方法更有利于得到有意義的通路;同時比基于經典完備統計學理論的結果更穩定可靠。目前，通路分析法在水稻中的研究較少，張遠森[9]用GSEA方法檢測出103個通路與14個水稻農藝性狀相關聯，其中質體通路與抽穗天數、小穗數和分蘗數等13個水稻農藝性狀相關。此外，水稻一般配合力的高低與雜種優勢對于是否能獲得優良水稻品種同樣重要。NorthCarolinadesignII(NCII)設計被廣泛認為是進行配合力和雜種優勢研究的經典遺傳設計[10]。Liu等[11]利用廣陸矮4號和特青產生的F2回交群體與不育系，按NCII設計進行測交。發現一般配合力較低的親本，子代的株高、抽穗期、穎花數這3個性狀反而呈現超表達，且其一般配合力效應顯著上升。

　　我們前期研究[10]用三系野敗型雜交水稻的恢復系和微核心種質構成的品種群體，按照NCII遺傳交配設計，分別與5個不育系測交，分析親本一般配合力與相對競爭優勢的相關性，表明親本一般配合力之和與相對競爭優勢在千粒重、株高、主穗二次枝梗數、主穗實粒數、主穗一次枝梗數、主穗穎花數性狀間均呈極顯著正相關。付新民等[12]利用野敗型雄性不育系和恢復系，按照NCII遺傳交配設計表明，在水稻培育中，應當根據不同性狀考慮不育系和恢復系對農藝性狀的影響，進一步提高雜交水稻的雜種優勢水平。

　　梁康逕[13]采用包括現今生產上大面積推廣的秈型恢復系在內組成的秈粳雜交水稻遺傳群體，按NCII設計，主要分析其穗部性狀的雜種優勢的遺傳規律，建議適當擴大雙親的遺傳差異，以保持雜種優勢水平，并與培育目標和組合測配特點相結合，有效地培育適合不同環境或特定環境的超高產組合。盡管關于水稻農藝性狀全基因組關聯分析、基于NCII遺傳設計的水稻配合力和雜種優勢的研究很多，但是關于水稻農藝性狀配合力和雜種優勢的全基因組通路分析還未見報道。農藝性狀的配合力和雜種優勢，均類似于農藝性狀表型本身，為數量性狀，受多個基因控制。本研究按照NCII遺傳交配設計，構建測交群體，考察包括產量性狀在內的9個農藝性狀，對水稻農藝性狀表型、配合力和雜種優勢進行通路分析，以期為水稻品種的培育和改良提供一定的理論基礎。

　　1材料與方法

　　1.1研究材料

　　部分材料由華中農業大學余四斌教授、四川農業大學李雙成教授和揚州大學湯述翥教授饋贈。其中含29份三系野敗型雜交水稻的恢復系和86份微核心種質構成品種群體。4個兩系不育系[矮64S(PA64)、廣占63S(GZ63)、Y58S和新安S(AS)]及1個三系不育系[珞紅3A(3A)]構成測交不育系。以上材料均為秈稻(詳見附表1)。根據這5個不育系(母本)和115個秈稻品種(父本)的SNP信息，進而推算出測交群體F1代的SNP基因型用于后續分析。根據NCII遺傳交配設計，在海南陵水開展雜交試驗，構建測交群體。分別在2011年、2012年湖北鄂州、海南陵水兩地進行雜交，獲得F1雜交種。115個父本與575個F1雜交子代于2013年種植在華中農業水稻基地，田間種植1行10株，種植密度16.7cm×26.7cm，每點2次重復，隨機區組設計種植。

　　水稻成熟后于田間考察株高，收種時，從中間8株中選擇長勢均一的3株收種，室內考察單株主穗實粒數(filledgrainsperpanicle，FGPP)、千粒重(1000-grainweight，KGW，g)、主穗長(mainpaniclelength，MPL，cm)、主穗一次枝梗數(primarybranchofmainpanicle，PBP)、株高(plantheight，PH，cm)、主穗二次枝梗數(secondarybranchofmainpanicle，SBP)、主穗穎花數(spikeletperpanicle，SPP)、有效穗數(effectivetillersperplant，TP)、單株實粒重(yield，YD，g)9個農藝性狀。

　　1.2數據處理

　　為了深入了解水稻農藝性狀的遺傳機制，把每個性狀對應的數據集分成V、GCA、TC和BP4類。V代表親本(父本)的表型，GCA代表親本(父本)的一般配合力，TC代表測交群體的表型，BP代表測交群體的超親優勢值，BP=F1−Pat，Pat表示父本的表型值。對這4類數據分別進行GWAS分析。

　　1.3全基因組關聯分析

　　將收集到的水稻9個農藝性狀數據經過質量控制，經刪除maf<5>20%的SNP等一系列數據處理，得到1，894，012個SNP。以GAPIT軟件[14]的CMLM模型進行關聯分析處理。以P-value<10–4為標準篩選顯著性的SNP[15]，用于后續的分析。

　　1.4水稻基因注釋信息獲取

　　在國家水稻數據中心(http://www.ricedata.cn/，截至2018年10月15日)查找相關基因的注釋信息，利用python(version3.5.4)腳本實現多個檢索爬取結果于本地。

　　1.5通路分析

　　通過PlantGSEA(http://structuralbiology.cau.edu.cn/PlantGSEA/index.php)，將爬取的結果用于分析。用PlantGSEA篩選出具有顯著性功能的通路[9]。

　　2結果與分析

　　2.1PlantGSEA結果分析

　　針對9個農藝性狀，在V、GCA、TC、BP四個數據集中分別共檢測到100、107、118、33個通路，其中有5個通路是4個數據集共有的，包括催化活性(GO:0003824)、陽離子結合(GO:0043169)、離子結合(GO:0043167)、代謝過程(GO:0008152)、初級代謝過程(GO:0044238)。對于這些通路，本研究將從9個農藝性狀分別進行詳盡的闡述。

　　2.1.1主穗實粒數

　　在V、GCA、TC數據集中與水稻主穗實粒數相關聯的通路數分別為1、37和4個。其中包括生物調控(GO:0065007)、調節基因表達(GO:0010468)相關通路。在TC數據集中有flo-2基因。She等[16]研究表明flo-2通過影響胚乳中儲藏性物質的積累，在調控水稻籽粒大小和淀粉品質中發揮關鍵作用。結果表明基因表達、生物調控過程都對主穗實粒數產生影響。

　　2.1.2千粒重

　　在V、GCA、TC數據集中與水稻千粒重相關聯的通路數分別為7、1和4個。其中包含半胱氨酸和蛋氨酸代謝(KEGG)相關通路。GCA、TC數據集中都含有GS3基因。Mao等[17]研究表明GS3是一個控制籽粒大小的主效QTL，它在調節籽粒和器官大小中具負調節子的功能。野生型等位基因包含N端的OSR結構域，一個跨膜區，TNFR/NGFR家族富半胱氨酸結構域，以及C端的VWFC4個推測的結構域。C端TNFR/NGFR和VWFC結構域顯示出對OSR功能的抑制作用，這2個功能域失活突變會產生非常短的籽粒。V、TC數據集中含有甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(KEGG)通路和SaM基因。

　　3討論

　　對于農藝性狀的研究，黃利興等[23]認為單株有效穗、穗長、穗總粒數、穗粒數、結實率、千粒重和著粒密度7個農藝性狀親本的表現與一般配合力的效應值呈顯著性正相關。廖伏明等[24]認為一般配合力與親本自身的表型值有一定程度的正相關，說明在育種過程中必須注意親本自身農藝性狀的改良。付新民等[12]的研究表明生育期、株高、單株有效穗數、每穗總粒數、結實率和千粒重性狀一般配合力與其表型值間的相關達到顯著或極顯著水平。說明這些性狀可以通過其表型選擇提高一般配合力。

　　同樣，我們的前期研究[8]表明除親本單株實粒重與一般配合力間相關性不顯著外，親本農藝性狀與其一般配合力均為正相關。在本研究GCA與V中相同的通路有65個，除了生物生長所需的基本代謝通路DNA結合(GO:0003677)、蛋白質代謝過程(GO:0019538)、離子結合(GO:0043167)等外，其中也包括一些影響相關性狀的通路，如半胱氨酸和蛋氨酸代謝(KEGG)、激酶活性(GO:0016301)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(KEGG)等。張遠森[9]研究表明水稻粒重與細胞蛋白變性過程(GO:0006464)、激酶活性(GO:0016301)等通路相關。我們的結果與其部分相符。共同的通路在親本性狀和一般配合力中都起著一定的作用，表明性狀和一般配合力之間有著一定的相關性，這與前面學者研究得到的結果相符。

　　已知與性狀相關的代謝通路，那么該通路中的相關的節點基因可能對該性狀具有調控作用。而對于一般配合力的改良，我們可以通過找到影響相關性狀代謝通路的節點基因，改良相關性狀，以期改良一般配合力。在本研究的TC與BP中相同的通路有6個，包括催化活性(GO:0003824)、陽離子結合(GO:0043169)、離子結合(GO:0043167)、代謝過程(GO:0008152)、初級代謝過程(GO:0044238)、水解酶活性(GO:0016787)等。既然雜種數量性狀表型與雜種優勢存在共同的通路，表明二者存在著一定的聯系。

　　而雜種優勢的出現，可能是由于基因組合引起的。所以對于雜種優勢的研究，我們可以從某一性狀的相關通路進行，找到調控該通路的相關基因，以期改良該性狀，更好地挖掘雜種優勢。這為揭示雜種優勢的遺傳機理提供了一定的理論基礎。對于大部分數量性狀，用于定位的表型數據直接來源于大田或溫室的測量值，或是對多年多點的數據測量值的線性估計，稱為構成形狀。將表型值需要通過其他數量形狀測量值的代數運算而獲得的性狀成為復合形狀[25]。一般配合力和超親優勢值都屬于復合形狀。

　　水稻的長寬比(粒型)是一個重要的復合性狀，Li等[26]對一個大小為308的水稻BC3F1群體的粒長、粒寬和粒型進行了QTL分析。在第3和第10染色體上發現2個控制粒長，第12條染色體上1個控制粒寬的QTL。2個控制粒型的QTL，其位置與控制粒長的2個QTL相近。而Rabiei等[27]對一個大小為192的水稻F2群體的粒長、粒寬和粒型進行了QTL分析。在這18個QTL中，5個控制粒長，7個控制粒寬，6個控制粒型，其中有1個解釋15.0%表型變異的粒型QTL，既沒有被粒長發現，也沒有被粒寬發現。從Li等[26]和Rabiei等[27]對于水稻粒型的遺傳研究來看，復合性狀的QTL作圖和構成性狀的QTL作圖會得到不同的結果，有時甚至出現一些復合性狀僅有的QTL。

　　在本研究中，表型性狀與一般配合力及超親優勢值存在不同的通路，其之間的遺傳基礎應該存在著差異。其遺傳機理是一個復雜的過程，到目前并沒有詳盡標準的參考，而本研究也為遺傳機理的解釋提供理論基礎，使水稻雜種優勢以及一般配合力的遺傳機理得到更全面的揭示。本研究表明對于改良一般配合力和雜種優勢，可以從水稻各性狀的代謝通路出發，找到該通路中的控制該性狀的相關基因，改良相關性狀、一般配合力和雜種優勢。一個生物學過程是一個復雜的網絡調控過程，由基因組調控，并非單基因，本研究從基因集的水平出發，利用通路分析法對于雜種優勢的獲得以及一般配合力的改良提出了新的思路。

　　4結論

　　基于通路分析的方法剖析水稻農藝性狀配合力和雜種優勢，4個數據集分別得到了100、107、118、33個與農藝性狀相關的通路。對于改良一般配合力和雜種優勢，可從基因集水平出發，找到通路中的控制該性狀的相關基因，以改良相關性狀、一般配合力和雜種優勢。本研究結果可為后續解析水稻農藝性狀一般配合力和雜種優勢的遺傳機理提供重要的理論基礎。