摘要:梅起源于我國，具有豐富的種質資源和遺傳多樣性。國家級種質資源圃的建立提高了梅種質資源的保存與鑒定水平，同時梅基因組測序的完成也促進了近年來梅分子生物學研究。本文重點綜述了梅的起源與分布、資源收集與鑒定評價、核基因組與葉綠體基因組研究、雌蕊發育機制、自交不親和機制、季節性休眠機制、分子標記、組織培養及遺傳轉化等方面的研究進展，探討了梅種質資源研究和分子生物學研究中存在的問題，并指出了今后的重點研究方向。

　　關鍵詞:梅;種質資源;分子生物學

　　梅(PrunusmumeSieb.etZucc.)原產于中國，為薔薇科李屬植物。梅種質資源豐富，遺傳多樣性廣泛，與核果類果樹杏、李、櫻桃和桃均可進行種間雜交。梅果實具有較高的營養價值，其經濟栽培主要分布在東亞和東南亞的亞熱帶地區，中國是目前梅種植面積最大的國家。根據用途，梅可分為果梅和花梅2種類型。2011年國家果梅種質資源圃的建立和2012年基因組測序的完成，促進了梅種質資源的收集、保存、評價利用以及分子生物學的發展。近年來，國內外學者在梅資源鑒定和分子生物學研究等方面取得了較大的進展，本文對近20年梅種質資源評價鑒定和分子生物學研究等方面進行全面綜述，為今后梅的科學研究提供借鑒和參考。

　　1梅起源分布與資源研究

　　1.1梅的起源和分布

　　一般認為梅栽培歷史有3000多年[1]，但據近年在我國河南省發現的梅核化石分析認為，在距今7000～7500年前新鄭裴李崗文化時期就有梅的種植。梅的遷移和分布與地理氣候的變遷有很大關系。據古書籍記載，古代梅樹曾分布于我國華北和西北一帶，后因氣溫降低而縮小了梅的適宜栽培區域，目前主要分布在我國的亞熱帶地區及其與北溫帶的過渡地帶，而華北和西北地區僅有零星栽培[2]。據調查數據顯示，我國野生梅主要分布于四川、云南、西藏、湖北、貴州、湖南、廣東、廣西、江西、安徽、浙江、福建、江蘇、陜西、臺灣15個省(自治區)[3-4]。

　　目前，我國的四川、云南、西藏、貴州、湖北、湖南、廣東、廣西、福建、江西、安徽、浙江、江蘇、河南、陜西、甘肅、臺灣17個省(自治區)均有果梅栽培[5]，其中廣東、福建、云南、浙江、江蘇等省是中國果梅的傳統產區，全國栽培面積為80000hm2左右。梅主栽品種主要為‘龍眼梅’‘軟枝大粒梅’‘照水梅’‘白粉梅’和‘長農17’等。相比而言，觀花用的梅花種植范圍更加廣泛，長春、沈陽、延安、拉薩和北京等地均有梅花的栽培，甚至海南省部分地區也有梅花的栽培[5]。

　　此外，老撾及越南北部也有梅的分布，日本、朝鮮、韓國均有較多的梅花栽培，新西蘭、巴西、泰國、英國、法國、意大利、美國、德國等國家也有少量的梅花栽培[6]。除了中國以外，日本梅的栽培面積最大，從日本中部的東京到南部的和歌山都有種植，近20年種植區域和面積也比較穩定。據日本農林水產省統計數據，2017年日本全國梅產量為15000hm2左右，主要集中在和歌山、群馬、奈良、長野、三重等地，栽培品種主要有‘南高’‘古城’和‘小梅’等。

　　1.2梅資源收集和鑒定評價

　　2011年，我國農業部批準建立國家級的果梅種質資源圃，依托單位為南京農業大學，經過后期的改建和擴建，目前占地5.3hm2，共收集了國內外近200份梅野生資源、地方品種和近緣種。所收集的梅種質資源主要來自我國臺灣、云南、廣東、浙江、福建、廣西、湖南、四川、安徽、江蘇等省(自治區)以及日本等其他國家。果梅種質資源圃對現有資源的植物學性狀、園藝學性狀和抗逆性進行了全面的鑒定和分析[7]，建立了果梅種質資源核心種質20份[8]，篩選出10多個花果兼用品種以及2個優質的抗寒果梅品種‘軟條紅梅’和‘細葉青’[9]，從47個果梅品種中鑒定出1個完全花比例較高的種質資源[10]。

　　除此以外，還通過田間鑒定和實驗室鑒定相結合的方法鑒定出抗瘡痂病的種質資源[11]以及自交親和變異的種質資源‘早紅’和‘四川白梅’[12-13]。通過多年連續的田間觀測并結合實驗室鑒定，明確了69個果梅品種的需冷量[14]以及43個梅品種的S基因型[15]，為不同地區選擇品種和生產配置授粉品種提供了依據。采用分子標記技術對梅不同種質資源及其與近緣種杏、桃、李、櫻桃等核果類果樹的親緣關系進行了系統分析，發現了梅演化的分子依據，尤其是日本梅是由中國傳播的事實[16]，進一步通過基因組序列和葉綠體基因序列分析發現杏和梅的親緣關系比其他近緣種更近[17]。

　　2梅基因組和葉綠體基因組的測序

　　2.1基因組

　　雖然木本植物的高度雜合性增加了基因組整合的難度，但Zhang等[18]利用全基因組酶切圖譜技術(WGM)克服了組裝難度，完成了梅全基因組測序和組裝，構建了首個長度為237Mb的梅基因組圖譜，并預測梅基因組實際大小約為280Mb;結合已完成的蘋果和草莓基因組序列，重建了薔薇科植物的祖先染色體，并深入分析蘋果屬、草莓屬和李屬3個種屬不同的染色體融合、斷裂的過程。此外，Zhang等[18]還探索了與梅開花相關的基因以及在低溫下打破芽休眠的分子機制，共鑒定出6個與休眠相關的DAM基因，呈串聯重復分布，在DAM基因上游有6個CBF基因的結合位點。

　　Sasaki等[19]推測DAM基因和多個CBF結合位點是梅提早解除休眠的關鍵因子，這些因子使得梅對溫度變化非常敏感，從而導致梅的休眠期短而開花較早。梅基因組測序的完成推動了梅分子生物學研究的深入開展，提升了研究水平。梅花具有特殊而獨特的香氣。Hao等[20]鑒定出梅花香氣重要成分為乙酸苯甲酯，同時分析了其所調控的基因苯甲醇乙酰基轉移酶基因(BEAT)，該基因家族在梅基因組中為34個，而蘋果只有16個，草莓只有14個，據此推測這些BEAT基因可增加乙酸苯甲酯含量的劑量效應，從而使梅具有獨特的花香。

　　此外，Zhang等[21]以梅花的近緣物種山杏、山桃和李作為參照，構建了梅花品種的系統發育樹，從16個亞群中選擇7個梅花品種和1個野生梅花，與山杏、山桃、李進行重新測序和基因組組裝，并結合已經發表的桃和梅花基因組，通過GWAS分析確定了多個數量性狀基因座(QTL)和基因組區域，并發現MYB108基因和花色有關。

　　2.2葉綠體基因組

　　植物細胞中包含3大基因組:核基因組、葉綠體基因組和線粒體基因組。與核基因組相比，葉綠體基因組體積小，擁有相對獨立的遺傳物質葉綠體DNA、細胞質遺傳、核苷酸替換率低、單倍體性質和高度保守的基因組結構[22-23]，因此葉綠體基因組被認為是系統發育研究的理想系統。1984年，煙草和地錢的葉綠體基因組測序完成[24]，這是最早報道的植物葉綠體基因組序列。截至2018年3月，NCBI上收錄的完整的植物葉綠體基因組共有13602條。

　　高等植物葉綠體基因組DNA一般為雙鏈環狀結構，呈典型的四段式結構，極少數為線性分子結構，由1個大單拷貝區(LSC)、1個小單拷貝區(SSC)和1對反向互補重復區(IR)組成，其中IR區將LSC和SSC區分隔，大小一般為120～160kb。梅葉綠體基因組為典型的閉合雙鏈環狀DNA分子結構。筆者所在的實驗室測序獲得果梅葉綠體基因組全長為157815bp，LSC區長度為86113bp，SSC區長度為18916bp;Ira和IRb區長度相等，為26393bp。梅葉綠體基因組GC含量為36.74。其中，IR區GC含量為42.56，LSC和SSC區域的GC含量比IR區的分別低8%和12%。在梅的基因注釋表中，梅葉綠體基因組編碼133個基因，其中110個是unique基因。

　　這110個unique基因包括80個蛋白編碼基因，26個tRNA基因，4個rRNA基因。在IR區上有18個基因重復，包括所有的8個rRNA基因，IR區域內還有13個基因。此外，共12個基因含有內含子，其中10個基因含有1個內含子，2個基因含有2個內含子。這些內含子中有9個分布在LSC區，2個分布在SSC區，3個分布在IR區[17]。這與Wang等[25]發表的梅葉綠體序列(NC_023798)類似，但在序列長度、基因組成和內含子數目上有所不同。梅核基因組和葉綠體基因組序列圖譜的測序完成，有助于開發分子標記進行輔助育種和開展近緣物種的進化分析。

　　3梅花的發育研究

　　3.1雌蕊發育研究

　　梅花花器官通常由外到內包括4輪花器官:萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊，呈半徑不等的同心圓排列。梅花不但具有獨特的香氣而且花型繁多，變異大，是研究花器官發育的良好材料，而果樹雌蕊更是重要的生殖器官，因此雌蕊發育的分子生物學也成為關注的熱點。梅完全花通常含有1枚正常發育的雌蕊，也有少數品種含有3至數枚雌蕊并且能夠正常授粉。李曉穎等[26]對南京梅花品種花性狀進行評價，結果發現梅花雌蕊有多種形態，單瓣品種雌蕊多發達，1枚雌蕊多數能正常發育并結實;重瓣花雌蕊變化較大，有完全正常的雌蕊，也有完全退化的雌蕊，雌蕊數量不定，最多為15枚;對所有梅花品種的統計表明:有136個品種(41.21%)的雌蕊數量為1～6個。

　　侍婷等[7]通過石蠟切片觀察了果梅品種‘龍眼’和‘大嵌蒂’雌蕊分化進程，發現10月中下旬為雌蕊分化初期，11月下旬至12月上旬為雌蕊分化期，12月中旬以后為雌蕊分化末期，雌蕊分化基本完成，因此南京地區雌蕊分化的關鍵時期為10月上旬，而雌蕊發育的關鍵時期為12月上旬。梅花中除了具有正常生殖能力的完全花外，還包括雌蕊發育不正常的不完全花，主要表現為雌蕊的缺失、畸形和褐化。Gao等[27]研究表明，果梅品種‘大嵌蒂’的不完全花比例高達76.3%，不完全花的存在嚴重影響到梅果實產量。因此，雌蕊敗育的分子機制也受到科研人員的關注，希望尋求解決雌蕊發育異常問題的途徑，從而提高完全花比例，提高果實產量和品質。

　　Gao等[27]利用高通量測序技術對與完全花和不完全花雌蕊敗育相關的miRNA進行了分析，鑒定出7個已知miRNA和6個新miRNA在2種花中表達差異顯著。Wang等[28]發現Pm-miR319a影響梅花雌蕊的發育，并通過負調控目標基因Pm-TCP4促進雌蕊敗育。同時，Shi等[29]發現完全花和不完全花差異蛋白中咖啡酰-輔酶A-O-甲基轉移酶(CCoAOMT)只存在于‘大嵌蒂’完全花中。

　　Sun等[30]進一步克隆了CCoAOMT基因，并通過洋蔥瞬時表達試驗證明CCoAOM蛋白定位在細胞質中;同時發現PmCCoAOMT在雌蕊發育前期‘大嵌蒂’中的表達量高于‘龍眼’，而在雌蕊發育后期則剛好相反，并且完全花中表達量高于不完全花;PmCCoAOMT的過量表達導致花變大、花瓣變深以及雌蕊形態改變，證明該基因對雌蕊的發育具有一定的作用。植物激素尤其是生長素是影響雌蕊發育的重要因素，Song等[31]研究發現植物生長素相應因子ARF基因對雌蕊發育起作用，尤其是PmARF13和PmARF17可能是梅花雌蕊發育所必需的。

　　3.2梅S基因型的鑒定及自交不親和

　　梅為薔薇科李屬典型的配子體自交不親和(gametophyticself-incompatibility，GSI)樹種[35-36]。自交不親和現象指可育的雌雄同花的被子植物在自花授粉后不能產生合子的現象，在薔薇科植物中普遍存在。薔薇科的配子體自交不親和性受單一位點S-locus的至少2個多態性基因控制，即花柱決定基因S-RNase基因(S-ribonucleases)和花粉決定基因SLF基因(S-locusF-boxproteingene)或SFB基因(ShaplotypespecificF-boxgene)[37]。

　　3.2.1梅花柱S-RNase基因鑒定

　　自交不親和現象首先在煙草屬植物上證實存在，并且通過雜交試驗首次發現了S基因的存在[38]。梅S基因研究起步較晚，直到2000年梅首個Sf-RNase(登錄號:AB101437)等位基因在自交親和品種中利用AS-PCR(allele-specificPCR)技術克隆，并且開發分子標記來鑒別自交不親和品種[35，39]。Yaegaki等[36]運用RT-PCR技術擴增部分S-RNase基因編碼區(MSRN1-3)，并確定了6個品種的S-基因型。Habu等[40]運用AS-PCR擴增技術克隆了S1至S11，以及Sf-RNase并且更新了3種S-基因型。

　　Entani等[41]克隆出與Habu等[40]登錄序列不同的S9-RNase(登錄號:AB092646.1)。Heng等[42]鑒定了S10至S16(登錄號:DQ011150、DQ201191、DQ201192、DQ345781、DQ768219、DQ903312和EF990750)。Xu等[43]克隆了S17至S26(登錄號:FJ602078—FJ602087)，并通過田間試驗異花授粉驗證了24個品種的S-基因型。

　　Wang等[44]克隆得到S30至S33共4個S-RNase基因(登錄號:JN232975—JN232978)，并鑒定了17個品種的S-基因型。Gao等[45]運用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析克隆得到S34、S35、S36共3個S-RNase基因和6個SFB基因(PmSFB14、PmSFB18、PmSFB22、PmSFB24、PmSFB31和PmSFB34)。雖然梅自交不親和研究起步較晚，但是從2000年到2013年，果梅的研究取得了較大進展。迄今為止，已經鑒定并登錄的果梅S-RNase基因有S1—S26、S30—S36、Sf-RNase、S9-RNase、S10共36個S基因和40多個栽培品種的S-基因型，同時發現了4個自交親和的品種，并進一步分析了其自交親和變異的機制[46]。這些研究結果為生產配置授粉品種和育種組合的親本選擇提供了依據。

　　3.3梅季節性休眠分子機制

　　多年生木本植物季節性休眠是對外界不良環境條件適應的機制。根據季節性休眠的不同時期，一般分為3種類型:抑制性休眠、自然休眠和生態休眠[50]。雖然種子休眠和木本植物的季節性休眠機制相似，但也存在差異。梅樹具有休眠期短、春季萌芽早的特點，是研究休眠過程，尤其是木本植物解除休眠的良好材料。植物休眠解除過程涉及到許多信號分子，其中植物激素是最重要的一種信號物質[51]。

　　脫落酸(ABA)、生長素(IAA)和赤霉素(GA)被認為是休眠的形成與解除過程中非常關鍵的信號分子，起著至關重要的作用[52-53]。Zheng等[54]研究發現，擬南芥ABA不敏感突變體(abi1—abi5)種子萌發對ABA誘導的生長抑制不敏感。

　　4梅分子標記開發

　　根據開發的方法梅分子標記分為2大類。第1類是以電泳技術和PCR技術為核心的分子標記，包括隨機擴增多態性DNA(RAPD)、簡單重復序列(SSR)、擴增片段多態性長度(AFLP)以及逆轉座子分子標記;第2類是以DNA序列為核心的分子標記，典型的有單核苷酸多態性(SNP)和表達序列標簽(EST)標記[65]。

　　Yamane等[66]利用RFLP技術使用Pm-SFB探針來分辨果梅自交不親和S1至S8單倍型以及自交親和單倍型，這是比較早的梅分子標記應用的報道。在基因組測序完成之前，分子標記作為梅品種鑒定和親緣關系分析的重要手段被廣泛應用。Li等[67]利用RAPD標記技術隨機擴增基因組不同區域，并采用聚丙烯凝膠(PAGE)電泳檢測擴增引物，提高了檢測多態性數量，能夠客觀反映所測果梅品種間的遺傳關系和遺傳差異。Fang等[68]應用AFLP分子標記技術將中國和日本的14個品種分成2類，利用2對AFLP引物組合的多態性分別為57.92%和63.04%。

　　侍婷等[7]和高志紅[69]利用SSR分子標記技術對果梅種質資源的遺傳多樣性進行了分析，并篩選了花果兼用的優異梅種質，建立了果梅的核心種質。Li等[70]利用SNP標記分析梅的遺傳多樣性和親緣關系，研究表明果梅SNP的出現頻率高于花梅，說明果梅品種間的遺傳差異較大，而花梅品種的育種親本相似或者地理起源相近，但試驗證明果梅與花梅在遺傳上具有很高的相似性，是同一樹種中某些性狀(主要是花器官)存在一定差異的不同品種類型。

　　2012年梅全基因組測序的公布為基于參考基因組發掘不同品種間基因SNP差異分析提供了方便[18]。Du等[71]利用EST數據庫在全基因組上鑒定30個胚胎發育晚期豐富蛋白，這類蛋白除3號染色體外，在其他7條染色體上均有分布。Sun等[72]結合SSR和SNP分子標記構建了高密度連鎖圖譜來進行梅童期性狀和樹體結構等數量性狀的QTL定位。Zhang等[73]利用簡化基因組測序SLAF-Seq技術開發SLAF分子標記，用來構建高密度連鎖圖譜，其中SLAF分子標記包含8007個標記，平均標記距離為0.195cM，使其成為李屬植物最密集的遺傳圖譜，并且將垂枝性狀定位在7號連鎖群上，為應用SLAF標記構建的高密度遺傳圖譜探究木本植物的重要特征提供參考。

　　5組培與遺傳轉化研究

　　目前，用于果梅組培與遺傳轉化的外植體類型主要包括葉片[74-75]、葉柄[76]、一年生枝條[74-77]、未成熟合子胚[75-79]等4大類，外植體滅菌主要使用75%乙醇和0.1%氯化汞消毒，基本培養基主要用MS、WPM、QL等，使用的細胞分裂素和生長素主要包括6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、6-糖基氨基嘌呤(KT)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、苯基噻二唑基脲(TDZ)、吲哚丁酸(IBA)等。朱丹紅等[74]研究表明，一年生枝條基部的葉片，背面朝上放于培養基上誘導愈傷組織效果更佳。楊麗青等[78]研究表明，果梅的一年生枝條不宜在剛抽生的時候采樣，枝條太幼嫩，容易受滅菌劑影響而褐化死亡，最好在新稍生長旺盛期采樣，一般在4至6月。

　　楊潔等[79]研究表明，未成熟合子胚在長3.5～5.0mm的體胚誘導率和體胚誘導效果最佳。Ning等[80]研究表明，未成熟胚在以1/2MS為基本培養基，加入13.2μmol·L-16-BA和2.7μmol·L-1NAA的培養基上誘導效果最好，誘導率達到89.5%。

　　Gao等[81]研究表明，未成熟胚在以MS為基本培養基，加入1μmol·L-12，4-D和1μmol·L-16-BA的培養基上誘導效果最好。在組培和遺傳轉化過程中，不論是外植體的取樣時間、滅菌方法的交叉組合，還是不同基本培養基以及不同的激素配比，都是影響外植體生長和增殖的重要因素。綜上所述，雖然梅組培和再生研究有些零星的報道，也取得了一些經驗，初步獲得了組培快繁的技術體系，但組培苗的伸長生長和再生效率還存在很大問題，尤其是梅遺傳轉化體系至今仍未建立。

　　6問題與展望

　　梅作為原產于中國的特色樹種，主要分布在中國和日本等東亞和東南亞地區。雖然果實具有較高的保健價值[82-83]，但因其為小水果，投入的科研力量與大宗水果相比還相對比較薄弱。針對資源挖掘和分子生物學研究，需重點開展以下研究工作。

　　1)深度鑒定種質資源和挖掘優異基因。隨著城鎮化的進程加快，越來越多栽植在城郊的梅園被毀，隨之而來的是資源的流失，因此加快收集和保存資源應作為梅資源研究的重點工作。同時進一步深度鑒定已經收集的種質資源，明確其演化和進化規律，挖掘優異基因，為生產和科研服務。例如梅具有一些優異性狀，如果實高酸低糖、休眠期短以及流膠病抗性等，其相關基因資源都有待進一步的研究和挖掘利用。

　　2)建立梅穩定高效的遺傳轉化體系。作為核果類果樹的共性問題，梅遺傳轉化體系一直未能建立，這也是阻礙梅分子生物學研究水平進一步提升的瓶頸問題。只有利用高效的遺傳轉化體系才能進一步明確梅特有基因的功能。目前雖然已建立了梅的組培快繁體系，但也存在繁殖系數不高、生根困難等問題。因此，建立高效的遺傳轉化體系是今后梅研究的重點課題。

　　細胞學論文投稿刊物：《分子細胞生物學報》Journal of Molecular Cell Biology(雙月刊)曾用刊名：實驗生物學報;TheChineseJournalofExperimentalBiology，1936年創刊，現由中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所、中國細胞生物學學會共同主辦,上海科學技術出版社出版。