時間:2022年03月31日 分類:農業論文 次數:
摘要:金線蘭(Anoectochilus roxburghii)是蘭科開唇蘭屬藥用物種,其全草的鮮品或干品可作為“金線蓮”藥材使用,具有降血糖、降血脂、抗炎鎮痛等功效。在廣東、福建等地區的食藥用歷史悠久,延續至今。隨著“藥食同源”概念的廣泛認同、市場需求激增,野生金線蘭資源已遠不能滿足供應,處于瀕危狀態,市場價格逐年推高。建立人工繁育體系,是緩解野生資源緊缺的重要手段。明確金線蘭資源特征,則是優選種質資源、優化繁育體系、建立有效評價標準的關鍵依據。因此,本文從本草考證、資源分布、資源鑒定、化學成分特征與藥理活性、繁育技術進行綜述,旨在為我國金線蘭資源可持續利用和后續深入研究提供參考。
關鍵詞:金線蘭;資源特征;繁育技術;菌根共生;蘭科
金線蘭[Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.],又名花葉開唇蘭,是蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬(Anoectochilus)地生型植物,藥材“金線蓮”的基源植物之一。根據《中國植物志》(2004 年版)的統計,全球開唇蘭屬植物共有 40余種,其中我國存在 20 個種及 2 個變種。此后,陸續有新種在我國被首次發現,如麻栗坡金線蘭、麗蕾金線蘭等[1-4]。
金線蘭民間應用歷史悠久,其全草入藥,具有降血糖、清熱涼血、除濕解毒、保肝、抗炎鎮痛等功效。主要分布于福建、浙江、廣東、云南等南部省份。野生金線蘭資源較為稀缺,《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES) 將其列入附錄Ⅱ的保護物種,《國家重點保護野生植物名錄》(第二批) 將其列為二級保護植物。隨著人工繁育技術的發展,金線蘭產業得到了迅速地發展,而明確金線蘭資源特征和繁育特性將直接影響該產業的生命力。因此,本文對金線蘭資源特征和可持續利用的相關研究進行綜述,旨在為金線蘭瀕危資源開發及可持續發展提供指導。
1 本草考證
金線蘭于 1839 年被 J.F. Royle 首次記載,在我國記載時間較晚。古代經典藥用植物著作如《神農本草經》《本草綱目》等中均無記載。
目前可追溯的最早記載是出版于 1976 年的《中國高等植物圖鑒》,并首次提到其具有藥用價值,也進一步證實金線蘭自古便資源稀少,生長于人跡罕至的深山中。金線蘭別名眾多,叫法混雜。據《全國中草藥名鑒》中記載,“金石松”、“金蠶”、“金石蠶”、“少年紅”、“樹草蓮”、“鳥人參”、“金線虎頭蕉”、“金線入骨消”等均為金線蘭的別名。此外,不同地區對金線蘭叫法也有差異,如海南省稱之為“金錢楓”;在四川省峨眉山地區叫“蛇皮蘭”。
甚至同一省份不同地區也有不同稱呼,如在廣西賀縣稱之為“小葉金耳環”,在桂平縣被叫做“金絲線”,而在鹿寨縣又叫“麻葉菜”。需要注意的是,文獻和著作中常將臺灣銀線蘭(Anoectochilus formosanus Hayata.)也稱為“金線蘭”,造成這種現象的原因:① 臺灣省“金線蘭”官方所指植物與其他省份所指非同種,臺灣省的“金線蘭”特指臺灣銀線蘭,而根據《中國植物志》所載,其他省的“金線蘭”特指花葉開唇蘭。②
在《中國植物志》出版之前,未對“金線蘭”進行統一界定,因此此前出版的著作,如《中華本草》、《全國中草藥名鑒》等均將金線蘭和臺灣銀線蘭作為藥材“金線蓮”的基源植物。目前國內金線蓮市場中,金線蘭或臺灣銀線蘭均得到認可,兩者都具有良好的降血糖、降血脂、抗炎等活性[5,6]。除此之外,恒春銀線蘭 (Anoectochilus koshunensis Hayata.)、滇越金線蘭 (Anoectochilus chapaensis Gagnep.)、齒唇蘭 (Anoectochilus lanceolatusLindl.)、西南齒唇蘭 [Anoectochilus elwesii (Clarke ex Hook.f.) King & Pantl.]、艷麗齒唇蘭 [Anoectochilus moulmeinensis (Par. & Rchb.f.) Seidenf.] 等 5 種開唇蘭屬植物也被證實具有一定藥用價值[7],但是否能夠作為金線蘭的替代品,仍待進一步研究。
2 中國野生資源分布
金線蘭具有環境適應性差、自然生長緩慢、天然繁殖率低的特點。在我國分布在福建、浙江、廣西、廣東、江西、四川、云南、貴州、海南、湖南、西藏等省份,尤其以東南省份福建、浙江居多。總體而言,針對金線蘭進行資源普查的省份較少,只有福建、廣西、浙江、貴州及廣東等對金線蘭進行資源調查。但是可以確定各省的金線蘭均處于瀕危狀態,主要分布在常綠落葉闊葉林、竹林及谷溝陰濕處。福建省作為金線蘭的主產地之一,全省境內均有金線蘭的分布,同時也有浙江金線蘭分布。福建省內野生金線蘭存在兩種形態,一種葉片具網狀花紋,而另一種葉片則無網紋。經花器解剖和理化鑒定,確定兩種形態均為金線蘭[8]。
民間將葉片具網狀金紅色葉脈的金線蘭稱為“金線蘭母”,該形態數量較多;而葉片無網狀葉脈的金線蘭被稱為“金線蘭公”,數量較少,二者往往以伴生形式生長。福建野生金線蘭主要棲息于海拔 350~950 m 山地之間的竹林、闊葉林或竹闊混生林,通常零星分布在枯枝落葉層或溝邊沖積處。據 2016 年調查,學者通過走訪調查和實地考察相結合,在閩東適合金線蘭生長的代表性山區找到了具有野生金線蘭生長的 28 個樣地,平均每 2 000 m2 樣地內野生金線蘭數量僅為 28 株,并且呈現逐年減少的趨勢[9]。
廣西省除西部石灰巖地區外,大部分常綠闊葉林地區都有金線蘭分布。雖分布區域廣,但數量十分有限。主要棲息于高郁閉度、光照強度在 350 ~2 000 lx之間,空氣相對濕度在 70%~85%之間的山澗常綠闊葉林的枯枝落葉層和腐殖質層中。
喬木覆蓋度可達 70%~90%,樹種主要包括殼斗科、桑科、樟科、木蘭科、五加科植物。除常綠闊葉樹林外,毛竹針葉樹混交林及灌叢也有分布[10]。浙江省與福建省類似,自北向南均有金線蘭和浙江金線蘭分布,但二者都處于瀕危狀態,部分居群小于 5 株。山陰面常綠闊葉林下分布較多。當林下土壤團粒結構好、具有較高含量的速效磷、速效鉀及水解性氮時,金線蘭分布可連成片。但在巖石和苔蘚上零星分布的金線蘭則往往植株矮小、獨立生長、未能成片[11]貴州省已報道分布有金線蘭和臺灣銀線蘭,主要在興義、安龍、望謨等地的喀斯特山區,分布海拔在 300~1 200 m,尤以 300~600 m 區間分布最多[12]。
主要棲息在郁閉度達到 80%以上的亞熱帶次生性常綠闊葉落葉混交林,濕度在80%~95%之間,腐殖質土厚度可達 10~20 cm,并具有較好的透水、透氣性[13]。此外,廣東省肇慶地區也有報道金線蘭和臺灣銀線蘭分布[14]。主要分布于海拔 200~800 m 的針闊葉混交林下,其自然居群中已不足 15 株,屬于當地瀕危物種[15],且長勢與土層的厚度無相關性。
3 資源鑒定金線蘭暫未列入
《中國藥典》,因此缺乏國家統一的質量控制標準與管理規范,不同地方標準存在較大差異與不足,造成市場缺乏有效監管,質量控制把關以及藥材來源追溯困難。隨著色譜與分子測序等技術的發展,金線蘭與近似種的鑒定手段愈加豐富,鑒定的準確度和速度均得到較大提升,如化學成分鑒別、分子標記法等,此外,將多種鑒定技術相結合也成為當前鑒定的一大趨勢。
3.1 形態特征及顯微鑒定技術
市面上普遍存在金線蘭與其他種混用的現象,主要混淆品包括金線蘭近屬植物,如血葉蘭;或同屬不同種植物,如浙江金線蘭、滇越金線蘭等。不同屬植物基本可以從莖、葉等外觀形態加以區分,而同屬不同種的植物則更難鑒定,除了葉片形態、顏色、葉脈,往往還需要利用花形加以區分。形態及顯微鑒定技術是指通過肉眼或顯微鏡觀察外部形態或內部細胞及細胞內含物形態的技術。
主要鑒別點包括葉片與葉脈的顏色;花瓣顏色、唇瓣是否倒置、萼片顏色等[16]。 歸納了葉的主要鑒別點,如根據葉色,金線蘭、浙江金線蘭、西南齒唇蘭等為較獨特的黑紫或綠紫色,區別于其余種的暗綠色;根據葉脈顏色可區分金線蘭(金紅色網紋)與臺灣銀線蘭、恒春銀線蘭(白色);此外,金線蘭的中葉脈下表面呈半圓形凸出,滇越金線蘭與臺灣銀線蘭兩種植物的則呈微凸[17]。
以唇瓣為例,除屏邊金線蘭外,其余幾種金線蘭唇瓣均未倒置。而利用唇瓣是否伸出于兩側萼片基部之外則可將臺灣銀線蘭、恒春銀線蘭與齒唇蘭、西南齒唇蘭、艷麗齒唇蘭進行區分;還可通過萼片顏色區分金線蘭(紅色)與西南齒唇蘭(綠色或白色)。盡管形態及顯微鑒定是最直觀、最直接的鑒定技術,但對于易混淆品,如金線蘭與浙江金線蘭,仍存在鑒定準確性低、鑒定難度大的問題,且對未開花植株的鑒定存在較大限制。
3.2 化學鑒定技術
化學成分鑒別是指利用化學手段,基于藥材化學成分種類與含量的差異進行鑒定的技術。金線蘭中最常用的化學鑒定技術是指紋圖譜技術。其不僅可用于金線蘭真偽品的鑒定,甚至可區分不同種質及種植方式的金線蘭。通過建立組培、栽培及野生金線蘭的化學指紋圖譜,發現以金線蓮苷為代表的強極性區峰的數量包括響應各種栽培方式間無顯著差異。
而在其他糖苷類出峰的極性區,栽培和野生金線蘭的峰響應高于組培種;在蘆丁、水仙苷等出峰的中極性區,栽培種峰響應顯著高于野生與組培種;在弱極性區,栽培品的槲皮素、山柰酚峰響應最高,組培的最低,最后通過比較金線蘭、臺灣銀線蘭與血葉蘭的指紋圖譜,發現金線蘭與臺灣銀線蘭在一定程度上可互相替代;而血葉蘭成分存在較大差異,因此不可作為金線蘭的替代品[18]。此外,為提高鑒定準確度,還可采取將多種鑒定技術相結合方式。
Gao 等[19]發現利用蛋白質組學及表面增強激光解吸電離-飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)指紋圖譜,可解決 ITS 無法鑒定到種的問題,從而對福建、臺灣、西藏、云南采集的野生開唇蘭屬及斑葉蘭屬共 5 個種的植物進行物種鑒定與區分。化學鑒定可在一定程度上彌補顯微鑒定的不足,但由于化學成分隨組織發育時間與空間而變化,因而化學鑒定技術易受時空等環境因素影響。
3.3 分子標記技術 分子標記技術是一種通過檢測生物體在基因或基因型上所產生的變異來反映生物個體之間差異的方法,其最大的特點在于可不受組織發育時間與空間的限制,不受環境的影響,穩定性較高。常見的如限制性片段長度多態性技術(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、隨機擴增多態性 DNA標記技術(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、簡單重復序列間區(intersimplesequence repeat, ISSR)、擴增片段長度多態性(amplified fragment lengthpolymorphism, AFLP)、單鏈構象多態性(single strand conformation polymorphism,SSCP)等。
隨著分子生物學及測序技術的快速發展,以及測序成本的降低,越來越多的分子標記相關技術被用于藥用植物的鑒定[20,21]。分子標記技術不僅可對不同產地和不同培養方式的金線蘭的遺傳特征進行分析,從而實現對其分類與鑒定[22-24],還可以檢測不同產地的野生金線蘭及其近似種的多樣性[25]。由于分子標記技術建立于大量樣本之上,且成本較高,因此,現有分子標簽的區分效果仍有待進一步驗證,相較于農作物,分子標記技術在金線蘭中應用仍處于初級研究階段。目前,學者正致力于開發更簡便、高效的標記技術[26],使分子標記技術更準確地應用于金線蘭的種質資源鑒定。
4 化學成分特征及其藥理活性
金線蘭中已鑒定出上百種化合物,主要包括黃酮、黃酮苷、有機酸、甾體、萜類、生物堿等,其中 60 余種已分離得到,其余均通過定性或定量方法被檢測到。不同化學成分決定了金線蘭多方面的藥理作用,包括肝臟保護、降血糖、抗炎、抗氧化、鎮痛等。但由于野生金線蘭資源瀕危,且市場價格極高,因此,除少數體外酶活實驗外,幾乎沒有藥理實驗采用野生金線蘭作為實驗材料,多采用組培或人工種植苗。
4.1 金線蓮苷及其類似物
金線蓮苷(kinsenoside; C10H16O8;3-(R)-3-β-Dglucopyranosyloxybutanolide)最早于1993 年由日本學者從蘭科開唇蘭屬植物恒春銀線蘭(Anoectochilus koshunensis)中分離[27],是由 3-(R)-羥基-γ-丁內酯與 βD-吡喃葡萄糖經過糖苷鍵連接而成。隨著研究的深入,陸續從其他物種中檢測出金線蓮苷,主要包括開唇蘭屬的金線蘭和臺灣銀線蘭等;其他屬的如番紅花(Crocus sativus L.)、斑葉蘭(Goodyera schlechtendaliana Rchb. F.)等。除金線蓮苷外,還從金線蘭中分離得到部分金線蓮苷類似物,包括 4-β-D-吡喃葡萄糖氧基-丁酸甲酯[28]、kinsenbenol[29]、kinsendioside A、kinsendiosideB[30]、(S)-3-O-對羥基芐基-γ-丁內酯、(S)-3-羥基-γ-丁內酯[31]、金線蘭素 A[32]。
作為金線蘭中含量最高的活性成分,金線蓮苷具有顯著的降血糖、肝臟保護活性。研究表明,金線蓮苷可以提高鏈脲佐菌素致糖尿病大鼠的糖耐量,修復胰島損傷細胞并改善其功能,從而發揮治療糖尿病的功效[33]。金線蓮苷還具有 PTP1B抑制活性,有望作為潛在的 PTP1B 抑制劑,用于治療Ⅱ型糖尿病[34]。
Xiang 等[35]通過半刀豆球蛋白 A 誘導小鼠 T 細胞介導的肝炎模型,發現金線蓮苷可以顯著改善自發免疫性肝炎,降低炎癥細胞浸潤和促炎因子的生成。通過靶向VEGFR2 誘導對自身免疫性肝損傷的免疫抑制,減少代謝相關 PI3K-AKT 和炎癥相關 JAK2-STAT3 通路相互作用,從而破壞樹突細胞誘導的 CD8+T 細胞反應的交叉啟動。此外,金線蓮苷還可以有效保護視網膜色素上皮細胞免受過氧化氫誘導的氧化應激引起的調亡,并通過抑制 p65、Erk 和 p38 的表達,減少凋亡相關血管生成[36]。
4.2 黃酮及其苷類
黃酮類化合物可以清除氧自由基,屬于強氧化劑,其具有廣泛的藥理活性,如異鼠李素具有心腦血管保護、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、預防肥胖等藥理作用[37]。槲皮素可以抗糖尿病、抗肥胖、抗炎、改善循環功能障礙和情緒障礙[38]。
而蘆丁具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗腫瘤、降血糖、抗過敏等功效[39]。金線蘭中黃酮、黃酮苷類成分眾多,分離得到的黃酮及其苷類化合物包括 8-對羥基芐基槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3'-O-葡萄糖苷、異鼠李素[40]、槲皮素、5,4′-二羥基-6,7,3′-三甲氧基黃酮[29]、蘆丁、水仙苷、山柰酚-7-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-7-O-葡萄糖苷、5-hydroxy-3',4',7-trimethoxyflavonol-3-O-β-D-rutinosid 、 quercetin-7-O-β-D-[6''-O-(trans-feruloyl)]-glucopyranoside[41]、5,6,3',4'-tetrahydroxy-7,5'-trimethoflavonol-3'-O-glucoside、kaempferol-3-O-(6''-p-coumaroyl)-glucoside、山柰酚、quercetin-3,4'-dimethylether[42]、槲皮素-7-O-D-葡萄糖苷、槲皮素 3-O-β-D-蕓香糖苷、異鼠李素-3,4'-O-β-D-二葡萄糖苷、異鼠李素-3,7-O-β-D-二葡萄糖苷、異鼠李素-7-O-β-D-二葡萄糖苷[43]、roxburoside[30]、鼠李秦素、鼠李秦素-3-O-葡萄糖苷[31]、山柰酚-7-O-吡喃葡萄糖-(1-3)-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-α-L-鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖-(1-3)-吡喃葡萄糖苷[32]。
4.3 有機酸及其糖苷 從金線蘭中分離出有機酸及揮發性物質包括軟脂酸、硬脂酸、琥珀酸[28]、香豆酸[40]、阿魏酸[29]、棕櫚酸[44]、4-羥基肉桂酸、3-羥基肉桂酸、2-羥基肉桂酸、5-hydroxyferulic acid[42]、十六烷酸-2,3-二羥基丙酯[31]、丁香酸-4-O-葡萄糖苷、Z-香豆酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、Z-阿魏酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。其中代表性成分,如琥珀酸在抑菌、抗驚厥、鎮痛等方面具有顯著療效;香豆酸在抗血小板活化、抗腫瘤、免疫抑制等方面顯示出明顯的藥理作用;阿魏酸同樣具有抗氧化、抗病毒、抗菌活性,還可以抗輻射[44]。
5 繁育技術
金線蘭在降血糖、抗肝癌、抗炎等方面具有良好功效,近年來,隨著金線蘭產業規模不斷擴大,市場價格逐年升高,作為保健品及中藥風靡的福建省、臺灣省,成為我國發展較快的中藥材[54]。過去的過度開采與不重視,加之自然競爭力差,而且金線蘭種子必須依靠與真菌共生才可萌發,且萌發率低,造成野生金線蘭資源稀缺,供不應求。因此,目前市場上流通的金線蘭主要來自于人工繁育。過去由于技術受限,金線蘭始終無法實現人工繁育,隨著無菌栽培與組織培養等技術的發展,成功解決了金線蘭人工繁育的問題。金線蘭人工繁育技術主要包括人工培養基培養、設施栽培、仿野生栽培以及菌根栽培。
5.1 人工培養基培養
人工培養基培養是指利用無菌技術將植物在人工配制的富含營養物質的培養基中繁殖的技術。金線蘭的人工培養基培養根據是否存在兩性生殖細胞結合為受精卵,可分為無性繁殖培養和有性繁殖培養。
無性繁殖通常選擇滅菌的幼嫩莖段、莖尖或原球莖作為無性繁殖的外植體,此方法將外植體誘導成健壯的成苗往往只需要 4~5 個月時間,是金線蘭產業化最主要的手段[55,56]。雖然金線蘭的無性繁殖技術已相當成熟,但大規模無性繁殖后,出現種植退化嚴重、抗逆性差、化學成分減少等問題。相較于無性繁殖技術,采用種子繁殖的有性繁殖技術具有繁殖數量大、實生苗抗逆性強、存活率高等特點,因此,采用有性繁殖技術對其資源進行優化顯得尤為重要。
金線蘭有性繁殖目前僅在實驗室中進行,并未實現大規模生產,主要原因在于有性繁殖存在種子萌發率低、萌發時間過長等問題[57]。人工培養基培養的成功與否主要與兩個因素有關:①外植體或種子的消毒方式。不同的外植體或種子的消毒條件不同,一般以 75%乙醇浸泡 30 s + 0.1% 升汞浸泡 8~16 min[58,59]。也有研究發現,在升汞中加入 Tween 可以明顯降低污染率[60]。②適宜的培養基。
6 金線蘭保護策略及發展建議
6.1 明確野生資源現狀與動態變化 金線蘭分布于我國長江以南十余個省份,其中僅有半數省份對其進行了資源調查,其余省份野生資源情況仍未知。因此,首先需要明確各省金線蘭的野生資源現狀,包括其分布范圍、種群數量、地理位置等,然后通過定期對代表性地點居群進行樣方調查,了解當地金線蘭資源動態變化,最終建立金線蘭全國種質庫,對金線蘭標本進行保藏與繁育。
6.2 保護金線蘭野生資源 隨著人類活動范圍的增大,導致部分低海拔地區的野生金線蘭居群環境發生改變,造成物種消失。
同時,近些年隨著金線蘭價格提升迅速,當地居民逐漸意識到金線蘭的市場價值,因此金線蘭作為連年被采挖的植物,野生資源陷入匱乏階段。建立金線蘭自然生態保護區,保存金線蘭及其周邊生態系統,為開展生物科學研究提供良好的基地。同時提高當地居民對金線蘭生態保護意識,加強自然保護區監管力度,遏制破壞野生金線蘭資源的行為。
6.3 完善金線蘭人工繁育體系 通過無性、有性等多途徑對金線蘭進行人工繁育研究,完善金線蘭人工繁育體系。金線蘭無性繁殖技術已較成熟,但活性成分是否改變、種質是否退化等問題亟待明確與驗證。因此,為獲得優質金線蘭,對現有繁育技術的完善迫在眉睫。另一方面,有性繁殖困難急需突破,主要圍繞種子萌發率低,萌發時間過長等問題。同時,通過篩選優良種質及促生菌株,力求盡快將有性繁殖技術融入現有人工繁育體系內,實現產業技術升級,達到優質高產。
6.4 開展高質量基礎研究 基礎研究的突破可以對實際應用提供重要參考與啟發。因此,金線蘭基礎研究應予以重視。主要包括四方面內容:①我國開唇蘭屬植物資源考察;②金線蘭有性繁殖技術及野生撫育;③金線蘭生長發育的分子機制;④金線蘭藥效物質基礎。
7 小結
本文從我國金線蘭的本草考證、資源分布、資源鑒定、化學成分特征與藥理活性、繁育技術五方面進行綜述,旨在為金線蘭種質資源保護提供參考,促進金線蘭質量標準的建立與統一,進而推動金線蘭產業的可持續發展。作為名貴的蘭科藥用植物,金線蘭降血糖、抗炎等藥效顯著,但其野生資源不足,人工培養基組培苗是目前市場主要流通品種。而組培苗由于栽培環境及培養條件差異,導致種質退化問題嚴重,并且與野生金線蘭存在化學成分差異,且藥效物質不明,因此人工品種能否完全替代野生金線蘭,仍待進一步研究。
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同時,不同地區金線蘭種質資源差異較大,導致藥效物質含量及藥效參差不齊。自然條件下,金線蘭與真菌共生,但其分子機制尚未明確,且不同促生菌的作用方式及作用時間不同,甚至存在多種促生菌協同作用,給該問題的研究帶來更大挑戰。因此,明確金線蘭生長發育特點及營養需求,進而篩選出優良種質及促生菌株,以便快速開展有性繁殖技術研究,建立菌根栽培體系。并強化種植產區的環境保護,從而更好將有性繁殖技術及菌根栽培技術應用到實際生產中。在此基礎上,實現金線蘭資源可持續利用以及優質高產規模化生產,為國家大健康產業發展提供物質基礎。
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作者:呂欣鍇,周麗思*,郭順星