摘要以萘普生(NPX)為前體，分別與芳基釕(Ru)、鋨(Os)及銥(Ir)二聚體反應(yīng)制備了3個單核配合物[Ru(η6-p-cymene)(NPX-bpy)Cl]Cl(1)，[Os(η6-p-cymene)(NPX-bpy)Cl]Cl(2)和[Ir(η5-Cp*)·(NPX-bpy)Cl]Cl(3).利用元素分析、電噴霧質(zhì)譜和核磁共振波譜對3個配合物的組成和結(jié)構(gòu)進行了表征，并研究了其細(xì)胞毒性.結(jié)果表明，3個配合物對幾種腫瘤細(xì)胞株均無毒性(IC50>100μmol/L)，僅配合物1對NB-4細(xì)胞有中等程度的毒性(IC50=45.2μmol/L)，且毒性大于配合物2和3，這可能與配合物1在細(xì)胞核內(nèi)具有更高的富集量有關(guān).此外，3個配合物均可有效抑制COX-2的表達，保留了萘普生的抗炎性質(zhì)，實現(xiàn)了金屬配合物抗癌及抗炎的多功能化應(yīng)用.

　　關(guān)鍵詞芳基金屬;抗癌藥物;抗炎;環(huán)氧合酶

　　20世紀(jì)60年代，Rosenberg等[1]首次發(fā)現(xiàn)順鉑具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用，從此展開了鉑配合物在生物活性方面的研究.雖然鉑類藥物具有優(yōu)異的抗癌活性，但其毒副作用大、細(xì)胞耐藥性強等缺點也讓研究者將目光投向了非鉑類金屬配合物.近年來，已出現(xiàn)多種非鉑類抗腫瘤配合物，如釕(Ru)、銥(Ir)、鋨(Os)及銠(Rh)等金屬配合物也表現(xiàn)出不同程度的抗癌活性[2～6].由Keppler等[7]研發(fā)的KP1019以及Alessio等[8～10]開發(fā)的NAMI-A已進入臨床試驗階段.這可能是由于配合物RuⅢ在體內(nèi)被還原成RuⅡ，RuⅡ會與DNA結(jié)合并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[11～14].

　　醫(yī)藥方向評職知識：醫(yī)藥衛(wèi)生論文怎么發(fā)表科技核心

　　Sadler等[15～18]在釕、銥及鋨等非鉑類配合物的抗癌研究方面做出了開創(chuàng)性工作，并受到廣泛關(guān)注.Dyson等[19～21]在芳基金屬配合物用于抗腫瘤研究方面也做出了貢獻.研究[19]表明，非鉑類尤其是帶有芳基的金屬配合物具有與順鉑不同的作用靶點及抗癌機制，在很大程度上克服了順鉑毒副作用大及耐藥性強等缺點，部分芳基金屬配合物的抗癌活性與目前臨床治療效果最好的順鉑相當(dāng)甚至超過順鉑.目前，該領(lǐng)域的研究熱點包括發(fā)現(xiàn)抗腫瘤新靶點、設(shè)計高效低毒抗腫瘤藥物及靶向性藥物等.

　　本課題組近年來一直致力于芳基金屬(釕、銥、鋨及銠等)配合物的合成及其在抗腫瘤方面的應(yīng)用和機理研究，提出了綜合考慮抗癌機制與致癌機制相似性的理論雛形[22～24]，為抗癌化學(xué)療法的研究提供了新的思路，還通過改變配體上的取代基以調(diào)控金屬配合物的抗癌活性[25～27].除抗癌方面的研究外，芳基金屬配合物因其獨特的半夾心結(jié)構(gòu)而作為前驅(qū)體被廣泛用于多核環(huán)狀及籠狀配合物的構(gòu)建[28]，金國新等[29，30]以芳基金屬配合物為構(gòu)筑單元，組裝出多種具有特殊結(jié)構(gòu)與功能的多核配合物，實現(xiàn)了芳基金屬配合物的結(jié)構(gòu)多樣化.

　　本課題組[31]選擇具有抗癌、抗菌等活性的天然產(chǎn)物甘草次酸為有機導(dǎo)向分子，將其連接到芳基釕配合物上，實現(xiàn)了2種芳基金屬配合物良好的抗癌和抗菌性質(zhì).研究[32]表明，炎癥與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)，并且持續(xù)性的炎性微環(huán)境可通過觸發(fā)特定的基因突變來誘發(fā)腫瘤產(chǎn)生，因此，通過控制炎癥達到治療癌癥的目的成為科學(xué)家們研究的重要方向[33].萘普生(NPX)作為一種臨床用于解熱鎮(zhèn)痛的非甾體抗炎藥及合成酶抑制劑，主要用于治療風(fēng)濕性/類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎及強直性脊椎炎等疾病.萘普生主要通過抑制前列腺素的合成而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用，即抑制COX-1和COX-2兩種形式環(huán)氧酶的活性，從而影響血管生成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移及炎癥反應(yīng)等生理過程[34].

　　Mandal等[35，36]將萘普生連接到鉑(Ⅳ)、芳基釕、環(huán)金屬釕和錸(Re)等金屬配合物上，實現(xiàn)了金屬配合物抗癌和抗炎的雙功能化應(yīng)用.本文通過橋聯(lián)配體4-(4'-甲基-2，2'-聯(lián)吡啶)-甲胺，將萘普生連接到芳基金屬配合物上，不僅保留了萘普生的抗炎功能，并通過結(jié)合具有生理活性的小分子實現(xiàn)了芳基金屬配合物的多功能化應(yīng)用.此外，通過紫外-可見吸收光譜比較了釕、銥及鋨3個配合物的水解能力，利用圓二色譜和瓊脂糖凝膠電泳研究了配合物與DNA的作用方式，并初步探討了3個配合物對幾種腫瘤細(xì)胞株的抗癌活性.

　　1實驗部分

　　1.1試劑與儀器

　　常用試劑和溶劑均來自南京師范大學(xué)危險品庫;芳基釕、銥和鋨二聚體、萘普生購于希恩思生化科技有限公司;1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDCI)和1-羥基苯丙三唑(HOBt)購于安耐吉化學(xué)試劑公司;光譜測試所用溶劑購于Aldrich公司;超純水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備;生物實驗所用瓊脂糖、pBR322質(zhì)粒、小牛胸腺DNA、溴化乙錠、溴酚藍及磷酸鹽緩沖液等購于上海生物工程公司;實驗用細(xì)胞分別為宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)、人卵巢癌細(xì)胞(A2780)和人急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞(NB-4)購于美國模式菌種收集中心(ATCC).

　　核磁共振波譜在AVANCE400型核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)上采集;元素分析由VarioELⅢ型元素分析儀(德國Elementa公司)完成;電噴霧質(zhì)譜采用南京大學(xué)分析測試中心的電噴霧LCQFLEET質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)測定;紫外-可見吸收光譜采用Lambda365型分光光度計(美國PerkinElmor公司)測試;熒光光譜由F-4600型熒光分光光度計(日本日立公司)記錄;圓二色光譜(CD)信號采用Chriascan型圓二色譜儀(英國AppliedPhotophysics公司)測定.瓊脂糖凝膠電泳實驗采用DYY-12型電腦三恒多用電泳儀(北京市六一儀器廠)，并通過Bio-RADChemiDoxXPS系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)成像.

　　1.2實驗過程

　　1.2.1

　　4-(4'-甲基-2，2'-聯(lián)吡啶)-甲胺的合成參照文獻[37]方法合成4-(4'-甲基-2，2'-聯(lián)吡啶)-甲胺.在氬氣氣氛下，將4.4gSeO2(39.8mmol)與5.2g4，4'-二甲基-2，2'-聯(lián)吡啶(28.5mmol)加入到300mL1，4-二氧六環(huán)溶液中，回流反應(yīng)24h后，趁熱過濾，減壓除去溶劑.加入50mL飽和NaHCO3溶液，用CH2Cl2萃取，減壓除去溶劑.

　　然后，向體系中加入0.3mol/LNa2S2O5溶液，攪拌30min后，減壓抽濾，濾液用Na2CO3調(diào)節(jié)pH≈10，用CH2Cl2萃取，合并有機相，減壓除去溶劑，經(jīng)真空干燥得到白色固體產(chǎn)物4-甲基-4'-甲醛-2，2'-聯(lián)吡啶(產(chǎn)率為76%)，直接用于下一步反應(yīng).將2.4g4-甲基-4'-甲醛-2，2'-聯(lián)吡啶(12.1mmol)、3.0g鹽酸羥胺(43.2mmol)和8.0gK2CO3(57.9mmol)溶解于甲醇/水混合溶液中，于80℃回流反應(yīng)1h，冷卻至室溫后加入冰水，得到白色固體沉淀，過濾，用水洗滌經(jīng)真空干燥得白色固體產(chǎn)物4-甲基-4'-甲醛肟-2，2'-聯(lián)吡啶(產(chǎn)率為85%)，直接用于下一步反應(yīng).

　　將2.1g4-甲基-4'-甲醛肟-2，2'-聯(lián)吡啶(9.8mmol)、1.9gCH3COONH4(25mmol)及30mL氨水溶解于乙醇/水混合溶液中，加熱回流反應(yīng)30min，再加入2.8gZn粉(50mmol)，繼續(xù)反應(yīng)3h，冷卻至室溫，過濾，減壓除去溶劑，加入NaOH，有白色固體析出，用CH2Cl2萃取，合并有機相，減壓除去溶劑，經(jīng)真空干燥得產(chǎn)物4-甲基-4'-甲胺-2，2'-聯(lián)吡啶(產(chǎn)率為83%).1HNMR(400Hz，CDCl3)，δ:8.60(d，1H，)，8.52(d，1H)，8.32(s，1H)，8.23(s，1H)，7.30(d，1H)，7.15(d，1H)，4.02(s，2H)，2.48(s，3H).

　　1.2.2配體NPX-bpy的合成

　　在氬氣氣氛下，將0.58g萘普生(2.5mmol)、0.58gEDCI(3.0mmol)、0.41gHOBt(3.0mmol)及0.60g的4-(4'-甲基-2，2'-聯(lián)吡啶)-甲胺(3.0mmol)溶解于20mL二甲基甲酰胺中，室溫下攪拌5h，用薄層層析法(TLC)跟蹤反應(yīng)至結(jié)束.向反應(yīng)體系中加入適量水，有大量白色沉淀生成，減壓抽濾得到粗產(chǎn)物，經(jīng)柱層析分離純化(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH體積比為30∶1)，即得0.65g較純的配體NPX-bpy，產(chǎn)率65%.1HNMR(400MHz，CDCl3)，δ:8.50(dd，J=17.8，5.0Hz，2H)，8.18(s，2H)，7.82～7.57(m，3H)，7.42(dd，J=8.5，1.8Hz，1H)，7.13(ddd，J=10.8，6.8，2.4Hz，3H)，7.06(dt，J=5.4，2.7Hz，1H)，5.93(t，J=5.5Hz，1H)，4.46(d，J=6.1Hz，2H)，3.91(s，3H)，3.85～3.76(m，1H)，2.43(d，J=3.7Hz，3H)，1.64(d，J=7.2Hz，3H).ESI-MS(+)，m/z:理論值412.50;實驗值412.42.

　　1.2.3配合物

　　[Ru(η6-p-cymene)(NPX-bpy)Cl]Cl(1)的合成將41.2mgNPX-bpy配體(0.1mmol)加入到20mL含30.6mgRu2(η6-p-cym)2Cl4(0.05mmol)的CH3OH溶液中，常溫下攪拌反應(yīng)24h后，將溶液減壓濃縮至近飽和狀態(tài)，加入適量乙醚，離心即得相應(yīng)的芳基釕配合物1，產(chǎn)率84.0%.RuC36H39N3O2Cl2(H2O)2元素分析(%)，理論值:C57.37，H5.75，N5.58;實驗值:C56.59，H5.55，N5.55.1HNMR(600MHz，CDCl3)，δ:9.21(s，1H)，9.05～8.96(m，1H)，8.95～8.84(m，1H)，8.62(d，J=6.7Hz，1H)，8.25(d，J=25.1Hz，1H)，7.89(d，J=12.3Hz，1H)，7.70～7.58(m，3H)，7.48～7.39(m，1H)，7.30(s，1H)，7.03(d，J=5.7Hz，2H)，6.05(d，J=5.2Hz，1H)，5.94(d，J=4.3Hz，1H)，5.89(s，1H)，5.76(d，J=5.8Hz，2H)，4.54(s，3H)，4.24(m，J=13.7，6.9Hz，1H)，3.87(d，J=1.5Hz，3H)，3.47(q，J=7.0Hz，2H)，2.47～2.38(m，3H)，2.21(d，J=12.7Hz，3H)，1.56(dd，J=10.5，7.0Hz，3H).ESI-MS(+)，m/z:理論值:682.24[1-Cl-]+，實驗值:682.50[1-Cl-]+.

　　1.2.4配合物

　　[Os(η6-p-cymene)(NPX-bpy)Cl]Cl(2)的合成將82.0mg配體NPX-bpy(0.2mmol)加入到30mL含80.0mgOs2(η6-p-cym)2Cl4(0.1mmol)的CH3OH溶液中，常溫下攪拌反應(yīng)48h后，將溶液濃縮至近飽和狀態(tài)，加入乙醚，析出沉淀，分別用丙酮和乙醚洗滌沉淀3次，離心，經(jīng)真空干燥得芳基金屬鋨配合物2.基于所消耗的Os(Ⅱ)二聚體的量，收集淺黃色產(chǎn)物，產(chǎn)率為82.3%.OsC36H39N3O2Cl2·(H2O)2元素分析(%)，理論值:C51.35，H5.15，N4.99;實驗值:C50.92，H4.95，N4.99.

　　1HNMR(400MHz，CDCl3)，δ:9.57(d，J=6.0Hz，1H)，9.06(s，1H)，8.95(dd，J=12.2，4.9Hz，1H)，8.75(d，J=17.3Hz，1H)，8.28(s，1H)，7.91(d，J=8.5Hz，1H)，7.66(ddd，J=27.2，12.9，5.2Hz，3H)，7.39(dd，J=11.6，5.4Hz，1H)，7.02(d，J=5.3Hz，2H)，6.00～5.87(m，2H)，5.78(d，J=4.6Hz，2H)，4.53(d，J=5.3Hz，2H)，4.28(m，J=13.1，6.5Hz，1H)，3.86(s，3H)，2.42(dd，J=10.3，2.3Hz，3H)，2.21(d，J=8.1Hz，3H)，1.57(t，J=6.8Hz，3H).ESI-MS(+)，m/z:理論值:771.40[2-Cl-]+，實驗值:772.50[2-Cl-]+.

　　1.2.5配合物

　　[Ir(η5-Cp*)(NPX-bpy)Cl]Cl(3)的合成將41.2mgNPX-bpy配體(0.1mmol)加入到15mL含39.8mgIr2(η5-C5Me5)2Cl4(0.05mmol)的CH3OH溶液中，常溫下攪拌反應(yīng)24h后，將溶液濃縮至近飽和狀態(tài)，加入乙醚，析出沉淀，分別用二氯甲烷、丙酮和乙醚各洗滌3次，經(jīng)離心得到芳基金屬銥配合物3.基于所消耗的Ir(Ⅱ)二聚體的量，收集淺黃色產(chǎn)物，產(chǎn)率為81.4%.IrC36H40N3O2Cl2·(H2O)1.5·O2元素分析(%)，理論值:C49.76，H4.99，N4.84;實驗值:C49.58，H4.97，N4.83.1HNMR(400MHz，DMSO)，δ:8.96(dd，J=13.1，6.0Hz，1H)，8.86～8.71(m，2H)，8.54(d，J=13.0Hz，1H)，8.40(d，J=22.8Hz，1H)，7.83～7.71(m，3H)，7.67(d，J=5.8Hz，1H)，7.60～7.46(m，2H)，7.27(d，J=2.3Hz，1H)，7.11(ddd，J=8.9，2.5，1.1Hz，1H)，4.54(s，2H)，3.94(q，J=7.1Hz，1H)，3.86(d，J=1.0Hz，3H)，2.57(s，3H)，1.68～1.55(m，15H)，1.48(d，J=7.0Hz，3H).ESI-MS(+)，m/z:理論值:774.39[3-Cl-]+;實驗值:774.50[3-Cl-]+.

　　1.3配合物的熒光光譜測定

　　分別將配合物1～3溶解在體積分?jǐn)?shù)為5%的DMSO水溶液中，確定溶液終濃度為50μmol/L.用熒光光譜儀測定溶液的發(fā)射光譜，并以270nm為激發(fā)波長，測定3個配合物在450～800nm的熒光光譜.

　　1.4配合物的脂水分配系數(shù)測定

　　通過搖瓶法測定配合物的脂水分配系數(shù).將3個配合物分別溶于水相、有機相(正辛醇)中，恒溫水浴條件下輕微振蕩一定時間，然后離心分離.分別取上、下層溶液用紫外-可見分光光度計檢測水相與有機相中配合物的吸光度，并進行計算.脂水分配系數(shù)lgPO/W值通過配合物在有機相和水相中濃度的比值取對數(shù)獲得.

　　1.5配合物的水解實驗

　　用紫外-可見光譜測定配合物1～3中離去基團(Cl-)的水解程度.將配合物溶解在體積分?jǐn)?shù)為5%的DMSO水溶液中，確定配合物溶液的終濃度為50μmol/L.采用UV-Vis光譜測定配合物1～3的水解穩(wěn)定性，將比色皿置于雙通道紫外分光光度計中，扣除背景吸收，于298K下每15min采集一組250～800nm處的吸光度值數(shù)據(jù)，共跟蹤測試24h.

　　1.6配合物與CT-DNA的相互作用分析

　　圓二色光譜(CD)是一種光學(xué)分析手段，可用于研究DNA、牛血清白蛋白(BSA)等手性分子隨外界條件(如溫度、離子強度和pH)變化而導(dǎo)致的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，也是研究DNA與配合物相互作用的有力工具[38].

　　用5mmol/L磷酸鹽(PBS)緩沖液配制一系列DNA堿基對濃度為100μmol/L的儲存液，分別加入不同濃度的配合物，配合物與堿基對的濃度比r(r=[complex]/[CT-DNA])分別為0，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40.將配合物與DNA于37℃水浴中共孵育24h后進行測試，測試溫度298K，波長掃描范圍200～600nm，掃描速度100nm/min，狹縫寬度1nm.此外，瓊脂糖凝膠電泳法也常用來檢測配合物與DNA的結(jié)合.用5mmol/LPBS緩沖液配制一系列不同濃度比r(r=[complex]/[pBR322])的質(zhì)粒DNA與3個配合物的反應(yīng)液，其中質(zhì)粒DNA的濃度為10μmol/L，將反應(yīng)液于37℃水浴中孵育24h后，向樣品中加入6×loadingbuffer(體積分?jǐn)?shù)0.05%溴酚藍+50%甘油+2mmol/LNa2H2EDTA)，點樣于0.8%瓊脂糖凝膠中，置于電泳緩沖液(40mmol/LTris-acetate+1mmol/LEDTA，pH=8.3)中在70mA恒定電流下電泳90min，用1.0μg/mL溴化乙錠(EB)染色30min，凝膠成像系統(tǒng)分析得到電泳圖像.

　　1.7金屬元素的細(xì)胞攝取實驗

　　在6孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞密度達到80%后，分別用配合物1～3孵育細(xì)胞24h;消化收集細(xì)胞加入1.5mL離心管中，于1000r/min轉(zhuǎn)速下離心4min后棄去上層清液，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞1次;加入200μL細(xì)胞組織快速裂解液，混合均勻后于4℃靜置30min，待細(xì)胞充分裂解后于12000g轉(zhuǎn)速離心10min，測定上層清液中蛋白濃度.加500μL線粒體分離試劑，輕輕懸浮細(xì)胞，在冰浴中放置15min;把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到勻漿器中，勻漿20～30下;將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，在600g轉(zhuǎn)速和4℃下離心10min得到細(xì)胞核沉淀;將上層清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，在12000g轉(zhuǎn)速和4℃下離心10min，將上層清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，沉淀即為分離得到的細(xì)胞線粒體部分，其余部分則為細(xì)胞質(zhì)溶液.向得到的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及線粒體部分分別加入100μL濃硝酸，于95℃水浴中孵育2h，再加入50μL30%H2O2繼續(xù)于95℃孵育1.5h，最后加入50μL濃鹽酸于70℃水浴中孵育至體積小于50μL.用超純水將每管溶液體積補足至1mL，用ICP-MS光譜儀測定相應(yīng)的Ru，Os及Ir等元素含量.

　　2結(jié)果與討論

　　2.1配體和配合物的合成

　　配體和配合物的合成步驟如Scheme1所示.配體NPX-bpy由原料NPX與4-(4'-甲基-2，2'-聯(lián)吡啶)-甲胺通過經(jīng)典的酰胺化反應(yīng)合成得到，并經(jīng)柱層析分離得到較純的產(chǎn)物，其1HNMR數(shù)據(jù)見本文支持信息圖S1.配合物的合成是通過配體與相應(yīng)的Ru，Os及Ir二聚體以質(zhì)量比2∶1的投料比在常溫下攪拌反應(yīng)，并加入乙醚沉淀得到粗產(chǎn)品，經(jīng)重結(jié)晶后得到較純的配合物1～3，其1HNMR和ESI-MS結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)見本文支持信息.

　　2.2配合物的細(xì)胞毒性

　　通過噻唑藍(MTT)方法以順鉑(CDDP)為陽性對照物測定了配合物1～3對細(xì)胞株HeLa，A549，A2780及NB-4的細(xì)胞毒性.結(jié)果表明，配體NPX-bpy對4種腫瘤細(xì)胞均無毒性(IC50>200μmol/L)，并且配合物1～3對細(xì)胞HeLa，A549及A2780基本無毒性，遠遠低于順鉑的毒性;僅配合物1對白血病NB-4細(xì)胞具有中等強度的毒性(IC50=45.2μmol/L)，且毒活性大于配合物2和3，這可能與配合物1的水解性和在細(xì)胞核內(nèi)分布較多有關(guān).

　　2.3配合物的抗炎性能

　　環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸代謝生成前列腺素過程的限速酶，而前列腺素是產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的主要誘因.COX有COX-1和COX-2兩個亞型，其中COX-2是一種誘導(dǎo)酶，在組織損傷、炎癥等情況下表達增強.巨噬細(xì)胞暴露在細(xì)菌產(chǎn)物中，能誘導(dǎo)其發(fā)生顯著的表性變化、分泌大量的炎性因子和介質(zhì).據(jù)文獻[39]報道，NPX是一種COX-2抑制劑，因此，進一步研究了在4個濃度梯度下(10，30，50，100μmol/L)3個配合物對COX-2的體外活性抑制效果，并與NPX作了對照.

　　可見，NPX對COX-2有明顯的抑制作用，且隨著其濃度的增加COX-2的抑制率明顯增大，這與文獻[39]報道結(jié)果相符.當(dāng)配合物1～3與COX-2發(fā)生相互作用后，3個配合物對COX-2的抑制作用類似于NPX，且也與其作用濃度呈正相關(guān)性.這說明經(jīng)過芳基金屬配位后的NPX衍生物也可以有效抑制COX-2的表達，為新型的抗炎抗癌金屬藥物的開發(fā)提供了思路.為了探究配合物1～3在抗癌、抗炎等方面性能差異的原因，進一步研究了配合物的熒光、水解、脂水分配系數(shù)、配合物與CT-DNA的相互作用以及配合物的細(xì)胞攝取等性能.

　　2.4配合物的熒光性質(zhì)

　　據(jù)文獻[40]報道，NPX的發(fā)射波長為354nm，主要歸因于分子中心電荷的π*-π轉(zhuǎn)移.以270nm為激發(fā)波長，測試了3種配合物的熒光光譜，如圖3所示，配合物1～3的最大發(fā)射波長分別為545，545和546nm.與NPX相比，配合物的發(fā)射峰發(fā)生了大幅度紅移，這是由于金屬到配體的MLCT(金屬-配體電荷遷移)躍遷所致.

　　另外，配合物的熒光強度大小順序為配合物1>配合物2>配合物3，與金屬的d軌道電子在最高占有軌道(HOMO)的密度有關(guān).釕和鋨屬于同族元素，具有相同的最外電子排布，但是鋨原子半徑比釕的大;而釕和銥屬于同周期元素，具有不同的最外層電子數(shù)排布，因此可以解釋配合物1的熒光強度與配合物2和3有明顯不同[41].

　　2.5配合物的脂水分配系數(shù)

　　配合物在脂水兩相中具有不同的溶解度，其吸光度采用UV-Vis光譜測定.分別將配合物1～3在有機相與水相中于316與265nm處的吸光度相除，然后取對數(shù)得到3種配合物的脂水分配系數(shù)lgPO/W分別為0.62，-0.25和0.43，說明配合物1具有更高的親脂性，而配合物2親水性更好，親脂性順序為配合物1>配合物3>配合物2.Liu等[42]發(fā)現(xiàn)較好的親脂性更有利于配合物透過細(xì)胞的磷脂雙分子層，提高藥物的細(xì)胞攝取.因此，不同的親脂性可能導(dǎo)致配合物的細(xì)胞毒活性不同.

　　2.6配合物的水解性質(zhì)

　　芳基金屬配合物水解后可與DNA的堿基發(fā)生配位，從而影響DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制[43]，配合物的水解性質(zhì)與其細(xì)胞攝取、分布、作用機制、代謝和毒活性等藥理學(xué)性質(zhì)直接相關(guān)，因此研究配合物的水解性能對理解配合物的性質(zhì)非常重要.可見配合物1的水解性質(zhì)與配合物2和3完全不同.配合物1更容易水解，隨著時間的變化，吸收值上升，其水解1/2所需的時間為42min.而配合物2和3在水溶液中相對穩(wěn)定，在24h內(nèi)幾乎不發(fā)生水解，這可能對金屬配合物的抗腫瘤性能有一定影響.

　　2.7配合物與CT-DNA的相互作用

　　圓二色光譜(CD)法常被用于研究DNA的構(gòu)型變化，也可用來判斷DNA是否發(fā)生損傷.DNA的二級構(gòu)象主要分為A型、B型以及Z型，其中CT-DNA采用B型構(gòu)象.CT-DNA的CD光譜有一個正峰(275nm)和一個負(fù)峰(245nm)，其中，正峰為DNA中堿基對的堆積作用，負(fù)峰為雙鏈DNA的雙螺旋作用[44].采用CD光譜測定了配合物1～3對CT-DNA構(gòu)型的影響.

　　可見，當(dāng)未用配合物1～3孵育時(r=[complex]/[CT-DNA]值為0.0)，CT-DNA的CD光譜有2個強度相同的特征峰，分別是位于275nm處的正峰和245nm處的負(fù)峰.加入配合物1和2后CD譜圖的正峰強度隨著配合物濃度的增加未見明顯變化，而CT-DNA的負(fù)峰強度則隨著配合物濃度的增加均減弱，且發(fā)生一定程度的紅移.對于配合物3，275nm處的正峰強度隨著配合物濃度的增加略有降低，負(fù)峰強度明顯減弱.

　　這表明3個配合物的加入均可改變CT-DNA的螺旋構(gòu)型，從而使CT-DNA發(fā)生解旋.閉環(huán)質(zhì)粒DNA與藥物結(jié)合后會改變其超螺旋密度，從而改變其在凝膠電泳中的遷移速率[45].進一步通過凝膠電泳實驗研究了配合物1～3與質(zhì)粒pBR322DNA的相互作用.隨著配合物1和2濃度的增加，超螺旋DNA帶(FormⅠ)的遷移速率逐漸減小.超螺旋DNA遷移速率的降低可歸因于配合物解旋了DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)，降低了其超螺旋度[46].配合物2與pBR322凝膠作用后，開環(huán)DNA(FormⅡ)的量增多.而配合物3與pBR322DNA幾乎不發(fā)生作用，其濃度達到100μmol/L時，DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)并未受到影響，這說明芳基金屬配合物與DNA的作用在很大程度上取決于中心金屬原子的類型.

　　2.8配合物的細(xì)胞攝取性能

　　在細(xì)胞毒性研究基礎(chǔ)上，進一步探索了配合物在白血病細(xì)胞NB-4中的分布情況.攝取實驗結(jié)果表明，在孵育NB-4細(xì)胞24h后3個配合物在細(xì)胞內(nèi)均有大量攝取，表明配合物具有較好的細(xì)胞膜通透性.經(jīng)配合物1處理后的NB-4細(xì)胞中釕元素在細(xì)胞核內(nèi)的含量較高，且細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中釕含量比為0.71，而配合物2和3則大部分富集在細(xì)胞質(zhì)中，線粒體和細(xì)胞核內(nèi)的金屬元素(Os和Ir)含量均較低，這是由于配合物1具有更高的親脂性，導(dǎo)致其在細(xì)胞核的富集量較高，這也是配合物1活性高于配合物2和3的原因.

　　綜上，配合物的抗腫瘤活性與其親脂性、細(xì)胞攝取量以及水解性密切相關(guān)[47～49]，親脂性越好，細(xì)胞攝取量越高，藥物的毒活性越高.由上述結(jié)果可見，配合物1的親脂性高于配合物2和3，從而導(dǎo)致Ru的細(xì)胞攝取量大于配合物2和3中銥和鋨的攝取量.同時，配合物1的水解速率比配合物2和3快很多，文獻[50]報道芳基金屬配合物可通過將離去基團氯除去后置換成水分子，繼續(xù)與蛋白或DNA相互作用才能發(fā)揮其抗腫瘤活性，這就導(dǎo)致配合物1的細(xì)胞毒活性大于配合物2和3.此結(jié)果為進一步設(shè)計高抗癌活性的芳基金屬配合物提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù).

　　3結(jié)論

　　以具有抗炎、鎮(zhèn)痛等功效的天然產(chǎn)物萘普生為導(dǎo)向分子，利用雙齒螯合結(jié)構(gòu)的聯(lián)吡啶橋聯(lián)配體制備了Ru，Os及Ir3個芳基金屬配合物.結(jié)果表明，配合物1～3均可與DNA結(jié)合使其解旋，并抑制COX-2的酶活性.其中，配合物1表現(xiàn)出比配合物2和3更好的水解性，更容易在細(xì)胞核內(nèi)富集，從而使其對白血病細(xì)胞NB-4表現(xiàn)出更好的細(xì)胞毒活性.本文結(jié)果對設(shè)計高效的芳基金屬抗癌藥物有一定的指導(dǎo)意義.此外，3個配合物的設(shè)計不僅保留了萘普生的抗炎活性，也可用于調(diào)節(jié)芳基金屬的生物活性，豐富了芳基金屬配合物的多功能化應(yīng)用，為新型金屬藥物的發(fā)展開辟了新思路.

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