摘要：微生物群落作為土壤生態系統重要組分，長期低含量抗生素干擾會影響土壤中微生物群落結構及其功能。選取石家莊市為研究區，在2020年9月采集12個樣點的表層土壤(0~25cm)，并根據空間方位將其劃分為4個區(S1、S2、S3和S4);運用超高效液相色譜質譜聯用(HPLCMS/MS)方法測定土壤中典型抗生素——喹諾酮類(quinolones，QNs)含量，明晰QNs在土壤中的空間分布特征，同時利用16SrRNA高通量測序技術對土壤中微生物群落結構及功能進行研究，識別其主要環境影響因子。結果表明：①4個區域的QNs總含量平均值由大到小依次為：S3(313.5μg·kg1)>S4(65.54μg·kg1)>S1(46.19μg·kg1)>S2(12.63μg·kg1)。其中諾氟沙星(NOR)含量最高(平均值為91.99μg·kg1)，而惡喹草酸(OXO)含量最低(平均值為0.4486μg·kg1);②土壤顆粒以粉粒(2~50µm)占比最高(66.7%~93.2%)，而黏粒(小于2µm)占比最低(2.50%~9.10%);土壤中總磷(TP)和氨氮(NH4+N)無顯著空間差異，而硝氮(NO3N)、亞硝氮(NO2N)和土壤粒徑呈現顯著空間差異;③微生物群落的優勢菌門有6種，優勢菌屬有5種，其中放線菌(18.3%~34.6%)和變形菌(13.6%~34.1%)為主要優勢菌門，Arthrobacter(3.24%~8.61%)和Nitrososphaeraceae(2.93%~9.46%)為主要優勢菌屬;α多樣性分析結果表明，Shannon值在S2區最高(6.48)，而在S3區最低(5.89);④相關性結果表明，QNs和土壤理化參數均會顯著改變微生物群落的結構組成，OXO、NO3N和土壤粒徑會影響微生物群落多樣性，而FLU、NH4+N和NO2N和土壤粒徑會對微生物群落的功能產生影響。因此，需進一步加強石家莊市土壤環境中抗生素的風險管控。

　　關鍵詞：喹諾酮類(QNs);微生物群落;土壤;多樣性;功能基因;空間分布;相關性分析

　　自1928年被盤尼西林發現以來，抗生素已被廣泛用于人類治療用藥、獸用藥及動物生長促進劑[1~3]。我國作為全球最大的抗生素生產和使用國，據統計，2013年我國抗生素使用量高達16.2萬t[4]，其中(氟)喹諾酮類抗生素的使用量達到2.73萬t[5]。

　　然而，生物體對抗生素的吸收率較低，約40%~90%抗生素將以原藥或代謝產物的形式隨糞便和尿液排出體外[6,7]，經直排或污水處理廠廢水排放進入環境中，土壤因其具有較強的吸附能力成為抗生素的重要歸宿[8,9]。例如，我國農田土壤中QNs總量檢出范圍介于ND~1527μg·kg1之間[10]，部分地區高達mg·kg1級，且我國土壤中QNs的含量高于瑞士(環丙沙星含量為270.0~400.0μg·kg1)[11]和澳大利亞(環丙沙星含量最高值為450.0μg·kg1)[12]等。

　　然而更值得關注的是，喹諾酮類(quinolones，QNs)在我國京津冀地區土壤中的污染最為嚴重[13]，因此，需進一步加強京津冀地區土壤中QNs的相關研究。QNs進入土壤環境后，經一系列吸附、遷移轉化和生物累積過程，將誘導產生抗性基因[14~17]，并破壞土壤微生物群落的組成及其生態功能[18,19]。微生物群落作為土壤生態系統中的重要組成部分，對土壤生態系統的穩定性和恢復力極其重要[20]。目前，抗生素對微生物群落的影響主要包括4個方面：

　　①微生物群落多樣性：如聚乙烯多磺酸粘多糖和環丙沙星的聯合負載能夠顯著降低土壤中微生物群落多樣性[21];且隨著四環素含量的增加，污泥中微生物群落活性細胞的多樣性降低[22];②微生物群落豐度：如在低含量四環素和土霉素作用下，土壤細菌和真菌數量顯著降低[19];通過室內實驗研究發現磺胺甲惡唑能作為碳源促進微生物的繁殖，使微生物群落豐度上升[23];③微生物群落組成：如左旋氟沙星和土霉素能夠在屬水平上顯著改變原核微生物群落結構[24];高含量抗生素選擇壓力顯著降低了微生物多樣性，改變了微生物群落結構[25]。

　　④微生物群落功能：如氧氟沙星等抗生素能增加沉積物中微生物群落的反硝化功能基因的豐度[26];恩諾沙星單一處理(0~0.80mmol·kg1)能降低微生物群落的活性[27]。然而，此前研究較少關注其它理化環境因子對微生物群落結構、功能和多樣性的共同作用。土壤微生物群落與氮磷循環過程密切相關，有研究表明[28,29]，微生物群落結構與多樣性與TP、NH4+N、NO3N和NO2N具有顯著相關性，土壤粒徑也會影響微生物群落分布。

　　因此，本研究擬通過建立抗生素污染土壤中TP、NH4+N、NO3N、NO2N和土壤粒徑等理化參數與微生物群落的相關性，識別長期抗生素污染土壤中微生物群落結構組成、功能和多樣性的主要環境影響因子。石家莊市作為我國典型的制藥城市，生物醫藥企業占全省藥企總數的80%以上，包括華北制藥、以嶺藥業、神威藥業、石藥和四藥等多家制藥企業。在2016年，全市化學原料藥占全國市場近45%，而抗生素、半和成抗生素等產量均處于全國領先地位[30]。

　　此前相關研究表明石家莊市水環境中的抗生素含量較高[31]，而有關石家莊市土壤中抗生素污染特征及微生物群落的研究卻仍未見報道。因此，選擇石家莊市為研究區，分析石家莊市表層土壤中典型抗生素——喹諾酮類(QNs)抗生素含量及其空間分布特征，并利用16SrRNA高通量測序技術，探討抗生素污染土壤中微生物群落結構組成、功能和多樣性，識別QNs污染土壤中微生物群落結構組成、功能和多樣性的主要環境影響因子，以期為石家莊市生態修復和抗生素污染管控提供科學的理論依據和數據支撐。

　　1材料與方法

　　1.1樣品采集

　　本研究根據石家莊市的土地利用類型及地形等因素，共選取12個代表性采樣點。并根據東部、北部、南部和中部這4個方位將其分為4個區，即S1區(MQ，MLC，ST)、S2區(XS，ZM，LJZ)、S3區(FT，SY，GY)和S4區(NQH，BWL，GYCG)。

　　在2020年9月進行土壤樣品采集，除去表層雜質(如石子和動植物殘骸)后，采用鐵鏟采取(0~25cm)表層土壤樣品，每個采樣點取3個平行樣品(最終以3個樣品的均值作為樣點檢測值)。每個樣品分為3份，一份用于測定QNs含量，一份用于測定粒徑和TP等理化指標，另一份用于微生物群落組成和多樣性分析。運送回實驗室后將樣品進行低溫冷凍保存直至分析。各區取3個樣點的均值作為該區指標值。

　　1.2樣品的前處理及理化指標的測定

　　用于測定QNs抗生素的樣品經冷凍干燥后進行粉碎過篩，稱取2.0g過篩后的土壤樣品，同時稱取2.0g硅藻土(用Na2EDTA處理后)，將硅藻土與樣品1:1混合均勻后裝入(36mL)萃取池，以乙腈磷酸鹽緩沖液(pH=3)作為萃取液，使用ASE350快速溶劑萃取儀(Thermo，Germany)進行萃取。萃取后使用平行濃縮蒸發儀(Buchi，Switzerland)將萃取液濃縮至小于1mL，將濃縮后的溶液過0.45µm濾膜并將其轉移至錐形瓶中，用超純水稀釋200倍制成試料。

　　用于理化指標測定的樣品經解凍后，進行自然風干并研磨過篩，使用粒徑分析儀LE40005(USA)(以超純水作為流動相)測定(過40目篩)土壤粒徑。根據標準HJ6342012測定土壤樣品中的NH4+N、NO3N和NO2N含量，根據標準HJ6322011測定土壤樣品中的TP含量。

　　1.3QNs的含量測定方法使用1mol·L1H2SO4溶液將QNs測定所需試料調節為酸性(pH=3)，其中一份樣品加入含14種目標QNs的混合標準溶液(含量為100ng·L1)，用以測定加標回收率。依次用6mL甲醇和6mL超純水將InertSepHLB固相萃取柱(500mg，6mL)充分活化后進行固相萃取，萃取后在負壓下抽真空干燥30min，然后依次用6mL(體積比為2%)氨水甲醇溶液及6mL純甲醇溶液進行洗脫，洗脫液經氮吹至近干后，用甲醇水溶液(甲醇:水=1:1，體積比)定容至1mL，使用高效液相色譜三重四極桿質譜聯用儀(HPLCMS/MS)測定樣品中QNs的含量。實驗所需標準品均購自SigmaAldrich(Steinheim，Germany)，所有試劑均屬分析純(純度大于95%)。

　　1.4微生物群落分析方法將適量新鮮土壤樣品(過40目篩)轉移至50mL聚乙烯離心管內(V土壤樣品>30mL)，送至上海美吉生物有限公司進行16SrRNA基因測序(IlluminaMiSeq)。使用A.E.Z.N.A.TM土壤DNA試劑盒提取樣品中DNA，用引物341F(5’CCTACGGGNGGCWGCAG3’)和806R(5’GGACTACHVGGGTWTCTAAT3’)進行PCR擴增，并用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，然后經切膠、回收、建立文庫并使用IllμminaMiSeq平臺進行基因測序，采用Trimmomatic軟件對原始DNA序列質控，用FLASH軟件拼接得到優質序列[32]。通過美吉生信云分析平臺進行微生物群落α多樣性分析、微生物群落組成分析和PICRUSt功能基因預測。

　　1.5質量控制實驗采用外標法進行定量。利用甲醇水溶液(甲醇:水=1:1，體積比)通過逐級稀釋將標準儲備液(1.0mg·L1)制備成含量依次為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0和100.0mg·L1的標準系列，經高效液相色譜質譜聯用儀(HPLCMS/MS)分析測定后，得到基于QNs質量含量與峰面積的標準曲線(相關系數大于或等于0.99)。各QNs的加標回收率介于71.3%~110.7%之間。

　　1.6數據統計與分析利用IBMSPSSStatistics25軟件進行數據處理與統計，并利用單因素方差分析和Pearson相關性分析以進行差異顯著性檢驗和環境因子(QNs和理化參數)與微生物群落間相關性分析。

　　使用ArcGis軟件繪制QNs含量空間分布。通過美吉生信云分析平臺進行OTU(operationaltaxonamicunit)聚類分析(序列相似度為97%)和微生物群落物種組成分析、α多樣性分析和PICRUSt功能預測分析，得到土壤中微生物群落組成、多樣性指數和COG功能水平的基因豐度;同時利用KruskalWallis秩和檢驗進行微生物物種組間差異顯著性檢驗。使用Origin2018軟件繪制土壤理化參數及微生物多樣性指數的柱狀分布圖和功能基因豐度的條形圖。利用Canoco5軟件進行PCA主成分分析。

　　2結果與分析

　　2.1QNs的空間分布特征及殘留水平

　　就檢出率而言，檢出率較高的6種QNs分別為氧氟沙星(ofloxacin，OFL，100%)、諾氟沙星(norfloxacin，NOR，75.0%)、環丙沙星(ciprofloxacin，CIP，91.7%)、恩諾沙星(enroxacin，ENR，58.3%)、惡喹草酸(oxolinicacid，OXO，75.0%)和氟甲喹(flumequine，FLU，91.7%)，而其它幾種QNs的檢出率均小于或等于50.0%。

　　其中OFL在S1、S2、S3和S4區的檢出率均達到了100%;NOR在S3和S4區的檢出率最高(均為100%)，而在S2區檢出率最低(33.3%);CIP在S1、S2和S4區的檢出率最高(均為100%)，而在S3區的檢出率最低(66.7%);NOR和OXO均在S1和S3區的檢出率最高(均為100%)，而在S2區檢出率最低(33.3%);FLU在S2、S3和S4區的檢出率最高(均為100%)，而在S3區檢出率最低(66.7%)。

　　2.2土壤理化參數的空間分布特征

　　就土壤(過40目篩)粒徑范圍而言[圖2(a)]，石家莊市土壤中粉粒(2~50µm)的占比最高(66.7%~93.2%)，而黏粒(小于2µm)的占比最低(2.50%~9.10%)。就粒徑空間分布特征而言，黏粒和粉粒的占比在S3區最高(分別為6.40%和86.8%)，而在S4區占比最低(分別為2.67%和67.8%);砂粒(大于50µm)在S4區占比最高(29.6%)，而在S3區占比最低(6.77%)。整體而言，各區之間的土壤粒徑組成差異顯著(P<0.05)。

　　就土壤其它理化參數分布特征而言，ω(TP)范圍為348.9~1062mg·kg1，其含量在S2區最高(739.5mg·kg1)，而在S4區最低(505.5mg·kg1)。ω(NHN)范圍為2.489~39.55mg·kg1，其含量在S2區最高(17.43mg·kg1，而在S1區最低(7.666mg·kg1。ω(NON)和ω(NON)均在S3區最高(40.82mg·kg1和1.080mg·kg1，而在S2區最低(1.975mg·kg1和0.074mg·kg1，其范圍分別介于3.383~59.33mg·kg1和0.011~1.398mg·kg1之間。整體而言，TP和NH并無顯著空間差異，而NO和NO空間差異顯著<0.05和<0.01)。

　　3討論

　　3.1我國城市土壤中QNs污染水平與種類

　　就具體的QNs而言，石家莊市土壤中以ω(NOR)最高(平均值為91.99μg·kg1)，其次為ENR和CIP，這與已有的研究結果一致[10]，可能與NOR在土壤中較高的吸附性和累積能力有關[33,34]。此外，Ghirardini[35]的研究表明，ENR是生糞肥和處理糞肥中含量最高的QNs，而本研究中ω(ENR)較低(平均值為4.476μg·kg1)，說明石家莊市農業生產活動中糞肥的施用較少。

　　此外，S3區的ω(QNs)平均值大于300.0μg·kg1，且石家莊市的制藥企業集中分布于S3區域，說明QNs的含量分布可能與制藥企業有關。整體而言，石家莊市中部地區的ω(總QNs)最高(平均值為313.5μg·kg1)，含量水平高于同處華北地區的北京和天津等城市[36~40]，同時也高于華東、華南及西南等地城市[10,41~47]，如南京某設施菜地ω(總QNs)平均值為169.3μg·kg1[42]，上海某菜田土壤中ω(總QNs)平均值為62.50μg·kg1[41]，廣東惠州蔬菜基地土壤中ω(總QNs)平均值為50.06μg·kg1[46]，而西南地區城市土壤中QNs總含量更低，如昆明某菜地土壤中ω(總QNs)平均值僅為15.20μg·kg1[10]。

　　QNs在我國土壤中的空間差異可能與當地抗生素的使用量有關，如2013年我國華北(6700t)和華東(7290t)地區的QNs使用量遠高于華南地區(1970t)和西南地區(3850t)[48]，而石家莊市作為華北地區典型制藥城市，造成抗生素等抗菌類藥物的大量生產及使用，引起部分區域的抗生素含量顯著高于其它地區。

　　3.2土壤中微生物群落組成和多樣性特征及其主要影響因素

　　本研究土壤中最優勢菌門為放線菌和變形菌。在不同地區土壤中最優勢菌門并無顯著差異[49~52]。如湖北、上海、浙江、四川施用有機肥的土壤中及歐亞大草原(放牧、未放牧)和北方農牧交錯帶的土壤中的最優勢菌門均為放線菌和變形菌[53~55]，與本研究的結果一致。然而不同地區的優勢菌屬具有顯著空間差異，且本研究中微生物群落多樣性指數(Shannon和Simpsoneven)呈顯著空間分布差異，可能與土地利用類型及土壤理化性質有關[56~61]。此外，地理位置及氣候條件的不同也會導致微生物群落組成的差異[32，62]。就具體影響因素而言，本研究結果表明，土壤中微生物群落結構組成和多樣性受QNs、TP、NO3N和土壤粒徑等理化參數的共同影響。

　　就QNs對微生物群落多樣性和結構組成的影響而言，本研究中的QNs對微生物群落多樣性具有抑制作用[63]，與多數室內培養研究結果一致，如：單獨施用CIP(1~10mg·kg1)能降低微生物群落多樣性[64];且NOR(1~10mg·kg1)在第7d開始對微生物群落多樣性具有明顯的抑制作用[65]。此外，本研究中ENR含量雖低，但隨著其含量升高，Chao1指數逐漸降低，說明低含量QNs也可能降低微生物群落的豐度[66]。

　　同時，QNs能顯著影響土壤中微生物群落結構組成[63]，可能與不同菌群對不同含量QNs的響應差異有關。此外，本研究結果表明，NO3N和土壤粒徑會顯著影響微生物群落的多樣性指數，同時TP、NH4+N、NO3N、NO2N和土壤粒徑均會對微生物群落結構組成產生影響，如：粉粒對芽單胞菌表現為促進作用，而砂粒對其表現為抑制作用，說明粒徑越小越有利于部分微生物群落的生長繁殖。

　　3.3土壤中微生物群落的功能基因分布特征及其主要影響因素

　　整體而言，石家莊市土壤中各類功能基因并無顯著空間分布差異。其中染色質結構與動力學類、能源生產與轉換類、核苷酸轉運與代謝類和翻譯、核糖體結構與生物發生類功能基因與QNs存在廣泛相關性，說明QNs會影響土壤中微生物群落的相關遺傳及代謝功能[67]。

　　此外，信號轉導機制類功能基因對于微生物群落應對外界環境條件變化至關重要[68]，而該類功能基因在S3區豐度最低，同時QNs含量在S3區最高，說明QNs可能作為一種信號分子干擾微生物群落的信號轉導功能[67]，從而影響其應對外界條件變化的能力。就土壤理化參數對微生物群落功能影響而言，其中NO2N與染色質結構與動力學類功能基因和翻譯、核糖體結構與生物發生類功能基因呈顯著正相關，而與信號轉導機制類功能基因呈顯著負相關，說明NO2N可能對微生物群落的遺傳功能具有促進作用，而對其信號轉導功能具有抑制作用。

　　此外，復制、重組與修復類功能基因作為微生物群落抵抗抗生素等抗菌劑的影響的重要基因分類[68]，本研究結果表明該類功能基因與NH4+N存在負相關關系，而S2區較高的NH4+N含量可能導致該區微生物群落抵抗抗生素等外界干擾能力的降低。此外，土壤粒徑與微生物群落功能基因存在顯著相關性，說明粒徑的差異也會對微生物群落的功能產生影響。總而言之，微生物群落的功能受QNs和土壤理化參數的共同影響。

　　4結論

　　(1)就空間分布而言，QNs整體呈中部含量高，而其余區域含量低的特征。整體而言，石家莊市土壤中以OFL檢出率最高，而NOR檢出含量最高。(2)石家莊市土壤粒徑以粉粒占比最高，而黏粒占比最低。就理化參數空間分布特征而言，NO、NO和土壤粒徑空間差異顯著。(3)土壤中微生物群落的主要優勢菌門為放線菌和變形菌，主要優勢菌屬為Arthrobacter和Nitrososphaeraceae。

　　不同地區屬水平微生物群落組成差異顯著，且多樣性存在顯著空間差異。(4)石家莊市土壤中微生物群落結構組成、多樣性和功能受QNs和土壤理化參數的共同影響。其中QNs、TP、NH4+N、NO3N、NO2N和土壤粒徑均會對微生物群落組成產生影響，OXO、NO3N和土壤粒徑是微生物群落多樣性的主要影響因子，而FLU、NO2N、NH4+N和土壤粒徑是微生物群落功能基因的主要影響因子。

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　　作者：趙鑫宇，劇澤佳，陳慧，付雨，宋圓夢，趙波，張紀媛，盧夢淇，崔建升，張璐璐