摘要：為探索天然酚類化合物百里香酚、和厚樸酚與化學(xué)合成殺菌劑百菌清、啶酰菌胺混配的增效作用，篩選出能夠防治灰霉病的混劑，本研究將百里香酚、和厚樸酚分別與百菌清、啶酰菌胺以不同比例混配，采用菌絲生長速率法測(cè)定其對(duì)灰葡萄孢菌Botrytiscinerea的抑菌活性，并將Bliss法、Mansour法和孫云沛法結(jié)合，以優(yōu)化篩選方案，評(píng)價(jià)混劑的聯(lián)合毒力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：將Bliss法、Mansour法和孫云沛法結(jié)合使用能夠有效降低篩選工作量，且準(zhǔn)確率較高;百里香酚和百菌清以質(zhì)量比5:1、2:3、1:5和1:10比例混配，和厚樸酚和百菌清以質(zhì)量比10:1、5:1、3:2、2:3和1:10比例混配均表現(xiàn)出協(xié)同增效作用;和厚樸酚和百菌清以10:1比例混配時(shí)協(xié)同增效作用最明顯，其CTC值為309.15，以1:10比例混配時(shí)抑菌活性最高，其對(duì)B.cinerea的EC50為0.29mg/L，高于殺菌劑百菌清。因此，將定性分析方法與定量分析方法結(jié)合使用是篩選殺菌劑混劑配方的合理方案，天然酚類化合物百里香酚、和厚樸酚與百菌清以合理比例混配所得混劑具有防治灰霉病的潛力。

　　關(guān)鍵詞：天然酚類化合物;百里香酚;和厚樸酚;合成殺菌劑;協(xié)同作用;灰葡萄孢菌

　　0引言

　　灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)是主要的植物病原真菌之一，其寄主廣泛，能夠引起多種蔬菜、果樹、花卉等作物的灰霉病[1]。灰霉病危害嚴(yán)重，且易于傳播，若未及時(shí)防治常會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。在現(xiàn)階段的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式中，灰霉病的防治仍依賴化學(xué)農(nóng)藥的使用[3]，生物防治等措施因其自身的局限性，尚未大范圍應(yīng)用[4]。在生產(chǎn)中，防治灰霉病的常用藥劑根據(jù)作用方式可分為保護(hù)性殺菌劑和內(nèi)吸性殺菌劑。

　　化學(xué)論文范例：多糖化合物論文好發(fā)表嗎

　　啶酰菌胺(boscalid)是防治灰霉病最為常用的內(nèi)吸性殺菌劑，屬于煙酰胺類化合物，其作用機(jī)制獨(dú)特，能夠抑制植物病原真菌線粒體的琥珀酸脫氫酶，阻斷三羧酸循環(huán)，從而抑制病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)[5]。啶酰菌胺具有高效、低毒的特點(diǎn)，對(duì)番茄、黃瓜、草莓等多種作物灰霉病防效顯著[6-8]。但與多數(shù)內(nèi)吸性殺菌劑相同，其作用位點(diǎn)單一，屬于高抗性風(fēng)險(xiǎn)的殺菌劑[9]。目前，B.cinerea對(duì)包含啶酰菌胺在內(nèi)的多種內(nèi)吸性殺菌劑已處于較高抗性風(fēng)險(xiǎn)水平，亟需尋找合理的方案來延緩抗藥性的蔓延[10]。另外，啶酰菌胺等琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑(SDHIs)對(duì)魚類具有毒性，其大量使用存在環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)[11-13]。百菌清(chlorothalonil)是灰霉病防治中最為常用的保護(hù)性殺菌劑之一。

　　保護(hù)性殺菌劑不易產(chǎn)生抗藥性，但抑菌活性低于內(nèi)吸性殺菌劑[14]，需進(jìn)一步提高其抑菌活性。混劑的開發(fā)和利用是延緩抗藥性發(fā)生的重要手段，合理搭配的混劑不僅能夠提高抑菌活性，降低農(nóng)藥使用量和防治成本，且能夠延緩抗藥性的發(fā)生。植物在長期進(jìn)化過程中，為抵抗病原菌的侵入，產(chǎn)生了很多具有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物。這些次生代謝產(chǎn)物是篩選殺菌劑抑菌活性成分的寶庫，天然殺菌劑活性成分篩選在新型殺菌劑的研發(fā)中占有重要地位[15]。

　　但是，大多數(shù)次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性低于化學(xué)合成的殺菌劑，難以將其直接用于植物病害防治。除直接利用外，與化學(xué)合成殺菌劑混配使用也是從天然產(chǎn)物研發(fā)新農(nóng)藥的途徑之一。作者所在課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)：天然單萜酚類化合物與噻呋酰胺和苯醚甲環(huán)唑之間具有明顯的協(xié)同增效作用，部分混劑配方對(duì)立枯絲核菌的抑菌活性優(yōu)于化學(xué)合成殺菌劑噻呋酰胺和苯醚甲環(huán)唑[16]。將作用機(jī)制獨(dú)特的天然抑菌活性成分與化學(xué)合成殺菌劑混配，不僅有望獲得高活性的抑菌組合物，而且能夠降低化學(xué)農(nóng)藥使用量，是開發(fā)新型殺菌劑混劑的合理策略。

　　本課題組在篩選天然抑菌活性成分的過程中發(fā)現(xiàn)：天然酚類化合物百里香酚、和厚樸酚對(duì)B.cinerea具有一定的抑制活性，但低于化學(xué)合成殺菌劑百菌清和啶酰菌胺[17]。因此，本研究將百里香酚、和厚樸酚分別與啶酰菌胺、百菌清以不同比例混配，通過菌絲生長速率法測(cè)定混劑對(duì)B.cinerea的抑菌活性，并使用Bliss法、Mansour法、孫云沛法評(píng)價(jià)其聯(lián)合作用。該研究結(jié)果能夠?yàn)檠芯刻烊环宇惢�合物與殺菌劑混配奠定基礎(chǔ)，同時(shí)能夠?yàn)樘烊灰志�活性成分的利用和殺菌劑混劑研發(fā)提供新思路。

　　1材料與方法

　　1.1供試菌種

　　本研究所用Botrytiscinerea病原菌采集于云南省玉溪市通海縣玫瑰灰霉病病葉。分離純化后經(jīng)ITS測(cè)序鑒定確認(rèn)，4℃條件下保存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。保藏菌株經(jīng)活化后用于抑菌活性測(cè)定。實(shí)驗(yàn)于2019年10月—2020年6月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)和云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所進(jìn)行。

　　1.2供試化合物

　　百里香酚(CAS:89-83-8，99%)購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;和厚樸酚(CAS:35354-74-6，98%)購買于安耐吉薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司;百菌清(97%)、啶酰菌胺(97%)由廣西田園生化股份有限公司提供;二甲基亞砜(AR)購于廣州賽國生物科技有限公司。

　　1.3抑菌活性測(cè)定

　　采用菌絲生長速率法測(cè)定百里香酚、和厚樸酚、百菌清、啶酰菌胺及其混劑對(duì)B.cinerea的抑菌活性，方法如下：將百里香酚、和厚樸酚、百菌清、啶酰菌胺用二甲基亞砜配制成等比濃度梯度的母液，分別將百里香酚、和厚樸酚和百菌清、啶酰菌胺以10:1、5:1、3:2、2:3、1:5、1:10的比例混配。將待測(cè)藥加入約45℃的PDA培養(yǎng)基中混勻后，倒入直徑9cm的培養(yǎng)皿中制成帶藥平板，加入等量的二甲基亞砜作為對(duì)照。用內(nèi)徑為5mm的打孔器打取培養(yǎng)3天的B.cinerea菌餅置于平板中央，于25±1℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。待對(duì)照組菌落長至接近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)以十字交叉法測(cè)量菌落直徑，用公式(1)計(jì)算抑菌率。抑菌率=對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑對(duì)照菌落直徑×100%

　　1.4混劑的增效作用測(cè)定及篩選

　　結(jié)合Bliss法[18]、Mansour法[19]和孫云沛法[20]并加以優(yōu)化，初步評(píng)價(jià)天然酚類化合物與百菌清、啶酰菌胺混配是否具有增效作用。流程如下：(1)分別測(cè)定百里香酚、和厚樸酚、百菌清、啶酰菌胺在不同濃度下對(duì)B.cinerea的抑菌活性，并計(jì)算其EC50值。(2)根據(jù)公式(2)[20]，估算混劑的理論EC50值。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1天然酚類化合物與百菌清、啶酰菌胺混配的增效作用

　　百里香酚與百菌清、啶酰菌胺混配增效作用的定性分析結(jié)果。根據(jù)結(jié)果可知，百里香酚和百菌清以5:1、1:5和1:10比例混配時(shí)顯示為增效作用，其中兩者以1:5的比例混配時(shí)增效指數(shù)最高，為55.24，高于其他配比。百里香酚與百菌清在10:1、3:2、2:3的配比下混配時(shí)均為相加作用。百里香酚與啶酰菌胺在本次實(shí)驗(yàn)所選的6個(gè)配比組合下未篩選出具有協(xié)同增效的組合，均為相加作用。和厚樸酚與百菌清、啶酰菌胺混配增效作用的定性分析結(jié)果。和厚樸酚與百菌清混配在本次實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的6個(gè)配比下顯示為增效作用或相加作用，未見有拮抗作用的組合。和厚樸酚與百菌清在3:2、2:3的配比下為增效作用，以2:3的比例混配時(shí)增效效果最好，增效指數(shù)為55.12。和厚樸酚與啶酰菌胺混配在6個(gè)配比組合下均顯示出相加作用。

　　百里香酚、和厚樸酚與百菌清混配均篩選出了具有增效作用的配比。其中百里香酚與 百菌清以1:5比例混配、和厚樸酚與百菌清以2:3比例混配時(shí)增效作用為組中最高，增效指數(shù)分別為55.24、55.12。百里香酚、和厚樸酚與啶酰菌胺混配時(shí)均無增效的組合。初篩中百里香酚、和厚樸酚與百菌清混配均表現(xiàn)出增效作用或相加作用，為進(jìn)一步測(cè)定其聯(lián)合毒力，本研究采用孫云沛法測(cè)定其共毒系數(shù)，定量分析其增效效果。

　　2.2增效配方的聯(lián)合毒力

　　百里香酚與百菌清及其混配的聯(lián)合毒力測(cè)定結(jié)果。百菌清對(duì)B.cinerea的EC50為0.65mg/L，當(dāng)百里香酚與百菌清混用之后，2:3、1:5、1:10比例下其EC50均低于0.65mg/L，其對(duì)B.cinerea的抑菌活性得到了提高，1:10時(shí)EC50最低，為0.30mg/L。百里香酚與百菌清以5:1、2:3、1:5、1:10的比例混配時(shí)其共毒系數(shù)大于120，均表現(xiàn)為協(xié)同增效作用，其中以1:5的比例混配時(shí)時(shí)協(xié)同增效作用最強(qiáng)，共毒系數(shù)為249.03，其次是1:10，共毒系數(shù)為237.49。

　　百里香酚和百菌清在10:1和3:2時(shí)表現(xiàn)為相加作用。和厚樸酚與百菌清及其混配的聯(lián)合毒力測(cè)定結(jié)果如表4所示。由表可知，和厚樸酚與百菌清以3:2、2:3、1:10的比例混配后EC50均低于百菌清單獨(dú)使用時(shí)的EC50(0.65mg/L)，對(duì)B.cinerea的抑菌活性得到了提高，其中以1:10混配EC50最低，為0.29mg/L。和厚樸酚與百菌清以1:5的比例混配時(shí)共毒系數(shù)為119.25，表現(xiàn)為相加作用，其他5個(gè)配比的共毒系數(shù)值均大于120，為協(xié)同增效。和厚樸酚與百菌清以10:1的比例混配時(shí)增效效果最好，其共毒系數(shù)為309.15。

　　2.3混劑和單劑在不同濃度下的抑菌活性對(duì)比

　　百里香酚與百菌清以1:5的比例混配時(shí)的共毒系數(shù)較其他比例混配時(shí)高，為249.03;兩者以1:10混配時(shí)抑菌活性最高，EC50為0.30mg/L。和厚樸酚與百菌清以10:1混配時(shí)共毒系數(shù)為309.15，高于其他比例;兩者以1:10混配時(shí)抑菌活性最高，EC50為0.29mg/L。為探討這些混劑用于灰霉病防治的潛力，本研究對(duì)比了兩種酚類化合物與百菌清混配后增效作用最明顯和抑菌活性最高的混劑與百菌清單劑在一定濃度下的抑菌活性。結(jié)果表明：百里香酚與百菌清以1:5和1:10比例混配時(shí)，在0.125~8mg/L濃度下的抑菌活性均高于百菌清。

　　如：百菌清在8mg/L濃度下對(duì)B.cinerea的抑菌率為87.55%，而百里香酚與百菌清以1:5和1:10比例混用后在2~8mg/L濃度下的抑菌率均為100%。和厚樸酚與百菌清以1:10比例混配時(shí)抑菌活性最高，2~8mg/L濃度下的抑菌率均為100%，在0.5~8mg/L濃度下的抑菌活性均高于百菌清;以10:1比例混配時(shí)共毒系數(shù)最高，二者之間表現(xiàn)出很強(qiáng)的協(xié)同增效作用，但混劑在0.5~8mg/L濃度下的抑菌活性均低于百菌清單劑。該結(jié)果是由于和厚樸酚的抑菌活性遠(yuǎn)低于百菌清所致。綜合抑菌活性測(cè)定結(jié)果可知，將百里香酚、和厚樸酚與百菌清合理混配不僅能達(dá)到更好的殺菌效果，還能降低化學(xué)農(nóng)藥百菌清的使用量，具備用于灰霉病防治的潛力。

　　3討論

　　目前，防治灰霉病混劑的研發(fā)以化學(xué)農(nóng)藥之間的混配為主。趙建江等[21-22]測(cè)定了啶酰菌胺分別與唑胺菌酯、嘧菌酯混配對(duì)灰葡萄孢菌的增效作用，結(jié)果表明啶酰菌胺與唑胺菌酯在9個(gè)質(zhì)量比下混配對(duì)灰葡萄孢菌均表現(xiàn)為增效作用，1:3時(shí)增效明顯，增效系數(shù)為4.76;啶酰菌胺與嘧菌酯以質(zhì)量比7:1、5:1、3:1、1:1、1:5、1:3和1:7比例混配均表現(xiàn)增效作用，其中以1:1混配增效系數(shù)高達(dá)4.5。

　　劉妤玲等[23]測(cè)定了吡唑醚菌酯和氟菌唑?qū)Ψ�茄灰霉病的�?lián)合毒力，結(jié)果表明吡唑醚菌酯和氟菌唑以質(zhì)量比2:1、1:1混配具有增效作用。與上述的化學(xué)合成殺菌劑間二元混配不同，本研究將天然酚類化合物與化學(xué)合成殺菌劑混配，發(fā)現(xiàn)百里香酚、和厚樸酚分別與百菌清混配不僅能夠提高抑菌活性，而且能減少化學(xué)農(nóng)藥使用量。另外，不同作用機(jī)理的殺菌劑間的混配能夠降低抗性風(fēng)險(xiǎn)、延緩灰葡萄孢菌抗藥性的產(chǎn)生，可以作為開發(fā)灰霉病防治藥劑的優(yōu)選方案。

　　4結(jié)論

　　本研究將天然酚類化合物百里香酚、和厚樸酚與化學(xué)殺菌劑百菌清、啶酰菌胺進(jìn)行混配，篩選出了具有增效的配方：百里香酚和百菌清以5:1、2:3、1:5和1:10混配，和厚樸酚和百菌清以10:1、5:1、3:2、2:3和1:10比例混配均表現(xiàn)出了一定的增效作用。其中和厚樸酚和百菌清以10:1比例混配時(shí)協(xié)同增效作用最明顯，其CTC值為309.15，但其抑菌活性低于殺菌劑百菌清;以1:10比例混配時(shí)抑菌活性最高，其對(duì)B.cinerea的EC50為0.29mg/L，高于百菌清單劑。

　　天然酚類化合物百里香酚、和厚樸酚與百菌清以合理比例混配具有防治灰霉病的潛力，本研究能為開發(fā)防治灰霉病的藥劑提供理論支持。同時(shí)，本研究優(yōu)化了混劑篩選方案：將Bliss法、Mansour法和孫云沛法3種農(nóng)藥混劑增效作用的評(píng)價(jià)方法結(jié)合，先進(jìn)行配方的定性分析，初步篩選具有增效作用的配方，再進(jìn)行定量分析，能夠以更高的效率篩選具有增效作用的配方，對(duì)混劑篩選方法的優(yōu)化具有一定的指導(dǎo)意義。

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　　作者：李佳俊1，陶麗紅1，葉敏1，王凱博1,2，吳文偉2，何成興2，范黎明1，蘇發(fā)武1