摘要：為探究外源一氧化氮(Nitricoxide，NO)供體硝普鈉(Sodiumnitroprusside，SNP)對(duì)低溫脅迫下茶樹幼苗的緩解作用，采用人工氣候室模擬低溫脅迫試驗(yàn)，研究了葉面噴施不同濃度SNP對(duì)低溫脅迫下兩年生碧香早茶苗葉片膜脂過氧化程度、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化酶活性的影響。

　　結(jié)果表明，適宜SNP濃度可降低低溫脅迫下茶樹葉片相對(duì)電導(dǎo)率，抑制丙二醛含量的升高，促進(jìn)脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的大量積累，提高超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性，從而緩解低溫脅迫對(duì)茶樹葉片的傷害。試驗(yàn)結(jié)果表明，噴施濃度為200μmol·L-1的SNP效果最佳。

　　關(guān)鍵詞：茶樹;低溫脅迫;外源NO;硝普鈉;生理特性

　　茶樹[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]是一種喜溫畏寒的多年生常綠木本植物。低溫是茶樹栽培過程中常遇的非生物脅迫之一，已成為限制茶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素[1]。在生產(chǎn)中，早春茶園易遭受低溫冷害或氣溫回暖后的“倒春寒”危害，使茶樹生理代謝出現(xiàn)絮亂，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)下降。大量研究表明，茶樹抗寒性與體內(nèi)丙二醛(MDA)、可溶性糖、可溶性蛋白含量和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性等密切相關(guān)[2-3]。

　　抗寒性較強(qiáng)的茶樹體內(nèi)可溶性糖含量較高，可溶性蛋白含量積累增多[4-5]，SOD、CAT活性維持較高水平，SOD同工酶總活性及譜帶數(shù)量明顯增強(qiáng)[5-7]。因此，研究茶樹對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)理，探索茶樹抵抗低溫和冷害具有重要意義。

　　一氧化氮(Nitricoxide，NO)作為生物體內(nèi)重要的信號(hào)分子，對(duì)植物抗逆防御起重要的信號(hào)調(diào)節(jié)作用[8]，目前關(guān)于NO參與植物逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)已成為研究熱點(diǎn)。Tian等[9]研究發(fā)現(xiàn)，外源NO能誘導(dǎo)干旱脅迫下小麥葉片氣孔關(guān)閉而減少水分的損失，提高葉片中SOD、CAT活性，降低MDA和H2O2含量。

　　Zheng等[10]研究報(bào)道了外源NO能促進(jìn)高鹽脅迫下小麥種子萌發(fā)，增強(qiáng)小麥葉片中SOD、CAT活性和脯氨酸含量，降低細(xì)胞膜通透性，抵抗對(duì)葉片中線粒體氧化的傷害。Liu等[11]研究表明，外源NO可以提高低溫脅迫下黃瓜幼苗體內(nèi)的保護(hù)酶活性，從而增強(qiáng)植株對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)性。陳銀萍等[12]研究表明，低溫脅迫下不同濃度硝普鈉(SNP)能顯著提高玉米種子的發(fā)芽率，抑制葉片MDA含量的升高，降低葉片質(zhì)膜相對(duì)透性，增加相對(duì)含水量、脯氨酸含量和葉綠素含量。

　　外源NO針對(duì)禾本科、豆科、蔬菜和林木等植物在水分、鹽度、溫度等非生物脅迫的研究較多，但關(guān)于逆境脅迫下NO介導(dǎo)的茶樹生理反應(yīng)研究較少，尤其是NO對(duì)于低溫脅迫下茶樹生理特性的影響尚未深入研究。因此，本研究通過對(duì)碧香早茶苗葉面噴施外源NO供體SNP，探討不同濃度SNP對(duì)低溫脅迫下茶樹主要生理指標(biāo)的影響，以期篩選出提高茶苗抗低溫能力的適宜SNP濃度，為進(jìn)一步深入研究外源NO提高茶樹幼苗抵抗低溫冷害等非生物脅迫能力提供理論參考。

　　1材料與方法

　　1.1試驗(yàn)材料

　　供試材料為湖南省茶葉研究所高橋基地提供的兩年生碧香早茶樹盆栽苗。選擇長(zhǎng)勢(shì)基本一致的茶苗移栽于盆口直徑為30cm的聚乙烯盆中，每盆種植3株，培養(yǎng)土為70%茶園土混以30%有機(jī)肥料，定期澆水。試驗(yàn)在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，溫室內(nèi)溫度控制在20~25℃，相對(duì)濕度60%~75%，緩苗3個(gè)月。試驗(yàn)所用NO供體SNP[Na2Fe(CN)5]純度為98.5%，購(gòu)自上海生工生物有限公司。先將其配制成100mmol·L-1母液，4℃保存，用時(shí)按所需濃度稀釋。

　　1.2試驗(yàn)方法

　　1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

　　選取大小和長(zhǎng)勢(shì)一致，生長(zhǎng)健壯且無病蟲、傷殘葉的盆栽茶苗，移至人工智能氣候箱培養(yǎng)，箱內(nèi)溫度控制在(25±1)℃，相對(duì)濕度保持在(60±5)%，光照周期為12h·d-1，培養(yǎng)3d。3d后對(duì)幼苗進(jìn)行葉面噴施處理，每次定量噴施250mL，均勻噴施至葉片正反面水珠欲滴為止，1d噴1次，連續(xù)噴施3d。

　　試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理：(1)–2℃低溫脅迫+清水處理(CK);(2)–2℃低溫脅迫+200μmol·L-1SNP(C1);(3)–2℃低溫脅迫+500μmol·L-1SNP(C2);(4)–2℃低溫脅迫+1000μmol·L-1SNP(C3)。每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)15株苗。

　　1.2.2低溫處理

　　將已噴施的茶苗移至–2℃的人工氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫處理，光照周期設(shè)為12h·d-1，相對(duì)濕度(60±5)%。分別于低溫脅迫的第0、6、24、48h和72h時(shí)進(jìn)行取樣，取第1片成熟葉片測(cè)定電導(dǎo)率，取一芽二葉測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)，立即裝入封口袋內(nèi)，迅速放入液氮中速凍，保存至–70℃冰箱備用。

　　1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法

　　采用電導(dǎo)法測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率[13];采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白含量[14];采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量[15];采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛含量[15];采用茚三酮顯色法測(cè)定脯氨酸含量[15-16];采用氮藍(lán)四唑(NBT)顯色法測(cè)定SOD活性[17];采用H2O2紫外吸收法測(cè)定CAT活性[16]。

　　1.4數(shù)據(jù)處理

　　采用MicrosoftExcel2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析，多重比較采用Duncan法。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1對(duì)低溫脅迫下茶樹葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

　　隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，茶樹葉片相對(duì)電導(dǎo)率整體上升，不同處理間波動(dòng)較大，均在72h時(shí)達(dá)到峰值。低溫脅迫過程中，茶樹葉片相對(duì)電導(dǎo)率以200μmol·L-1SNP(C1)最低，6、24、48、72h時(shí)較清水處理(CK)分別顯著降低36.07%、43.80%、13.37%和27.94%(P<0.05)。

　　500μmol·L-1SNP(C2)在48h前均顯著高于CK;72h時(shí)低于CK，較CK顯著降低7.16%(P<0.05)。1000μmol·L-1SNP(C3)在24~72h時(shí)間段均高于CK，較CK顯著增加2.34%~5.18%(P<0.05)，這表明高濃度SNP對(duì)降低茶樹幼苗低溫脅迫下葉片電導(dǎo)率無明顯的促進(jìn)作用。

　　2.2對(duì)低溫脅迫下茶樹葉片MDA含量的影響

　　低溫促使茶樹葉片產(chǎn)生MDA，并隨低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，72h時(shí)葉片MDA含量達(dá)到峰值。低溫脅迫下，外源NO可明顯降低葉片中MDA含量，并隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)不同SNP濃度對(duì)降低葉片MDA含量的效果也存在一定差異。

　　C1處理的茶樹葉片MDA含量在48h和72h時(shí)較CK分別顯著降低了15.16%和39.81%(P<0.05)，C2和C3處理在6~72h時(shí)分別顯著降低了14.24%~26.31%和11.86%~27.76%(P<0.05)。說明低濃度SNP處理對(duì)抑制低溫脅迫下茶樹葉片MDA含量升高的效果更好。

　　2.3對(duì)低溫脅迫下茶樹葉片脯氨酸含量的影響

　　隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，茶樹葉片脯氨酸含量呈上升趨勢(shì)。低溫脅迫下噴施不同濃度SNP的葉片脯氨酸含量均高于CK，并在72h時(shí)達(dá)到峰值，其中C1處理最高，顯著高于C2和C3處理。

　　與CK處理相比，C1處理的脯氨酸含量在低溫脅迫6、24、48、72h時(shí)分別顯著增加24.54%、28.05%、43.67%和66.67%(P<0.05)，C2處理在低溫脅迫24~72h時(shí)分別顯著增加9.84%~49.68%(P<0.05)，C3處理在低溫脅迫48h和72h時(shí)分別顯著增加9.02%和35.74%(P<0.05)，說明低濃度SNP對(duì)增加低溫脅迫下茶樹葉片脯氨酸含量的效果顯著。

　　2.4對(duì)低溫脅迫下茶樹葉片可溶性蛋白含量的影響

　　茶樹葉片在低溫脅迫過程中可溶性蛋白含量均呈上升趨勢(shì)，噴施SNP處理的可溶性蛋白含量均顯著高于CK(P<0.05)，72h時(shí)均達(dá)到最高值，其中C1處理最高，顯著高于C2和C3處理。較CK處理，C1處理的可溶性蛋白含量在低溫脅迫6、24、48h和72h時(shí)分別顯著增加51.73%、51.72%、42.62%和32.94%(P<0.05)，C2和C3處理在低溫脅迫6~72h時(shí)分別顯著增加9.92%~40.68%和28.93%~44.03%(P<0.05)，C2和C3處理對(duì)增加低溫脅迫下茶樹葉片可溶性蛋白含量的累積效果較C1處理差。

　　2.5對(duì)低溫脅迫下茶樹葉片可溶性糖含量的影響

　　低溫脅迫使茶樹葉片的可溶性糖含量不同程度的增加，72h時(shí)達(dá)到最高值，不同濃度SNP處理的茶樹葉片可溶性糖含量的變化趨勢(shì)與可溶性蛋白基本一致。C1處理在低溫處理各時(shí)段均最高，顯著高于其他處理，低溫脅迫6、24、48h和72h時(shí)C1處理較CK分別顯著增加18.91%、12.57%、28.03%和33.20%(P<0.05);C2和C3處理在低溫脅迫6~72h時(shí)較CK分別顯著增加3.06%~19.89%和2.73%~18.11%(P<0.05)。

　　2.6對(duì)低溫脅迫下茶樹葉片CAT活性的影響

　　低溫脅迫下茶樹葉片CAT活性呈先上升再下降的趨勢(shì)，SNP處理的葉片CAT活性波動(dòng)較大，CK在0~6h間CAT活性有所下降，24h時(shí)顯著增加，之后下降。C1處理在0~6h時(shí)CAT活性變化較小，6~24h活性顯著增強(qiáng)，之后有所下降，整個(gè)低溫脅迫過程中CAT活性以C1處理最高，在6、24、48、72h時(shí)較CK處理分別顯著增加53.06%、100.00%、49.66%和59.43%(P<0.05);C2處理的CAT活性僅高于CK，低溫脅迫過程中與CK處理差異不顯著;C3處理的CAT活性在6~72h時(shí)較CK顯著增加了43.09%~64.88%(P<0.05)，但較C1處理效果差。

　　2.7對(duì)低溫脅迫下茶樹葉片SOD活性的影響

　　低溫脅迫過程中，茶樹葉片SOD活性總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，24h時(shí)SOD活性達(dá)到峰值。噴施不同濃度SNP能不同程度提高茶樹葉片的SOD活性，且顯著高于CK(P<0.05)。

　　低溫脅迫過程中SOD活性以C1處理最高，在6、24、48h和72h時(shí)C1處理較CK在分別顯著增加9.79%、14.81%、23.29%和19.43%(P<0.05);C2和C3處理間差異較小，C2處理在低溫脅迫24~72h時(shí)和C3處理在低溫脅迫48~72h時(shí)較CK分別顯著增加10.37%~17.81%和6.64%~12.33%(P<0.05)。

　　3討論

　　細(xì)胞膜是植物感受低溫傷害的主要部位，低溫使細(xì)胞膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，從而導(dǎo)致細(xì)胞受到損害。研究表明，適宜SNP濃度能夠顯著降低植物幼苗在低溫脅迫下質(zhì)膜相對(duì)透性，顯著抑制MDA的積累，從而提高植物幼苗對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)性[18-19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，外源NO顯著抑制了茶樹葉片中MDA含量的積累，降低了葉片相對(duì)電導(dǎo)率，這與徐洪雷[18]和樊懷福等[20]的研究結(jié)果一致。

　　可能是低溫促進(jìn)了H2O2和O2-的積累，進(jìn)而激發(fā)了MDA的產(chǎn)生，對(duì)茶樹葉片的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成了破壞，而NO作為信號(hào)分子減少了膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的積累，在一定程度上保護(hù)了低溫脅迫下葉片細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)，緩解了細(xì)胞膜質(zhì)過氧化作用帶來的損傷。然而，NO在植物體中的作用具有二元性：低濃度的NO對(duì)植物體具有一定的保護(hù)作用，而高濃度NO則會(huì)嚴(yán)重傷害植物組織和細(xì)胞[21]。

　　即本研究結(jié)果中，200μmol·L-1的SNP處理可以有效降低低溫脅迫下茶樹葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和抑制MDA含量的升高，而SNP濃度升高，其作用效果減弱。逆境脅迫會(huì)直接或間接引起植物細(xì)胞內(nèi)滲透勢(shì)的變化造成細(xì)胞質(zhì)脫水，而植物通過短時(shí)間內(nèi)迅速積累滲透物質(zhì)進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)的方式來適應(yīng)逆境。可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸都是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它們可消除低溫脅迫產(chǎn)生的毒性物質(zhì)，從而減少因水分流失引起的冰晶形成[22]。

　　本研究中，外源NO可顯著提高低溫脅迫下茶樹葉片脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量，與Zhao等[23]、Liu等[11]、吳旭紅等[24]和郭經(jīng)緯等[25]的研究結(jié)果一致。由此推測(cè)，低溫脅迫導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，而NO通過質(zhì)外體直接作用于細(xì)胞壁的組分，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)水分從根系向葉片運(yùn)送，從而增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減少電解質(zhì)外滲。過高濃度的SNP會(huì)影響滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加的效果，可能是由于高濃度的NO可以與O2-作用產(chǎn)生過氧亞硝酸，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，滲透調(diào)節(jié)失衡，從而導(dǎo)致植物受到更嚴(yán)重的傷害[21]。

　　NO是參與植物生理過程中的信號(hào)傳導(dǎo)分子，它在植物生長(zhǎng)和發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，其信號(hào)系統(tǒng)可以誘導(dǎo)和激活植物抗氧化系統(tǒng)。研究表明，SNP可以明顯提高多種作物中CAT、POD、SOD等酶的活性，并提高作物在遭受低溫逆境后的成活率[26-27]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

　　由此推測(cè)可能是NO與含鐵的CAT等相關(guān)酶類具有很強(qiáng)的親和性，能夠調(diào)節(jié)含血紅素鐵的酶類活性，并抑制含非血紅素鐵的順烏頭酸酶等靶酶的活性[28]。SOD活性的提高可能是在低溫脅迫下NO作為信號(hào)分子來誘導(dǎo)SOD編碼基因的表達(dá)[29]。適當(dāng)濃度的SNP處理能夠提高SOD和CAT等抗氧化酶的活性，有效清除低溫脅迫引起的植物體內(nèi)積累的活性氧，提高低溫耐受性的能力，減輕低溫脅迫對(duì)植物的傷害。

　　4結(jié)論

　　低溫脅迫下茶樹葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量明顯升高，脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量顯著增加，SOD和CAT的活性升高。外源NO處理顯著降低了低溫脅迫下茶樹幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率，抑制了MDA含量升高，進(jìn)一步促進(jìn)了脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的積累，顯著提高了抗氧化酶(SOD、CAT)的活性，從而增強(qiáng)了茶樹幼苗抵抗低溫脅迫的能力。綜上所述，低溫脅迫下，外源NO供體SNP濃度為200μmol·L-1處理碧香早茶樹品種緩解效果最好，而較高SNP濃度對(duì)其緩解作用較差。

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