摘要:低溫是植物生長過程中面臨的主要非生物脅迫之一，植物的生長發育與生理代謝直接受到低溫的影響。低溫脅迫下，植物從內源激素、膜質組成、抗氧化成分及基因轉錄水平等多個方面做出復雜而劇烈的響應，因此，植物抗寒性研究是農業和植物領域研究的熱點之一。本文從植物形態特征、生理生化變化、分子水平響應等方面系統論述植物低溫脅迫響應機制;比較了直接、間接和綜合評價植物耐低溫性的研究方法;分析了植物抗凍鍛煉、外源生長調節劑調控、基因工程等途徑提升植物耐低溫性的效果，并對以后的研究方向進行展望。

　　關鍵詞:低溫脅迫;響應機制;研究方法;耐低溫性

　　霜凍、寒潮及低溫冷害是出現于早秋和晚春時節的主要農業氣象災害。在全球氣溫變暖的大環境下，由于低溫災害頻繁發生，嚴重影響到我國農林業的發展(2018年4月份中國西北、華北等地遭受嚴重低溫凍害，其中甘肅省蔬菜、果樹、花椒等農作物受災33.583萬hm2，絕收10.174萬hm2)。關于植物低溫脅迫機制的研究主要從外觀形態和生理生化變化以及分子應答等方面展開，隨著研究的深入，重點趨向于低溫響應關鍵基因的信號調控網絡研究，其中轉錄因子和miRNA成為研究熱點。

　　由于低溫脅迫類型復雜，植物對低溫的適應性受多基因調控，不同作物低溫評價指標和標準難以統一，在植物抗寒評價方法方面進展緩慢，制約了植物耐寒資源的鑒定和機制研究工作的深入開展。本文主要從植物低溫脅迫響應的機制、植物耐低溫性研究方法和提高植物耐低溫性途徑等方面展開綜述，旨在為植物抗寒性研究提供理論參考。

　　1植物低溫脅迫響應機制

　　1.1植物低溫脅迫下的形態特征

　　在低溫脅迫下，形態特征變化是植物受到脅迫最直觀的體現，輕而長期低溫會使植株生長遲緩、苗弱、萎蔫、黃化、坐果率低、產量降低和品質下降[1-2];重而短時低溫下植株葉片明顯褐變，葉片葉柄軟化，透明，呈水漬狀，出現脫水現象，組織柔軟并萎蔫皺縮，凍害斑點明顯[3]。

　　研究發現，植物的組織結構特點與抗寒性具有密切相關性，包括植物的葉片厚度、氣孔密度、鱗芽有無、根冠比大小、花器官大小以及厚度、柵欄組織/海綿組織大小等[4]�？购�性較強的植物的葉片氣孔密度較小，角質層和上下表皮比較厚，葉肉細胞排列緊密，葉片組織結構也比較緊密，根冠比較大[5]，細胞間空隙小，枝條木質部、韌皮部和髓的褐變程度較小[6]，有的具有冬芽結構[7]。

　　楊寧寧等對北方油菜抗寒性研究結果表明，抗寒性強的冬油菜苗期表現匍匐生長，柵海比小，氣孔面積小，地下部干質量大[5]。田雪飛研究發現，植物遭受一定低溫后引起了葉片葉緣失綠，根系受損甚至枯死，開花結實率下降，果實畸形，甚至植株死亡[8]。許瑛等對菊花葉片解剖結構緊密度指標的分析表明，抗寒性強的菊花品種葉片和上表皮較厚，柵欄組織發達，葉肉細胞排列緊密，胞間空隙小，抗寒性差的品種則表現為葉片上表皮較薄，柵欄組織層數少、厚度薄，葉肉細胞排列疏松，細胞間隙大[9]。

　　何煜明等研究表明，在水稻幼苗期進行低溫脅迫，因其葉片受到低溫冷害，會使其半飽和光強降低，對光能利用率產生影響，同時，水稻葉片對于光強的耐受程度也大幅下降[10]。姚利曉等在研究中表明，低溫條件下，轉基因甜橙的葉片傷害率隨溫度梯度在一定范圍內呈“S”形變化[11]。曹紅星等解剖低溫處理下椰樹葉片的結構發現，隨著溫度的下降，細胞間隙越大，海綿組織和柵欄組織結構愈發不規則[12]。

　　1.2植物在低溫脅迫下的生理生化變化

　　植物在低溫脅迫下的生理生化變化主要體現在:葉綠素合成受阻，各種光合酶活性受到抑制，故而使光合速率下降[13];光合作用減弱;呼吸代謝失調[14];細胞膜系統受損，體內的各種代謝發生紊亂;植物體內的滲透物質和水含量也會有改變。低溫條件下，植物的呼吸作用在冷害初期短時加強后隨溫度的下降而下降[15]。

　　孫雙印對低溫(25℃為對照、10、5、0℃為處理，處理時間為1d)脅迫下白玉蘭與紫葉李光合生理特征研究顯示，溫度通過影響核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)活性限制和RuBP再生速率來控制葉綠體的光合速率，與正常溫度相比，低溫處理下的羧化效率總體較低[16]。我們發現馬鈴薯在同等光合有效輻射下，凈光合速率隨環境溫度的下降而降低，不同基因型馬鈴薯對10℃溫度的適應性有差異，10℃條件下的馬鈴薯凈光合速率與基因型耐寒性呈正相關[17]。

　　低溫逆境下植物細胞出現收縮，細胞膜的形態和結構發生改變，膜脂從液晶態變成凝膠態，細胞膜一旦受損，離子發生外滲，細胞導電性就會相應發生變化。植物在代謝過程中會產生活性氧(ROS)，活性氧參與細胞內的生理生化反應，在植物正常生長的情況下，ROS分子能夠被氧化防御機制清除，即植物的保護性應急反應[18-19]。

　　但是，在低溫、干旱或者鹽等逆境脅迫環境中，活性氧的動態平衡會被打破，且ROS含量急劇増加，從而對植物造成傷害，產生傷害的可能原因是低溫脅迫超出了植物承受的極限，酶的結構發生了改變[20]。劉貝貝等研究表明，在低溫脅迫下，不同石榴品種的SOD活性呈一直上升趨勢或者先上升后下降趨勢，并且不同品種增加的幅度不同，到達峰值的溫度也不同[21]。植物組織中自由水含量、結合水含量、總含水量以及自由水與結合水含量的比值可以作為評價植物抗寒性的指標[22]。

　　吳飛等研究顯示，隨著處理溫度的下降，總含水量逐漸降低。在一定的范圍內，隨處理溫度的降低，自由水/束縛水比值逐漸下降;超過一定的范圍，雖然自由水和束縛水含量緩慢下降，但比值幾乎不再有變化。自由水/束縛水比值較低，說明細胞液濃度高，保水能力強，抗寒能力較強[23]。

　　滲透調節物質的變化與植物的低溫脅迫也有聯系，可溶性蛋白和脯氨酸的研究較多。可溶性蛋白是一種能夠提高植物保水能力和降低細胞組織間結冰可能性的親水性較強的滲透調節物質。王卓敏等研究發現，抗寒性較強品種的可溶性蛋白含量隨著低溫脅迫時間的延長呈上升的趨勢，但是不同品種間存在差異，有些品種則先上升后趨于平緩，還有一些品種可溶性蛋白含量變動不顯著[24]。脯氨酸是一種親水性有機溶劑，與細胞水勢呈負相關。有學者研究發現馬鈴薯植株脯氨酸含量與抗寒性之間具有高度相關性，抗寒性越強的植株脯氨酸含量越高[25]。

　　1.3植物低溫脅迫下的分子響應

　　目前，低溫信號途徑研究得比較清楚的是CBF[C-repeat(CRT)-bindingfactors]依賴的信號途徑，該途徑屬ABA非依賴性，在CBF途徑中，CBF1、CBF2和CBF3是目前研究熱點，CBF1與CBF2和CBF3同屬一小蛋白家族，且發現CBF2對CBF1、CBF3負調控，即CBF2能夠阻遏調節CBF1、CBF3的表達[26]。

　　CBF基因受到低溫、光照、周期節律等的調控，因此，CBF信號途徑是低溫信號與其他信號相互作用的重要橋梁。研究顯示，植物體內含有鈣離子信號途徑和ICE1(inducerofCBFexpression1)-CBF-寒冷響應途徑調節CBF基因的表達[27]。

　　質膜感受到冷信號，胞質中的三磷酸肌醇(IP3)含量發生變化，胞質內鈣離子的積累，并與鈣調蛋白結合轉錄因子(CAMTA3)形成復合物，CAMTA3與CBF2啟動子上CG-1元件結合，激活CBF的表達。ICE1是類似MYC的bHLH轉錄因子，可特異地結合到CBF3啟動子的MYC作用元件，激活CBF3的表達，表達產物CBF結合到多種寒冷和脫水應答基因，包括它們啟動子的CCGAC核心基序上，進而誘導這些功能基因表達，最終使植物獲得低溫耐受能力[28]。

　　構建轉錄調控網絡以及鑒定參與網絡的轉錄因子對闡明植物逆境應答機制和挖掘抗逆分子改良有著重要的意義。NAC轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子，在抵御逆境反應中發揮著重要作用，其數量眾多，廣泛分布于陸生植物中[29]。

　　NAC蛋白的N端含有較為保守的DNA結合域，C端有的是序列高度可變的與轉錄激活活性調控多樣性有關的TRR區域，有的是負責與質膜或內質網膜錨定的α螺旋跨膜基序(TM)[30]。邊境等利用IlluminaHiSeq技術，分別構建了5℃和22℃處理下的2個玉米葉組織轉錄組。從轉錄組數據中共分離出30條上調和8條下調的低溫響應NAC基因，這些NAC被分為12個亞族(NACa-1)，其中7條上調低溫響應NACs屬于逆境相關亞家族(Stressrelated/NAC-h)[31]。

　　黃榮峰等研究表明，低溫鍛煉是提高植物對低溫的抗性并誘導產生冷反應基因的途徑之一。擬南芥的COR(cold-regulated)基因是冷反應基因之一，冷反應基因編碼的多肽產物均具有親水特性、簡單的氨基酸組成和重復的氨基酸序列，且在水相緩沖液中呈可溶狀[32]。Catalá等研究發現，14-3-3基因的表達會使植物對各種逆境環境產生反應，罕見的冷誘導1A(RCI1A)基因編碼14-3-3psi異構體，并通過控制冷誘導的基因表達對擬南芥的耐寒和冷馴化起負調控的作用[33]。

　　SatoshiKidokoro等研究發現，鈣調蛋白結合轉錄ACTIVATOR3(CAMTA3)和CAMTA5會對迅速降低溫度和誘導DREB1s的表達做出反應，但是這些蛋白質對溫度逐漸降低不會做出反應[34]。miRNAs通過對靶基因mRNA進行切割或翻譯抑制調節mRNA的表達，在植物生長發育和環境脅迫響應中起到重要的作用[35]。

　　安鳳霞等在抗寒品種中檢測到34個上調表達，43個下調表達的miRNA，在低溫敏感品種檢測到50個上調表達，45個下調表達miRNA，這些保守或非保守miRNA在植物的生長發育以及抵御低溫逆境過程中起作用[36]，筆者所在課題組研究也發現經過冷馴化的馬鈴薯中其miR390通過負調控富含亮氨酸重復序列型類受體蛋白激酶基因(LRR-RLK)對低溫產生響應(待發表)。

　　肖仕等的研究揭示了冷害脅迫下擬南芥二酰甘油�；�轉移酶DGAT1和二酰甘油激酶DGK2、DGK3和DGK5調控二酰甘油(DAG)、三酰甘油(TAG)和磷脂酸(PA)的動態平衡，維持膜系統的完整性及細胞內氧還狀態，從而影響植物對冷害的抗性反應。植物遭受低溫逆境時，細胞內脂質代謝活動十分活躍，擬南芥細胞內的DAG、TAG和PA各組分的含量在低溫脅迫下均顯著升高。

　　植物在冷脅迫下，直接參與抗逆性反應的基因被誘導表達，這些基因的表達產物主要分為調控蛋白和功能蛋白。常見的調控蛋白包括鈣調蛋白(calmodulins，CaMs)、鈣依賴性蛋白激酶(CaMdomain-containingproteinkinases，CDPKs)、類鈣調磷酸酶B蛋白(calcineurinB-likeproteins，CBLs)、促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)和互作蛋白激酶(CBL-interactingproteinkinases，CIPKs)等;常見的功能蛋白包括胚胎后期豐富蛋白(LEA)、熱休克蛋白(HSPs)、滲透調節物質的生物合成所需的酶、防凍劑和解毒蛋白質。

　　2植物耐低溫性研究常見的方法

　　2.1直接鑒定法

　　植物耐低溫性大田直接鑒定法是應用最廣泛的一種鑒定方法，包括田間自然鑒定法、生長恢復法、人工模擬氣候室法等[4]。田間鑒定法是根據季節溫度的變化規律，按一定的標準比較植物的器官、組織的受凍情況，根據植物葉片的顏色、水漬斑以及莖桿的透明度來評價植物的抗凍性。植物受凍害程度越低，說明抗寒性越強，抗寒性強的品種，評分也就越低。

　　田間鑒定法大多采用聚類分析法來分析，聚類分析法是將樣品按相似程度劃分類別，使得同一類中元素之間的相似性比其他類元素相似性更強的一種理想的多變量統計技術。劉艷等通過系統聚類和相關性系數法來探討各植物間的親緣關系。得出聚類分析法在植物物種分類及鑒別中是一種可行性手段，其結果與相關性分析結果相吻合[37]。

　　魏亮等的研究結果顯示，馬鈴薯材料損傷評分為2，損傷較輕，抗寒性較好;損傷評分為6，植株基本死亡，抗寒性最差[38]。田間自然霜凍法的分級細致合理，適合大批量的實驗材料，但是同時，該方法周期性長，重復性差，受季節的限制。生長恢復法是將植物材料放在不同的溫度梯度下進行處理，取出后放在適宜生長的條件下測定恢復生長的最低溫度，確定它們抗寒性的一種比較可靠并普遍應用的方法[4]。

　　田娟等利用電導率對植物抗寒性進行比較，得出隨著脅迫程度的加深和脅迫時間的持續延長，植物均呈現出膜相對透性逐漸增大的趨勢，但不同品種間的增幅卻各不相同[39]。人工模擬氣候室法是一種周期較短、可重復性高、不受季節限制的方法，但是模擬人工氣候室的成本較高，并且人工氣候室的空間條件有限，難以進行大批量的材料處理。

　　2.2間接鑒定法

　　植物耐低溫性間接鑒定法包含很多的鑒定指標，主要有細胞膜電解質的測定、氧化還原酶系統、可溶性糖含量的測定、脯氨酸的測定、葉綠素熒光的測定以及DAB組織定位等。細胞膜系統通常是最先受到低溫傷害的部位，逆境導致細胞膜透性加大，細胞內物質向膜外滲透，電解質滲透增大。測定電解質滲漏一直被用作衡量細胞膜結構在逆境中穩定性的一項重要指標，通過定義電解質透出率達50%時的溫度為半致死溫度[40]。

　　進一步優化利用logistic曲線描述低溫對植物細胞膜的傷害過程，Rajashekar等提出曲線拐點為LT50的觀點[41]并在我國得到了廣泛認同。李飛等成功地運用該方法對馬鈴薯資源進行了抗寒性鑒定[42-45]。相對電導率法技術完善，不受季節的限制應用廣泛，不足之處是該方法比較繁瑣、周期長、重復性不好，不適合大批量的材料的篩選。林艷等探究了不同大葉女貞品種的抗寒性，隨著幼苗葉片處理時間的延長，其丙二醛和可溶性糖含量逐漸上升[46]。

　　劉貝貝等對6種石榴品種低溫處理，發現抗寒性較強的材料脯氨酸含量先上升后下降，抗寒性較弱的品種隨著冷脅迫的處理脯氨酸含量不斷上升[21]。丁旭等研究發現，隨冷凍脅迫加強，馬鈴薯葉片斑塊越多，說明抗凍能力越差[47]。DAB組織定位操作比較簡單，成本較小，結果明顯，比較容易辨別，重復性強，但是容易受到人為操作的影響。

　　2.3綜合鑒定法

　　植物抗寒性機理十分復雜，采用單一的指標難以反映其抗寒性本質[48-49]，因此在探究植物的耐低溫性研究時，采用多個生理生化指標去衡量的綜合鑒定法，可增強準確性，常運用到的分析方法有主成分分析法，隸屬函數法和聚類分析法等。主成分分析法是將多個具有一定相關性的評價指標，通過計算轉化成個數較少且代表性彼此獨立的抗逆性綜合評價指標，以減少各指標間原有的相關性，提高評價指標的可靠性。

　　3提高植物耐低溫性的途徑

　　3.1植物抗凍鍛煉

　　將植物在非傷害性的零上低溫條件下誘導其抗寒力逐漸增強的過程稱之為抗寒鍛煉，這個過程可以在人為設置的控制低溫下進行，也可以在自然越冬條件下進行[62]。植物抗凍性是一個非常復雜的性狀，包括抵抗低溫對植物功能的直接影響和因冰晶形成造成的間接影響的能力。

　　經過抗凍鍛煉的植物有一定水平的抗凍性，而未經過抗凍鍛煉的植物在嚴重低溫脅迫下將會死亡，抗凍鍛煉程度與植物生長階段以及冬季的休眠期密切相關，不同品種的植物抗凍性有區別[3]。逆境條件下，植物內源ABA含量也上升，葉片含水量下降，束縛水比例上升，氣孔阻力及可溶性糖含量增加，植株體內的一些酶活性(POD、SOD、CAT、ATP酶)升高，特別是POD酶的活性有了極顯著的提高[63]。

　　Kazuoka等發現，多種植物在低溫鍛煉期間，可溶性蛋白含量隨低溫鍛煉過程抗寒性的提高而增加[64]。但是Uemura等得出不同的結論，即可溶性蛋白質含量在低溫鍛煉中并沒有實質性的改變[65]。林善枝等發現，在不同低溫鍛煉期間，毛白楊幼苗總可溶性蛋白質含量增加，抗凍性增強，可溶性蛋白質含量的增加有助于加強細胞的保水力，提高細胞內的束縛水，降低冰點。用環己亞胺處理幼苗，可溶性蛋白含量隨時間的延長而下降，植物的抗寒性變弱，這種低溫處理的結果與逐漸縮短光照天數的結果是一致的[66]。

　　林善枝的研究結果與劉鴻等[67]、簡令成等[68]的研究一致，在低溫和短日照這2種特定條件下，植物這種潛在的抗凍基因才會表達，從而提高植物的抗凍力。筆者所在課題給研究發現10℃冷馴化10d引起被馴化馬鈴薯材料378個基因顯著上調表達;692個基因顯著下調，97個miRNA顯著上調表達;21個miRNA顯著下調(待發表)。

　　3.2外源生長調節劑的調控作用

　　植物外源生長調節劑是一種植物激素，在低濃度下對植物的生長發育起促進或者抑制的作用[69]。外源生長調節劑對植物耐低溫性影響研究常在脫落酸(ABA)、多效唑(PP333)、油菜素內脂(BR)等中展開。外源生長調節劑的主要功能是誘導植物產生對不良生長環境的抗性。在寒冷脅迫下，脫落酸啟動細胞抗冷基因的表達，誘導植物產生抗寒能力[70]。

　　在水稻[71]、番茄[72]、辣椒[73]等植物上都已經證實，抗寒性強的植物品種，其內源脫落酸含量高于抗寒性弱的品種，并且發現脫落酸可以減輕黃瓜、南瓜、水稻、柑橘的低溫傷害[63]。在未來的農業和生產當中，作物化控技術作為農業生產的新技術，是傳統農藝技術的發展與補充，也是高產優質高效生產技術的重要配套技術[70]。當前階段，關于植物生長調節劑的應用是比較狹窄的，需要開發新的產品來與現代農業匹配，在今后的開發和創新過程中，品種種類多樣、高效，以及多功能的混合制劑是主要方向。

　　3.3基因工程

　　基因工程一種是現代生物分子育種的技術手段�；�因是編碼遺傳信息的基本遺傳單位，基因工程育種具有高效、定向和不受植物世代影響等優點。基因工程育種與常規育種以及分子標記結合起來，加快了植物的育種進程。但由于植物基因工程是一個新興研究領域，研究基礎比較薄弱，還有許多問題有待進一步研究:

　　(1)轉移多個基因的技術不成熟。植物的抗寒性是由多個復雜基因控制的，但抗寒基因工程大多是圍繞單個基因研究。

　　(2)可利用的目的基因不多。植物的抗寒性受一個龐大的調控網絡控制，涉及大量的基因，而目前分離的主要是一些保護類的基因，且多來自擬南芥等模式植物。要想植物的抗寒育種取得更大的突破，必須從不同的植物分離更多的基因，深入研究植物的抗寒分子機理。

　　(3)轉基因的表達系統不完善。目前，抗寒基因工程多采用CaMV的35S組成型強啟動子來啟動外源基因在植物體內的組成型表達，雖在逆境下能較好地提高植物抗寒水平，但在非逆境下，這種不必要的高表達也給植物帶來許多負面效應[74]。

　　利用基因工程的手段，將DREB轉錄因子和抗凍蛋白基因導入煙草、水稻、油菜等植物中，相信隨著分子生物學技術和方法的不斷發展，用基因工程方法提高農作物的抗寒性必將會取得可喜的進展，具有廣泛的實際應用前景[75]。

　　4結束語

　　植物對低溫的適應性受多基因調控，會產生復雜的生理生化反應，采用綜合鑒定法，能比較準確地鑒定植物的抗寒性。在眾多的抗寒性指標中，相對電導率的測定應用最為廣泛，過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等研究的也頗多，在分析的過程中一般采用主成分分析法、隸屬函數法和聚類分析法。

　　綜合近幾年的研究結果可以看出，植物低溫響應機制研究重點已經從基本功能基因轉向信號調控網路。轉錄因子處在低溫信號響應的上游，在轉錄水平上主導著低溫相關蛋白的級聯反應，低溫響應轉錄調控機制正被逐步闡明。

　　另外，miRNA介導的轉錄后基因調節網絡在低溫響應中的作用機制也被逐步揭開面紗，隨著對于miRNA作用機制進一步深入研究，以及利用最新的例如miRNA芯片等高通量的技術手段對于信號轉導中miRNA和靶基因之間的關系進行研究，將會使人們對于植物低溫響應基因表達調控網絡的理解提高到一個新的水平。

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　　農業方向刊物推薦：《中國農業科學》1960年創刊，是農業部主管，中國農業科學院主辦的綜合性、學術性月刊。本刊為綜合性農牧業科學學術刊物。主要發表我國農牧業科學在基礎理論和應用技術方面的學術論文、重要科研成果和專題報告及各學科研究進展綜述等。