摘要：【目的】北方春季低溫冷害是限制花生生產(chǎn)的主要環(huán)境因素之一，鈣素營養(yǎng)可提升花生耐冷性和光合碳同化作用，本研究進一步探究外源鈣緩解花生低溫光合障礙的調(diào)控機制。【方法】以花生品種‘小白沙’試驗材料，在人工氣候室內(nèi)進行了盆栽培養(yǎng)試驗。設常溫噴清水對照(夜溫/晝溫為20℃/28℃，幼苗葉面噴清水);低溫脅迫(夜溫/晝溫為9℃/15℃)下，幼苗葉面噴清水(+H2O)、噴15mmol/LCaCl2(+Ca)、噴施鈣抑制劑(+EGTA)處理，共4個處理。將真葉展開一周的花生幼苗栽于盆中，連續(xù)兩天進行葉面噴施處理，然后在低溫脅迫下生長7天，恢復常溫后再生長7天，共培養(yǎng)14天。于低溫和常溫處理期間，測定花生幼苗生長發(fā)育、光化學活性、非結(jié)構(gòu)型碳水化合物以及活性氧積累。【結(jié)果】低溫脅迫抑制花生生長，導致葉片非結(jié)構(gòu)型碳水化合物和活性氧(ROS)過量積累，同時造成嚴重的光損傷，表現(xiàn)為調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y(NPQ)和非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y(NO)顯著上升，PSI和PSII實際量子產(chǎn)量的顯著降低。外源Ca2+增加了花生幼苗株高、葉面積和葉綠素含量，也顯著緩解了低溫依賴性光損傷，避免了葉片中非結(jié)構(gòu)型碳水化合物的過量積累，增強了花生光合作用水平;外源Ca2+有效降低了ROS過量積累，有效保護光合機構(gòu)。【結(jié)論】低溫脅迫及其恢復過程中，外源Ca2+可以通過有效激發(fā)花生生長發(fā)育和光化學活性，維持葉片中非結(jié)構(gòu)型碳水化合物有效外運，降低碳水化合物和ROS過度積累，全面緩解低溫花生光抑制。

　　關(guān)鍵詞：花生;低溫脅迫;光抑制;活性氧;鈣

　　起源于南美洲熱帶地區(qū)的喜溫作物—花生(Arachishypogaea)是世界重要的油料和經(jīng)濟作物，也是重要的食用蛋白源和食用植物油源，在保障我國食用油安全方面具有舉足輕重的作用[1]。特別是，基于后疫情時代“雙循環(huán)”新發(fā)展格局下、中國大豆產(chǎn)需缺口加大等背景下，中央明確了油料作物結(jié)構(gòu)調(diào)整主要策略之一，就是多措并舉發(fā)展國內(nèi)花生生產(chǎn)替代大豆進口。因此，我國油料作物供給(食用油)安全和國際新形勢新挑戰(zhàn)已然將花生的優(yōu)化施肥技術(shù)與耐冷優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)推到一個前所未有的國家戰(zhàn)略安全高度[2]。

　　遼寧省是我國重要的優(yōu)質(zhì)花生出口基地和產(chǎn)區(qū)之一，花生在遼寧省大田作物中其種植面積僅次于玉米和水稻。遼寧省土壤中黃曲霉菌含量極低，遼寧產(chǎn)區(qū)的花生(黃曲霉毒素顯著低于其他產(chǎn)區(qū))完全符合出口創(chuàng)匯的優(yōu)級標準，這一優(yōu)勢也使得“遼寧花生”在全國乃至全球花生產(chǎn)業(yè)中品牌效應強，不可替代。低溫是限制花生地理分布和生產(chǎn)的主要環(huán)境因子之一，冷害在全球花生生產(chǎn)中普遍存在[3]，在我國尤其以北方高緯度區(qū)域、南方高海拔地區(qū)為甚。研究表明，大多數(shù)花生在幼苗期環(huán)境溫度低于12℃16℃時，植株生長緩慢嚴重時停止生長，葉片會出現(xiàn)脫水、萎蔫，甚至枯死等現(xiàn)象[45]。

　　前人大量研究表明，低溫導致植物光合障礙，生長發(fā)育停滯，甚至死亡;低溫脅迫對植物生長發(fā)育和光合碳同化過程產(chǎn)生負面影響。研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫顯著降低了水稻、玉米、向日葵、高粱、蘋果幼苗的葉面積，抑制了玉米根系生長和干物質(zhì)積累等10。低溫脅迫可破壞光合作用的主要機構(gòu)，包括葉綠體的結(jié)構(gòu)、類囊體膜功能、光合電子傳遞和氣孔運動等1112]，降低植物光合作用水平，進而導致生物量降低、葉片壞死等問題13]。

　　鈣素作為一種植物必需的礦質(zhì)養(yǎng)分，在維持細胞壁和細胞膜的結(jié)構(gòu)完整性和功能穩(wěn)定性上具有多重作用，同時鈣離子作為信號物質(zhì)在調(diào)節(jié)植物應對非生物脅迫中也發(fā)揮重要功能。雖然土壤中含有大量鈣素，但是作物在冷逆境下根系活力和葉片蒸騰速率驟降，時常發(fā)生嚴重吸鈣障礙。為此，葉部抗寒增鈣技術(shù)作為植物應對(寒)冷逆境的外源調(diào)控措施，現(xiàn)已在水稻、玉米、番茄、蘋果、黃瓜、煙草等作物上廣泛應用。

　　外源鈣預處理有助于維持細胞膜的完整性和抗氧化系統(tǒng)的平衡，從而減輕膜脂的過氧化反應20。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，葉面施鈣具有顯著提升花生耐冷性的調(diào)控效應[12-13]，但是外源鈣素的調(diào)控作用是否與解除低溫光合障礙有關(guān)，這有待于進一步探究。為此，本試驗應用人工氣候室盆栽培養(yǎng)花生苗，同時采用外源鈣離子(鈣素正向調(diào)控)及其鈣抑制劑EGTA(鈣素負向調(diào)控)對花生苗進行預處理，從正反兩方面深入探討外源鈣素對花生低溫依賴性光合反饋抑制的調(diào)控作用，這對于最終現(xiàn)實花生生產(chǎn)中科學施用鈣肥，以及進一步開發(fā)寒區(qū)花生高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)施肥配套技術(shù)等具有重要指導意義。

　　1材料與方法

　　1.1試驗設計

　　試驗于2019年在沈陽農(nóng)業(yè)大學土地與環(huán)境學院人工氣候室內(nèi)進行，人工氣候室光合光子通量密度(PPFD)為600μmol/(m2·s)，CO2濃度為400±5μmol/mol，相對濕度為(60±5)%。試驗以東北主栽花生品種“小白沙”為材料，利用48孔穴盤進行花生育苗，待長出第一片真葉時選取100株長勢均勻一致的花生苗移栽至直徑為13cm的圓柱盆中，平均分為4個處理組：

　　1)CK(夜溫/晝溫20℃/28℃+葉面噴施超純水)，2)+H2O(夜溫/晝溫9℃/15℃+葉面噴施超純水)，3)+Ca(夜低溫9℃/晝低溫15℃+葉面噴施15mmol/LCaCl2)，4)+EGTA(夜溫/晝溫9℃/15℃+葉面噴施5mmol/LEGTA)。待真葉展開一周后，連續(xù)兩天(下午3：00~4：00)各處理分別噴施超純水、15mmol/LCaCl2和5mmol/LEGTA，以上調(diào)控處理均為課題組前期篩選得出的最佳濃度[4,12-13]。于葉面噴施試劑處理后的第二天夜晚開始，模擬常見的花生苗期低溫冷害情況，低溫持續(xù)處理7天。于第7天的夜間恢復常溫20℃，繼續(xù)生長7天，整個試驗處理周期為14天。

　　1.2測定方法

　　1.2.1生長指標的測定方法

　　各處理隨機選取生長均一的3株，于低溫處理第7天和恢復常溫后的第7天上午9：00~10：00測量生長指標。株高與莖粗利用直尺與游標卡尺測量，葉面積和相對葉綠素含量(SPAD值)分別利用LI-3000C葉面積儀和CCM-200plus葉綠素儀測定。

　　1.2.2光合及熒光參數(shù)的測定方法

　　光合和熒光參數(shù)分別在低溫的第1、4、7天及其常溫恢復過程中的第1、4、7天的上午9：00開始測定，每株選取“倒三葉”作為指定葉片，各處理隨機選取3株作為重復。光合氣體交換參數(shù)采用GFS-3000(WALZCo.，德國)測定。

　　最大光化學效率Fv/Fm、PSI實際量子產(chǎn)量Y(I)、PSI電子傳遞速率ETR(I)、供體側(cè)限制引起的PSI處非光化學能量耗散的量子產(chǎn)量Y(ND)、受體側(cè)限制引起的PSI處非光化學能量耗散的量子產(chǎn)量Y(NA)、PSII實際量子產(chǎn)量Y(II)、PSⅡ電子傳遞速率ETR(II)、PSII處非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y(NO)與PSII處調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y(NPQ)利用雙通道葉綠素熒光儀Dual-PAM-100(WALZCo.,德國)測定。

　　1.2.3碳水化合物及活性氧含量的測定方法

　　在低溫處理的第7天和恢復常溫的第7天取樣，測定葉片碳水化合物和活性氧含量測定。各處理隨機選取3株的倒三葉，105℃殺青30min、65℃烘干、粉碎。葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉等含量測定參照薛應龍[21]方法。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定，過氧化氫(H2O2)含量的測定參照Jana[22]方法并加以改進。超氧陰離子的測定方法按照王愛國和羅廣華[23]的方法并加以改進。

　　1.3數(shù)據(jù)分析

　　利用Excel201制表，Origin2021作圖。采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析和最小顯著差數(shù)法(SD)檢驗，結(jié)果以個生物重復的平均值和標準誤差表示。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1低溫脅迫及常溫恢復條件下外源鈣素對花生幼苗生物量的影響

　　在低溫處理天時，噴施和EGTA處理株高顯著低于CK，而噴施Ca處理與CK無顯著差異;而在恢復常溫天后，+H、+Ca和+EGTA個處理的株高之間無顯著差異，但均顯著低于與CK。低溫脅迫下，噴施處理莖粗最大，而恢復常溫后，施Ca處理莖粗最大，噴施EGTA處理最小。對照葉面積在低溫脅迫和恢復常溫后均最大，其他個處理低溫下無明顯差異，但噴施Ca處理比施和EGTA處理高45.3%和22.6%。

　　低溫脅迫顯著降低了相對葉綠素含量SPAD，而恢復常溫后，除了噴施EGTA處理顯著降低了SPAD值之外，其余處理差異不顯著。低溫脅迫下，噴施Ca處理的根冠比雖然顯著高于CK，但也顯著低于噴施和EGTA處理;恢復常溫后，噴施EGTA處理的根冠比與依然顯著高于CK。

　　2.2低溫脅迫及常溫恢復條件下外源鈣素對花生葉片光合氣體交換水平的影響

　　凈光合速率(Pn)整體呈先下降后上升逐漸趨于平緩的趨勢，在低溫脅迫7天，噴施Ca和施H2O處理Pn低于CK，但高于噴施EGTA處理;恢復常溫7天后，噴施Ca處理的Pn與CK無顯著差異。

　　細胞間二氧化碳濃度(Ci)隨著低溫脅迫天數(shù)的增加，整體呈先增長后下降的趨勢。低溫脅迫下噴施EGTA處理的氣孔導度(Gs)最低，噴施Ca處理與CK差異最小，恢復常溫后，噴施H2O與噴施EGTA處理有增加趨勢。蒸騰速率(Tr)隨低溫脅迫天數(shù)增加逐d漸降低，恢復適溫逐漸趨于平穩(wěn)，在低溫脅迫下，噴施Ca處理Tr值與CK無顯著差異。

　　瞬時水分利用率(WUEt)隨低溫脅迫天數(shù)增加逐漸降低，恢復適溫逐漸趨于平穩(wěn)，低溫脅迫下，以噴施Ca處理最大。氣孔限制值(Ls)整體呈先下降后上升的趨勢，低溫脅迫1~4天快速下降，恢復常溫后上升趨勢明顯。綜上，隨著低溫時間的延長，花生葉片Pn、Gs、Tr也逐漸降低，Ci逐漸上升，恢復常溫7天后，噴施Ca處理的Pn、Tr、WUEt與CK無顯著差異。

　　2.3低溫脅迫及常溫恢復條件下外源鈣素對花生最大光化學效率Fv/Fm的影響

　　PSII最大光化學效率Fv/Fm隨著低溫脅迫時間的延長呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，低溫脅迫下的三個處理變化趨勢相似，隨低溫脅迫時間延長，噴施EGTA處理下降速率最大，噴施H2O和噴施Ca處理下降的趨勢與噴施EGTA處理相比較為緩慢;在低溫脅迫第7天，低溫的三個處理與CK相比有顯著差異，其中施Ca處理最大;在常溫恢復的1~4天，除CK外的三個處理Fv/Fm呈快速上升的趨勢，噴施Ca處理在恢復常溫第7天恢復到CK水平。

　　2.4低溫脅迫及常溫恢復條件下外源鈣素對花生葉片PSI和PSII光化學活性的影響

　　低溫脅迫1~7天中，+H、+Ca和+EGTA個處理的Y(I)和ETR(I)都顯著降低，但噴施Ca處理降低最少;恢復常溫后，+H、+Ca和+EGTA個處理的Y(I)和ETR(I)均呈上升趨勢，且在恢復常溫后的1~4天的ETR(I)增加速率最大。

　　在低溫脅迫1~7天中，Y(ND)和Y(NA)呈上升的趨勢，其中施Ca處理的Y(ND)最大，CK最小。Y(II)和ETR(II)總體趨勢與Y(I)和ETR(I)相似，其中在1~4天的低溫脅迫期間ETR(II)下降速率最大，Y(II)在第7天常溫恢復時達到CK水平。隨著低溫時間延長，Y(NO)顯著上升，噴施H2O和EGTA處理的Y(NPQ)與Y(NO)高于施Ca處理，低溫條件下的+H、+Ca和+EGTA個處理間顯著差異。

　　2.5低溫脅迫及常溫恢復條件下外源鈣素對花生葉片非結(jié)構(gòu)性碳水化合物積累的影響

　　在低溫處理7天，葡萄糖含量+Ca處理顯著高于其他處理，+H2O和+EGTA處理顯著低于對照;在常溫恢復7天，+H2O、+Ca和+EGTA顯著低于對照。低溫條件下三個處理的蔗糖含量顯著增加，其中+H2O和+EGTA處理與對照相比差異顯著。在恢復常溫后，蔗糖含量都大幅度降低，其中+Ca處理與對照最相近。

　　低溫脅迫下三個處理葉片果糖含量明顯高于對照，其中+Ca處理最高，其次為+H2O和+EGTA處理。恢復常溫7天，果糖含量大幅度降低，但處理間仍存在顯著差異，以+EGTA處理的果糖含量最高。低溫脅迫下+H2O處理淀粉含量最高，+Ca處理與對照無顯著差異，恢復適溫后淀粉含量增加，+Ca與對照無差異。

　　3討論

　　低溫影響植物的生長發(fā)育，減少生物量積累，低溫脅迫嚴重時造成不可逆?zhèn)�害。花生屬于典型喜溫作物，低溫環(huán)境顯著影響花生生長發(fā)育，甚至造成缺苗斷壟、空殼減產(chǎn)，導致嚴重經(jīng)濟損失。很多研究表明，在逆境條件下外源鈣能有效提升氣孔導度和凈光合速率等作用[2324];同時也可提升Rubisco25與1,5二磷酸核酮糖羧化酶的活性、增強類囊體中電子傳遞速率等進而增強光合效率[26]。

　　本研究表明，葉面噴施外源Ca2+增加了花生株高、葉面積和葉綠素含量，也顯著緩解了低溫依賴性光損傷;有效緩解了花生葉片中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的過量積累，增強了光合能力;有效降低了O2.-、H2O2和丙二醛的過量積累，保護了光合機構(gòu)。前人研究表明，外源Ca2+間接緩解了夜間低溫脅迫造成的gs和Tr的驟降，維持了Ci，防止了Pn的下降，Ca2+改善了光合碳水化合物在韌皮部的裝載和轉(zhuǎn)運等，外源Ca2+可以顯著修復低夜溫造成的光合膜損傷，緩解番茄、蘋果、煙草、花生等植物的光系統(tǒng)損傷，特別是緩解PSI光抑制[27-28]。

　　以往的觀點認為，植物PSI比PSII更穩(wěn)定而不易受到光損傷，然而新的研究表明，PSI復合物基質(zhì)側(cè)的鐵硫簇極易受到光系統(tǒng)中活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)的破壞[29-30]，尤其是波動光強和光強-溫度交叉脅迫下PSI的光損傷更為嚴重，甚至PSI的光損傷要早于PSII。

　　本研究發(fā)現(xiàn)，外源Ca2+有效緩解了低溫脅迫對花生生長的不利影響，特別是有效減緩了Fv/Fm的降低，這說明外源Ca2+有效恢復了低溫條件下花生葉片PSII的功能，降低了葉片中蔗糖的積累，降低活性氧帶來的損傷，有效提高了花生葉片的光合活性[31]。前人研究表明，植物可溶性碳水化合物的積累在冬季抗寒生存中起著重要的作用[32]，通常蔗糖是在低溫條件下積累的游離糖[33]，另有國內(nèi)外學者認為過多的碳水化合物積累使光合碳同化作用水平降低，并認為造成生物量減少的原因是碳水化合物的反饋抑制作用[34]。

　　本試驗研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫使花生幼苗葉片中蔗糖、果糖及淀粉大量積累，Pn降低，ETRI和ETRII的下降;噴施外源Ca2+減緩蔗糖、果糖、淀粉等的過度積累，減緩了ETR和Pn的降低，說明噴施Ca2+可減緩由非結(jié)構(gòu)型碳水化合物過度積累造成的光合效率降低，從而提高了低溫脅迫下花生葉片的光合能力。

　　何潔等人[35]的研究認為形成的大量淀粉粒會改變二氧化碳向細胞內(nèi)擴散的途徑，影響葉綠體中二氧化碳的吸收與運輸使光合效率降低，出現(xiàn)光合速率和呼吸速率降低、同化物質(zhì)運轉(zhuǎn)緩慢等應激反應，導致淀粉及可溶性糖的過度積累。在我們低溫脅迫后的常溫恢復的實驗結(jié)果可知，花生葉片中蔗糖、葡萄糖和果糖含量都顯著降低，淀粉含量依舊較高;外源施Ca2+處理有效降低非結(jié)構(gòu)型碳水化合物積累量，并可恢復至對照水平。

　　低溫阻礙葉片中蔗糖的運輸，大量非結(jié)構(gòu)型碳水化合物的堆積會顯著抑制光合碳同化過程[36-38]，這是使光合作用下降的主要原因之一;磷酸丙糖轉(zhuǎn)化成更多的淀粉，淀粉來不及轉(zhuǎn)化為蔗糖向外運出，導致蔗糖外運受到阻礙，進而葉片中積攢大量淀粉[39-41]，最終產(chǎn)生嚴重的抑制作用。有研究表明，碳水化合物與活性氧的關(guān)系密不可分，認為碳水化合物中的某些可溶性糖是活性氧代謝系統(tǒng)中重要的成分，可使植物抵抗過氧化損傷[42]，也有研究表明活性氧的積累會上調(diào)可溶性糖的積累，從而適應非生物脅迫[43]，活性氧在植物發(fā)育和生長過程及脅迫環(huán)境中起到調(diào)節(jié)作用，是不同脅迫與植物發(fā)育和生長控制之間的重要聯(lián)系[44-46]。

　　本試驗結(jié)果顯示，在低溫脅迫后O2.-產(chǎn)生速率、H2O2含量以及MDA含量顯著增加，這與羅婭等[47]研究結(jié)果一致，外源鈣有效降低了O2.-、H2O2和丙二醛的大量積累，降低了光合機構(gòu)的損傷。Ca2+應對非生物脅迫調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號也起著重要作用，可以抑制植物細胞膜脂過氧化，減輕活性氧的毒害作用。鈣和ROS最初被認為是相互作用的，因為鈣直接或者間接地對RBOHs(植物爆發(fā)式氧化酶，活性氧的主要來源)產(chǎn)生負調(diào)控，并可通過激活/抑制激酶/磷酸酶活性介導鈣通道的開閉[48]。

　　本試驗結(jié)果顯示，外源Ca2+有效緩解ROS大幅度增加，噴施鈣離子抑制劑(EGTA)會顯著增加O2.-產(chǎn)生速率，進而反向證明了Ca2+可有效降低活性氧的產(chǎn)生。在低溫下ROS水平升高，ROS從源頭抑制了蛋白質(zhì)的合成，特別抑制了D1蛋白的合成，D1蛋白是光系統(tǒng)II反應中心的組成部分[49]。

　　在不利于CO2固定的環(huán)境條件下，光合色素吸收過多的光能會抑制光損傷PSII的修復，從而增加光抑制的程度。因此，ROS不僅抑制PSII蛋白的合成，而且抑制PSII修復速率[50-51]。此外，鈣可以穩(wěn)定脂質(zhì)層的基本結(jié)構(gòu)通過調(diào)節(jié)自身濃度，減少ROS對膜脂過氧化損傷，有著至關(guān)重要的作用[52]。常溫恢復后，花生葉片丙二醛含量迅速下降[53]，說明低溫脅迫及其恢復過程中，葉面噴施Ca2+有助于降低花生葉片丙二醛含量，增加植株冷適應性。

　　4結(jié)論

　　低溫脅迫及其恢復過程中，外源Ca2+可以有效提升花生生長發(fā)育和光合作用水平、顯著降低碳水化合物和ROS過度積累，全面緩解低溫光抑制。

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　　作者：劉欣悅，劉軼飛*，孫志宇，張思威，馬明珠，韓曉日