摘 要：尿素是農業生產中施用量最多的氮肥之一，也是植物體內重要的代謝中間產物。普遍認為，植物主要吸收土壤中經土壤微生物轉化產生銨態氮和硝態氮，直接吸收尿素和內部水解作用并不顯著， 但這一觀點正受到挑戰，因為植物擁有專用的尿素轉運蛋白，能夠利用尿素作為唯一氮源。本文通過概述尿素在不同生命系統中存在的基礎生理意義及 MIPs 和 DUR3 系統在調控尿素吸收、轉運以及庫/源間氮循環過程的作用，討論了脲酶在促進尿素氮的同化、信號傳導，精氨酸途徑和酰胺途徑在維持 C/N 代謝平衡和激素信號網絡調節機制，以及植物尿素代謝及穩態調節機制在農業運用方面的展望。通過闡述植物體內局部尿素濃度與整體的氮素狀態信號的反饋調節調控氮素的吸收和再利用的復雜調控網絡，為提高作物氮的吸收、利用及再分配和農作物遺傳改良奠定理論基礎。

　　關鍵詞：尿素;DUR3 蛋白;MIPs 蛋白;脲酶;精氨酸;酰脲

　　作物的生長發育依賴于土壤中多種營養元素的吸收，尤其受大量營養元素氮(N)供給制約，供應不足通常導致產量和品質下降，嚴重時導致約50%的產量損失[1]。因此，農業生產中大量增加施氮量以提高作物生產力，減輕日益嚴峻的糧食安全壓力。與硝態氮肥和銨態氮肥相比，尿素由于價格便宜 (低 15% ~ 20%)、含氮量高 (占比 46%)、水溶性高和化學性質相對穩定，以及能與大多數肥料一起混合施用等特性，在多種作物生產中被廣泛運用。目前尿素在農業生產中施用量占世界氮肥總消費量的 55%，每年仍以 1.5%的速度遞增[2]。農業生產中為追求高產而大量使用化學合成肥料，雖然帶來了巨大的經濟效益，但是很少有作物可以短期內直接大量利用尿素，過量或不當應用導致氮肥利用效率降低，從而造成生態系統功能的破壞和增加人類健康風險[2-3]。

　　以中國為例，2017 年使用的尿素為 2.22×107 t，其中有 1.48×107 t 尿素在根際微生物硝化、反硝化作用或土壤脲酶的作用下流失，損失率高達 66.66%，直接經濟損失超過 500 億元人民幣(國家統計局，2017. http:// www. stats. gov. cn)。此外，大量施用尿素后，土壤中尿素濃度由通常小于10 μmol·L-1 升高到近 70 mmol·L-1，導致根系大量轉運和儲存尿素氮，在脲酶作用下會使細胞內氨基酸的濃度增加，特別是谷氨酰胺和天冬酰胺的濃度增加，總氨基酸濃度升高會激活氮素平衡機制，從而抑制植物對尿素的吸收，嚴重時引起燒苗現象[4-5]。因此，現代農業需要以優化土壤氮和施用氮的平衡，使氮肥施用更具成本性和生態效益兼容性。

　　目前針對提高作物對尿素利用效率的研究，主要通過根據不同農業生態環境中各栽培品種的需氮特性，制定諸如 4Rs(正確來源、正確比率、正確時間和正確地點)養分管理策略;根據植物-土壤系統中氮代謝途徑的生物學、化學和物理學過程，設計新的、更有效的緩控釋氮肥材料，以及利用遺傳或生物技術方法培育新品種來實現[6]。而對尿素的吸收和代謝研究主要停留在其作為一般氮肥的形式，缺少營養生理學和蛋白質組學等研究來闡明尿素吸收、轉運的穩態和信號調控機制。本文綜述了尿素 DUR3、MIPs 轉運和脲酶參與的尿素吸收和同化機制，以及精氨酸和酰胺參與的氮素循環調控網絡的最新研究進展，解析了尿素作用于植物局部或系統水平的生理、形態和分子水平上調節機制，以期從理論上認識與尿素相關的植物氮素營養，為探索提高作物尿素態氮的利用效率開辟新的思路或途徑。

　　1 尿素吸收轉運機制對氮素利用的影響

　　作物尿素的吸收及其積累取決于田間管理、農業實踐、環境、遺傳特性和其他養分的有效性等，其中氮肥施用和作物遺傳特性是影響尿素氮在不同植物中積累的關鍵因素。由于尿素的分子量較小且其水溶液呈電中性，因此，長期以來尿素分子被認為與水分子類似，易通過自由擴散的方式跨生物膜進入細胞。然而利用 C14 尿素吸收測定法和電生理膜片鉗測試技術，發現植物細胞中存在逆電化學梯度的主動吸收途徑和膜蛋白促進型的跨膜擴散的被動運輸系統[7]。

　　1.1 尿素高親和轉運的主動運

　　輸曹鳳秋等[8]通過與啤酒酵母尿素轉運蛋白鑒定對比，發現擬南芥中 DUR3 在尿素濃度極低的條件下也能與驅動二級活性轉運的質子一起協同轉運尿素，且對尿素的吸收具有專一選擇性，表觀親和力常數為 3~4 μmol·L-1，屬于高親和力轉運體。AtDUR3主要在根表皮細胞的質膜上表達，轉錄水平受植物缺氮程度的增加而升高，在缺氮條件下，該蛋白的轉錄水平更為顯著[8]。利用反向遺傳法對水稻 dur3突變體在以尿素為單一氮素條件下培養，與野生型相比，OsDUR3 的大量表達使水稻能夠在低尿素條件下更好地生長，并吸收更多的尿素，而敲除OsDUR3則導致水稻dur3突變體的根系顯著減少且尿素吸收受到抑制[9]。

　　DUR3 不僅可以增強植物根系對外界環境尿素的吸收，而且在木質部和幼芽附近的質膜上表達，為種子萌發或氮脅迫條件下作為響應因子緩解缺氮影響，參與植物氮素循環中尿素的再分配。例如，水稻種子在萌發過程中，OsDUR3的轉錄在種子萌發后 1 ~ 6 d 顯著增加，并且與胚乳中尿素濃度成正比[10]。在自然或缺氮誘導的衰老過程中，DUR3 基因在維管組織中高度表達，將葉肉細胞中含氮化合物降解產生的尿素回收并轉運到線粒體中[11]。在 OsDUR3 缺失突變體 (Tos17)中，尿素因無法正常轉運導致在葉片中積累，使圓錐花序不能充分發育，籽粒灌漿量下降近 50%[9]。對擬南芥衰老葉片的葉柄分泌物分析顯示，降解產生的尿素占含氮有機物的 13%以上[12]。

　　1.2 尿素低親和轉運的主動運輸

　　尿素的被動運輸主要是由內在蛋白(MIPs)介導的，也稱為水通道蛋白，這些蛋白質通過通道沿濃度梯度傳導特定的低分子溶質。植物中存在 5 個MIPs (major intrinsic proteins, MIPs)亞科：質膜內在蛋白 (plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)、液泡膜內在蛋白 (tonoplast intrinsic proteins, TIPs)、類根瘤-26 的內在蛋白(nodulin 26-like membrane intrinsicproteins, NIPs)、堿性小分子內在蛋白(small, basicmembrane intrinsic proteins, SIPs)，以及未知內在蛋白(X-intrinsic Proteins, XIPs)，統稱為 MIPs [13-14]。MIPs對尿素吸收的動力曲線呈直線型，最高濃度為 30mmol·L-1，這是典型低親和力轉運蛋白的運輸特性[15]。

　　利用綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)進行標記，發現擬南芥 TIPs (AtTIP1.1、AtTIP1.2、AtTIP2.1 和 AtTIP4.1)蛋白在整個植物體中均有較高轉錄的水平，在 pH 為 5 ~ 8 范圍的尿素溶液中活性顯著，并且在根系質膜上的轉錄調控機制與DUR3相似，即受植物組織氮營養狀況的調節[16]。此外，TIPs 家族的 TIP1.5 蛋白在液泡膜的位置上，有助于提高擬南芥花粉管中尿素分子從液泡向線粒體基質滲透的效率[17]。這些研究表明 TIPs 蛋白可能既承擔了對尿素進行跨質膜運輸/吸收的功能，又擔負了將細胞質中的尿素轉移并貯存于液泡中的職責，從而防止了高濃度尿素在胞質中產生毒害作用，以保證植物的正常發育[18]。PIPs 水選擇性孔相對較窄，只允許尿素緩慢通過，與低氮供應相比，高氮供應條件下OsPIP1s 基因表達下調，與此同時葉綠體中的 CO2運輸減少，表明 OsPIP1s 基因表達受到組織內 C/N平衡影響[19]。

　　此外，AtPIP2.1 基因參與葉片生理性缺水誘導的脫落酸形成和調節氣孔開關，通過葉片的水分傳輸影響尿素吸收[20]。而 TIPs 和 NIPs 恰與之相反，可轉運足夠的尿素，以支持 dur3 缺陷型突變體在僅以尿素為氮源的條件下生長[21]。Grondin等 [22]指出 PIPs 和 TIPs 在植物尿素氮吸收、水分運輸和側根的發育中起著重要的作用，PIPs 在根系吸水貢獻率高達 85%。NIPs 的調節具有底物特異性，通過其對水、尿素和甘油，以及硅，硼，銻等金屬離子等小溶質的滲透性驗證表明，水溶性越好轉運效率高[23]。例如，黃瓜在缺氮時可誘導 CsNIP2.1基因的表達，并在以尿素為單一氮源的培養基上使dur3-3 突變體的缺氮癥狀消失[15]。

　　相反，在只有尿素供應的培養基中，擬南芥的 AtNIP5.1 和 AtNIP6.1基因表達相對較低，但是相似條件下植物中 DUR3的表達較高，表明 AtNIP5.1 和 AtNIP6.1 的下調與過量尿素水平下尿素/氨的脫毒有關[24]。因此，DUR3和 MIPs 對植物高效利用尿素及維持植物體內的氮營養平衡有重要意義。尿素既可產生于多種氮代謝途徑，也能通過位于質膜上的高(HAT，如 DUR3 途徑)、低(LAT，如MIPs)親和力運輸系統從環境中進入細胞內。植物中合成尿素的酶主要包括: (1)精氨酸酶;(2)胍丁胺酶;(3)刀豆氨酸水解酶;(4)脒基/酰胺水解酶類，如尿囊酸脒基水解酶和尿素裂解酶。尿素可能通過液泡膜上的轉運蛋白(如液泡膜內在蛋白, 即 TIPs)在液泡和細胞質間被區間化。胞質中的尿素經脲酶水解為氨，進而在谷氨酰胺合成酶的作用下進入氮同化途徑。

　　2 脲酶活性對氮同化的調節作用

　　尿素是否可被植物迅速地利用，取決于植物內外環境中存在的脲酶活性。在植物細胞中，已知能分解尿素的酶有 2 類：脲酶(或尿素酰胺水解酶)和尿素酰胺酶。二者均在細胞質中將尿素水解為 CO2和 NH3，NH3/NH4+隨即被谷氨酸合成酶利用，以供其他含氮大分子(蛋白質及核酸等)的生物合成[25]。但是，在高等植物中尿素僅能通過脲酶分解而進入氮同化途徑。除從刀豆中提取的刀豆毒素 CNTX(canatoxin, CNTX)是由一個 Ni2+和一個 Zn2+催化外，幾乎所有高等植物脲酶都是酰胺水解酶和磷酸三酯酶家族的成員，它們在其活性位點上具有 2 個 Ni2+作為酶活性的活性催化位點[26]。脲酶經過 UreD、UreF、UreG 和 UreE 等輔助蛋白與由賴氨酸羧基化的活性位點，及 4 個組氨酸和一個天冬氨酸殘基結合形成羧基橋接兩個 Ni2+，后與其他 3 個末端水分子在活性位點形成氫鍵鍵合的水四面體簇，從而形成具有穩定催化過渡態產物并加速尿素水解反應的脲酶活性[27]。

　　Ni2+缺乏極大的降低了脲酶活性，導致尿素在大豆葉片中積累從而影響植物氮素代謝，誘發缺素癥狀，嚴重時影響酰脲代謝、尿素循環和尿素吸收[28]。將土壤中 Ni2+濃度從 0.1 mg·kg-1增加到 10mg·kg-1，脲酶活性增加了 20% ~ 30%，大豆芽和葉中氮積累則分別增加了 42%和 50%[29]。通過慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)評估脲酶在大豆根瘤中的作用發現，大豆和刀豆的脲酶可作為體外細菌細胞識別的趨化因子，促進豆科植物的根瘤固氮作用。與野生型植物相比，缺乏脲酶的突變大豆植株的根瘤較大，但數量較少，這表明脲酶除了參與尿素代謝外，還具有促進尿素吸收的作用[30]。在一些豆科和葫蘆科植物的高活性種子中存在一些特異性脲酶：ubSBU (ubiquitous urease, ubSBU)、eSBU (Embryo-specific urease, eSBU)和 SBU-III (enzymatically inactive urease isoform, SBU-III)，在參與植物防御機制和促進尿素轉運過程中發揮作用[31]。

　　ubSBU 由 Eu4 基因編碼并普遍存在于植物組織中以低水平表達，負責調控內源性或外源性尿素再循環[32]。eSBU 由 Eu1 基因編碼，在成熟種子的活性遠高于其他植物組織中的 ubSBU 活性，主要參與種子胚胎中氮素積累和種子萌發中氮素代謝[33]。SBU-III是新發現的一種酶促失活的脲酶同種型蛋白，由 Eu5基因編碼，在發芽種子、根發育的第一階段和胚胎發育過程中均有表達，其轉錄水平低于其他兩種大豆同工型脲酶，且 ubSBU 和 eSBU 酶活性較高時，SBU-III 主要參與抵御生物脅迫[34]。通過對大豆幼苗進行人為機械損傷處理后的根和葉片組織采用RT-PCR，對 ubSBU 和 UreG 基因的定量轉錄水平進行檢測，并與脲酶活性進行比較。結果表明 ABA、SA、JA 和 GA 均大量表達并誘導脲酶基因的表達，但脲酶活性不受影響[35]。除此之外，脲酶表達通常受氮代謝的調控，當細胞在 NH4+-N 條件下生長時，酶的合成被阻止，然而尿素或其他氮源存在時，脲酶活性被激活[36]。因此，植物體內脲酶活性是尿素同化效率的重要指征。

　　3 尿素代謝在氮素積累中的作用

　　植物在生長過程中需要大量的氮素，尤其是在幾個關鍵的生長節點，環境中有限的氮供應不足以滿足植物正常生長需求，植物需要從生物大分子(蛋白質和核酸)中回收和重新分配儲存的氮，以滿足幼嫩器官的優先發育。例如，氮供應不足或逆境條件下，通過代謝儲藏在老葉中的精氨酸或酰胺，可以有效提高葉片水勢、光合效率和抗氧化酶活性，并促進滲透壓物質的積累以維持內源光合和代謝穩定，以及器官之間的尿素有效轉運，從而提高氮素利用率和消除其對環境的負面影響[37-38]。一些證據表明，尿素循環或酰胺代謝循環的激活，也會促進植物激素的表達上升，參與根系發育和氮素調節的長距離信號傳導[5]。

　　4 植物尿素代謝及穩態調節機制

　　在提高氮素利用率上的展望與銨態氮(NH4+-N)和硝態氮(NO3--N)等化學合成肥料相比，施用于土壤的尿素會被土壤中微生物產生的胞外脲酶快速水解，產生 NH3 揮發到大氣中或進一步硝化成 NO3-流失，其水解速率是正常降解速率的 1 014 倍[54, 67]。據估計，全球尿素通過NH3途徑平均損失 13% ~ 56%，特別是在輕質土壤、高溫高濕和高氮比環境中，NH3 揮發最為嚴重[68]。

　　為了解決這些問題，人們開始探索可持續的作物種植方式，以提高氮素利用率。例如，尿素施用后立即灌溉約 15 mm 的水足以將肥料摻入土壤并減少90%的 NH3損失;通過機械或灌溉將尿素摻入土壤，或尿素的摻入深度大于 7.5 cm 時，NH3的揮發可忽略不計[69-70]。基于氮素管理實踐，通過添加含硫尿素涂層、有機聚合物涂層、無機-生物涂層、基于尿素作用方式涂層和基于多種營養物質的定向合成涂層制成緩/控釋包膜尿素，因其涉及抑制胞外脲酶活性從而降低 NH4+產生和通過硝化抑制劑實現 NH4+硝化至 NO3-的速率減緩，減少系統中尿素氮的損失。利用脲酶是植物從環境中吸收尿素和代謝產生的尿素中的氮再循環所必需，在氮需求旺盛或響應脅迫階段，植物通過調節尿素代謝或轉運機制，刺激氮素調控的網絡機制以協調植物尿素的分配途徑，使尿素氮轉運或分配更有效，從而提高植物氮利用效率[34]。

　　如在土壤中施用尿素肥料之前，適當的在葉片中噴灑尿素可以提高尿素的吸收效率。根據植物根系對養分的趨向性和地上器官養分信息的系統整合特性，通過一側施用尿素，而另一側根系處于氮缺乏狀態，建立依賴于外部氮素供應和內源氨基酸庫的大小或組成所反映的器官氮狀態信號的根系構型(root system architecture, RSA)，該過程在氮素缺乏的根系比例不太高(小于 50% ~ 75%)，其他的根系就可以在短時間內完全彌補缺氮帶來的生長抑制[71-72]。5 結論尿素理化性質比較穩定，其吸收和循環利用過程受土壤尿素濃度和植物氮感受系統的信號網絡調節系統調控。

　　植物種植論文范例：植物保護與病蟲害綜合防治技術

　　首先，植物根系對尿素吸收系統 MIPs和 DUR3 轉運機制為尿素轉運調控的關鍵轉運蛋白的改良和促進根獲取尿素氮的靈活性奠定了基礎;其次，脲酶在促進尿素氮的利用和信號傳導以及在尿素代謝和脅迫響應過程中的作用尤為明顯;最后，尿素內源性代謝中，精氨酸途徑和酰胺途徑對植物生長過程中氮素補充和再利用，以及在種子萌發、生殖生長和響應脅迫過程中維持 C/N 代謝平衡和激素信號傳導具有重要的生理意義。然而，在農業生產中尿素的直接利用還有許多的工作要做。關于根吸收系統的結構和調控機制了解不夠全面，在模式植物中 DUR3 和 MIPs 轉運蛋白家族的功能是否適用與農業生產。在高養分環境下的多年育種栽培，使大部分農作物在養分限制條件下對土壤中N資源的感應和精確定位減弱，也阻礙了關鍵轉運蛋白基因優化育種或生物技術應用。因此，對植物氮素利用過程中氮素感測系統的進一步了解，為探索提高作物尿素態氮的利用效率開辟新的育種思路或途徑，提高植物尿素的吸收和代謝具有減少農業系統氮素損失的潛力。例如，可以通過尿素轉運蛋白(誘導型)的過表達來增加植物中尿素的攝取或分配。

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　　作者：張海濤，宋遠輝，鄭思怡，花 芹，楊 曄，林泉祥