摘要在大連東港被原油污染的潮間帶篩選出一株能在低溫脅迫下產生物表面活性劑的石油降解菌，命名為DG-1。通過16SrRNA基因測序方法鑒定該菌株為鹽單胞菌。在4℃的低溫下，經過15、30、60d的降解培養后，分別有14%、41%和58%的原油被該菌株降解。菌株DG-1可利用柴油和原油為碳源產生物表面活性劑，其中以柴油為唯一碳源時發酵液的表面張力可降低至32.4mN/m。薄層色譜和紅外光譜實驗結果表明所產的表面活性劑為糖脂類表面活性劑。

　　關鍵詞低溫石油降解菌生物降解生物表面活性劑

　　目前還未發現能完全替代石油的清潔能源[1];但是隨著石油的開采、儲運和加工，石油污染對環境和人類健康的危害越來越大[2]。潮間帶處于海陸生態交錯區，生態系統服務價值巨大但是環境較為敏感，溢油事故往往對其造成嚴重危害。如果溢油發生在寒冷季節，在低溫脅迫下易揮發的石油組分蒸發速率降低，長鏈烷烴的石油烴組分呈不溶狀，從而導致石油污染物持續存在[3]。

　　此外，低溫也加大了石油污染清除工作的難度。因此發生在低溫時的溢油事故往往危害更大。例如ExxonValdez油輪溢油事故污染了約1700km的海岸帶，大量海鳥、海獺和魚類死亡，對周圍環境的影響一直持續到現在[4，5]。生物方法具有效率高、費用低、不需大型設備和生態友好等特點[6]，在清除海岸帶等生態敏感區的石油污染時優勢明顯。微生物修復屬于生物修復的一種，細菌結構簡單、適應性強，常被用于污染物的微生物修復[7]。

　　但是在低溫條件下，常溫菌活性降低，而且石油烴的生物可利用性也降低[8]。盡管低溫不利于石油烴的生物降解，但自然界存在能夠降解石油烴的低溫石油降解菌，并且有些低溫菌能夠通過產生物表面活性物質來提高對石油烴的利用率[9—11]。目前對產表面活性劑的海洋石油降解菌的研究主要集中在常溫菌，對低溫菌研究的較少，特別是對篩選自海洋環境的產表面活性劑的低溫菌株研究極少[11，12]。

　　中國北方海區是重要的石油開發區，近年來在冬季發生多起溢油事故。如“東方大使”輪觸礁事故、“塔斯曼海”油輪碰撞事故、“錦集7”號輪沉船事故等，危害海洋環境[13—15]。因此，研究低溫時溢油事故的處理技術對保護中國北方海域十分必要。本研究的目的在于中國北方海域篩選能產表面活性劑的低溫石油降解菌并研究其性能。

　　1實驗材料與方法

　　1.1培養基

　　實驗用到兩種培養基:MMC培養基和2216E培養基。

　　1.2方法

　　1.2.1采樣

　　石油污染海水樣品采自位于大連東港商務區的一片巖石潮間帶，該區域被原油污染。取表層水樣裝入無菌廣口玻璃瓶中，帶回實驗室放入冷藏柜4℃保存。

　　1.2.2菌株篩選

　　采用傳統的搖瓶法篩選菌株，培養溫度為4℃，采用原油作為唯一碳源。采用稀釋涂布法將富集液中的細菌進行分離，采用平板劃線法將分離的菌落純化。采用排油圈法挑選產表面活性劑的菌株。

　　1.2.3菌株的生理生化反應

　　對所篩選出的菌株進行革蘭氏染色和氧化酶實驗、VP實驗、吲哚實驗、明膠液化實驗和硫化氫產出等生理生化實驗。

　　1.2.416SrRNA基因測序

　　采用16SrRNA基因測序的方法進行菌株鑒定。引物為27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3')和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')。將引物在6000r/min下離心3min后稀釋100倍。挑取適量菌體置于裝有50μL的PCR裂解緩沖液的離心管中，振蕩混勻，于80℃水浴溫育15min，離心分離，將上清液轉至另一離心管進行PCR。PCR反應步驟:在循環前進行94℃加熱5min，進入循環(30次)94℃停留30s54.5℃停留30s、72℃停留30s、循環之后72℃停留7min，4℃保持。

　　稱取0.45g瓊脂糖加入到30mLTAE緩沖溶液中，加熱直至瓊脂糖由渾濁變為澄清透明。加入60mL于半板，等瓊脂糖緩沖溶液溫度降至40～50℃，加入3μLDNA染色劑。吸取5μLPCR產物放入凝膠托盤孔內，電泳30min后放入紫外燈箱內觀察是否出現明顯條帶。委托上海立菲生物技術有限公司進行測序。

　　1.2.5降解性能測定

　　挑取菌體轉移至裝有100mL已滅菌2216E液體培養基的瓶錐形中振蕩培養。將5mL菌液加入到含有1mL柴油的100mLMMC培養液中，于4℃下培養分別培養15d、30d、60d。以不接種菌液的培養液作為空白組。降解培養結束后，在培養液中加入3mL50%的硫酸溶液進行酸化。

　　用20mL的石油醚萃取三次。將萃取后的油相采用紫外分光光度法測石油烴含量。降解率D的計算公式為D=[(C0-C1)/C0]×100%。其中，C0為空白瓶中石油烴的濃度，C1為實驗瓶中石油烴的濃度。采用可見光分光光度計在600nm的波長下測定發酵液水相的吸光度。

　　1.2.6產表面活性劑性能測定

　　將菌體轉至裝有100mL已滅菌的2216E液體培養基的瓶錐形中，低溫振蕩培養3d(4℃，120r/min)形成降解菌母液。分別利用柴油和原油為碳源，考察菌株產表面活性劑的情況。按照5%的比例將降解菌母液移至已滅菌的MMC液體培養基中，然后分別加入1%的碳源。在4℃條件下低溫振蕩培養30d。以不接種降解菌的培養液作為空白組。

　　降解培養結束后，發酵液離心去除菌體后用鹽酸調節至pH=2.0，在4℃下冷藏過夜。使用表面張力儀測定發酵液的表面張力。

　　1.2.7表面活性劑制備與鑒定

　　用氯仿-甲醇(2∶1，體積比)混合液萃取發酵液中的表面活性劑，將萃取液旋轉蒸發后得到物質為生物表面活性劑。將提取的表面活性劑樣品干燥后進行紅外光譜分析。另外，也采用薄層層析法鑒定表面活性劑種類。展開劑為V氯仿∶V甲醇∶V水=70∶10∶0.5。將1g蒽酮和5mL濃硫酸溶于95mL乙醇中作為顯色劑。

　　將表面活性劑溶液用毛細管滴點樣于離薄層板一端1cm處，晾干后置薄層板于盛有展開劑的展開槽內，待展開劑上升至離薄層板頂端約1cm附近時，將色譜板取出，干燥后噴顯色劑，放入95℃烘箱中加熱10min，取出觀察顯色情況。

　　2實驗結果與討論

　　2.1菌株的篩選

　　根據菌落生長速度、菌落數量和大小、產生的溶解圈直徑大小等條件從分離出的菌株中選出一株優勢菌，命名為DG-1。該菌株的菌落呈乳白色、濕潤、圓形、光滑、隆起、邊緣規則。

　　2.2菌株的生理生化特征

　　菌株DG-1的革蘭氏染色結果為陰性。氧化酶實驗、VP實驗、吲哚實驗、明膠液化實驗等生理生化實驗的實驗結果。

　　2.3菌株鑒定

　　在NCBI網站利用BLAST對菌株的基因序列進行對比分析，選取與菌株DG-1親緣相近菌株的序列，通過Mega6軟件進行系統發育分析，菌株DG-1為鹽單胞菌(Halomonas)菌屬的細菌。

　　2.4降解性能分析

　　在降解培養的初始階段，原油呈黑色薄膜狀漂浮在液面上，水相澄清。隨著降解培養的進行，原油油膜分散，部分原油呈油滴狀態，溶液變渾濁。培養后期，有絮狀物沉淀于瓶底，也有細小的黑色屑狀物質懸浮于溶液中，溶液呈褐色渾濁狀態。表明原油被菌株DG-1逐步降解。

　　結果表明，菌株DG-1在4℃的低溫下依然保持活性，能較高效地降解原油。降解的初期原油降解率較低，之后上升較快，30d后原油的降解率趨向于緩慢上升。原油的降解率和溶液中菌株的豐度存在線性關系，菌株豐度越高則原油降解率越高。

　　2.5產表面活性劑分析

　　在4℃條件下，菌株DG-1利用柴油和原油為碳源進行發酵培養30d后，可將發酵液表面張力分別降低至32.4、53.5mN/m。菌株DG-1所產表面活性劑的紅外光譜實驗。可發現C—O—C鍵、C—H、CO�呮I的吸收峰，可以推測該生物表面活性劑為糖脂類表面活性劑。此外，薄層層析板上顯現棕色斑點，也說明該表面活性劑為糖脂類表面活性劑。

　　3結論與展望

　　本研究篩選出一株能在4℃的低溫條件下降解原油的菌株，該菌株在降解原油和柴油的過程中能代謝生物表面活性劑從而提高石油烴的生物利用率。因此，該菌株具有應用于中國北方海域冬季溢油原位修復工作的潛力。本研究的結果可以為海洋溢油的微生物修復提供優良菌源和基礎數據。但論文中很多的研究工作還處于初始階段，未來應進一步深化研究。

　　參考文獻

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　　3AtlasRM.Microbialdegradationofpetroleumhydrocarbons:anenvironmentalperspective[J].ClinicalMicrobiologyReviews，1981，45(1):180-2094PiattJF，LensinkCJ，ButlerW，etal.Immediateimpactofthe“exxonvaldez”oilspillonmarinebirds[J].AmericanUniversityofKuwait，1990，107(2):387-397

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