摘要：蛋白飲料摻假現(xiàn)象是影響植物蛋白飲料行業(yè)健康快速發(fā)展的制約因素之一。本文綜述了植物蛋白飲料摻假的主要檢測技術(shù)，包括光譜技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等，從快速性、經(jīng)濟(jì)性、準(zhǔn)確性和可靠性比較了這些檢測技術(shù)的優(yōu)缺點，以期為植物蛋白飲料摻假鑒別提供參考和依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞：植物蛋白飲料;摻假;檢測技術(shù)

　　植物蛋白飲料是指以植物果仁、果肉及大豆為原料(如大豆、花生、杏仁、核桃仁、椰子等)，經(jīng)加工、調(diào)配后，再經(jīng)高壓殺菌或無菌包裝制得的乳狀飲料，比如豆奶、核桃露、花生露、杏仁露和椰子汁等[1]。植物蛋白飲料富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和粗纖維，不含或含較少的膽固醇，具有很高的營養(yǎng)價值[2]。近幾年，隨著消費(fèi)者對食品安全、健康飲食越來越關(guān)注，且由于植物蛋白飲料具有天然、綠色、營養(yǎng)、健康的品類特征，逐漸受到廣大消費(fèi)者的青睞[3]。

　　植物方向論文投稿刊物：《糧食與油脂》的主要內(nèi)容有糧油新產(chǎn)品開發(fā)、糧油加工、糧油資源利用、糧油生物工程、糧油檢測、功能性食品、食品添加劑、糧油市場、行情分析、市場評論、國際糧油食品信息等。

　　2007年以來各飲料子行業(yè)增速最快的是植物蛋白飲料，2007～2016年在整個飲料行業(yè)的占比上升8.79個百分點至18.69%。2016年植物蛋白飲料制造業(yè)市場規(guī)模占比最高，植物蛋白飲料行業(yè)收入為1217.2億元。2015年，我國植物蛋白飲料零售市場零售額達(dá)到729.28億元，市場總銷量為58.43億升。預(yù)計到2020年，零售額達(dá)到1393.5億元，總銷量增至107.97億升[4]。

　　由于經(jīng)濟(jì)利益的趨勢，不法商家將價格低廉的植物原料摻入產(chǎn)品當(dāng)中欺騙消費(fèi)者，如在核桃飲品中摻入價值遠(yuǎn)低于核桃的花生、大豆成分[5]。這種摻假行為不僅損害了消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)利益，還對消費(fèi)者的健康造成嚴(yán)重威脅。若消費(fèi)者對摻入成分過敏，該消費(fèi)者在不知情的情況下誤食后可能會產(chǎn)生過敏反應(yīng)[6]。因此，為打擊植物蛋白飲料摻假行為、保證食品安全、促進(jìn)國際貿(mào)易，食品安全監(jiān)管部門需要建立一系列方法來檢測和鑒定植物蛋白飲料是否摻假使假。

　　1植物蛋白飲料摻假檢測技術(shù)

　　1.1理化檢測技術(shù)

　　張敬敬[7]等研究了核桃乳摻假鑒別方法，并通過利用氣相色譜法測定核桃乳樣品中山崳酸的含量鑒別核桃乳中是否摻有花生乳，還利用高效液相色譜法測定樣品中是否含有大豆異黃酮來鑒別核桃乳中是否摻有大豆乳，在核桃乳中摻入10%的大豆乳和花生乳即可被測定出，且回收率在80%以上。夏君霞[8]等將不同配比的核桃花生乳和核桃杏仁乳甲酯化后，利用氣相色譜儀分析了其脂肪酸含量，并根據(jù)核桃仁、花生仁、杏仁中的特征脂肪酸，利用面積歸一法分析，表明在核桃花生乳中亞麻酸含量、花生酸與山崳酸含量之和、油酸與亞油酸含量之比是隨著核桃仁添加量的變化呈線性變化，在核桃杏仁乳中亞麻酸、油酸、亞油酸含量同樣是隨著核桃仁添加量的變化呈線性變化。

　　因此，根據(jù)樣品脂肪酸組成可以推斷核桃乳中是否添加了花生或杏仁，以及添加比例，但是該過程前處理過程復(fù)雜，且氣相色譜程序升溫時間較長，脂肪酸成分復(fù)雜，數(shù)據(jù)分析過程較耗時。植物蛋白飲料標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了部分脂肪酸占比要求，例如杏仁蛋白飲料的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T31324—2014《植物蛋白飲料杏仁露》中規(guī)定，棕櫚烯酸占總脂肪酸的百分比≥0.50%，花生酸和亞麻酸之和占總脂肪酸的百分比≤0.24%，其本意即為控制在杏仁蛋白飲料中過度使用其他植物蛋白質(zhì)原料(如花生和大豆)，但是部分廠商可能以脫脂的花生蛋白粉或大豆蛋白粉規(guī)避現(xiàn)有產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的監(jiān)測，因此，脂肪酸組成測定過程不能作為蛋白飲料是否摻雜的單一方法。

　　1.2紅外光譜技術(shù)

　　紅外光譜技術(shù)在食品農(nóng)產(chǎn)品領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛[9-11]，其優(yōu)勢在于其具有快速、無損、環(huán)保等優(yōu)點，能有效區(qū)分復(fù)雜的混合物，提取可靠的光譜信息，隨著化學(xué)計量學(xué)的發(fā)展，結(jié)合適當(dāng)?shù)墓庾V預(yù)處理及建模方法，可以有效去除噪聲，解決光譜共線問題，得到準(zhǔn)確可靠的預(yù)測模型[12]。

　　范睿[13]等研究了利用近紅外光譜分析儀測定自行配置不同濃度的植物水解蛋白摻假牛奶，應(yīng)用SabIR漫反射模塊直接掃描摻假樣品，同時使用Antaris透射分析模塊掃描三氯乙酸前處理的摻假樣品，應(yīng)用TQAnalyst軟件使用最小二乘法(CLS)、逐步多元線性回歸(SMLR)、主成分回歸(PCR)和偏最小二乘回歸(PLS)分別建模，通過一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、SG平滑和Norris平滑對紅外光譜圖進(jìn)行預(yù)處理，以校正均方差、預(yù)測均方差和相關(guān)系數(shù)為指標(biāo)比較了兩種方法差異。

　　結(jié)果表明PCR建模方法可以解決部分共線性問題，對光散射和組分之間干擾做出補(bǔ)償，同時選擇一階導(dǎo)數(shù)放大有效信息分離重疊信息和NorrisDerivative濾波平滑被放大的噪音信息，以提高信噪比。此條件下，透射采集植物水解蛋白定量分析模型和漫反射采集植物水解蛋白定量分析模型都可以對牛奶中的植物水解蛋白含量定量分析。近紅外光譜可以應(yīng)用于花生牛奶的定量分析，為花生牛奶提供產(chǎn)品質(zhì)量控制和快速定量檢測，為植物蛋白飲料摻假提供一種新的檢測思路，但是紅外光譜分析靈敏度相對較低，需要大量代表性且化學(xué)值已知的樣品建立模型，且模型需要不斷更新，建模成本高，因此，其應(yīng)用具有使用局限性。

　　1.3酶聯(lián)免疫分析技術(shù)

　　(ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA，enzymelinkedim-munosorbentassay)的基本原理是采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后加入與酶反應(yīng)的底物，底物被酶催化成有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，借助分光光度計的光吸收進(jìn)行定性或定量分析。酶聯(lián)免疫檢測方法有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法、間接法、競爭法、捕獲法等，具有特異性強(qiáng)、敏感度高、操作簡單等優(yōu)點。

　　其中雙抗夾心法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)檢測免疫反應(yīng)模式，該方法以一個包被在酶標(biāo)板的抗體捕獲抗原，另一帶標(biāo)記的抗體再結(jié)合抗原的第2個決定簇，具有特異性高、反應(yīng)靈敏等優(yōu)勢，然而熱處理會使部分蛋白質(zhì)水解，從而導(dǎo)致抗原的2個決定簇解離，喪失結(jié)合雙抗體的能力。競爭法中1個抗原分子只結(jié)合1個抗體，即使被水解，只要抗原決定簇不受破壞仍然可被抗體識別，可以較好地應(yīng)用于熱處理蛋白質(zhì)的檢測。

　　張世偉[14]等利用競爭酶聯(lián)免疫法分析(ELISA)了杏仁飲料中杏仁蛋白質(zhì)的含量，其首先使用雙向電泳和MALDI-TOF/MS確定了杏仁中的蛋白質(zhì)定量標(biāo)志物-Pru-1蛋白，同時通過切膠回收方法分離純化了杏仁40kuprunin蛋白α鏈，并以此作為抗原制備了抗杏仁蛋白單克隆抗體，使用該抗體建立了檢測杏仁蛋白質(zhì)的競爭酶聯(lián)免疫分析方法，作者研究了該方法的特異性，結(jié)果表明該方法以杏仁可溶全蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，IC50為19.6μg/mL，線性范圍為5.0～100μg/mL(R2=0.990)，方法特異性良好，抗體只識別Pru-1的α鏈，與包括羽扇豆和玉米在內(nèi)的其他種子蛋白和乳蛋白無交叉反應(yīng)。作者利用該方法對從市場隨機(jī)購買的5份杏仁蛋白飲料中的蛋白含量進(jìn)行檢測，4份樣品與凱氏定氮法結(jié)果一致，且植物蛋白飲料樣品的檢出限為0.6mg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<10%。

　　同時研究了熱加工對該法測定杏仁蛋白質(zhì)含量的影響，結(jié)果顯示使用巴氏殺菌、超高溫瞬時滅菌和高壓滅菌的蛋白質(zhì)平均回收率分別為96%、92%和81%，該方法可以準(zhǔn)確地測定超高溫瞬時滅菌的杏仁露中杏仁蛋白質(zhì)含量，但是高溫長時間的熱加工會對該方法產(chǎn)生一定影響。但是熱加工蛋白質(zhì)的定量一直以來就是免疫學(xué)定量的難題，由于蛋白質(zhì)在熱加工中會發(fā)生變性、水解、聚集等作用，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的沉淀和抗原決定簇的破壞，嚴(yán)重影響到定量的準(zhǔn)確性。

　　1.4分子生物學(xué)技術(shù)

　　在食品安全檢測領(lǐng)域，應(yīng)用較為廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)技術(shù)、DNA條形碼技術(shù)和實時熒光PCR技術(shù)等。常規(guī)PCR技術(shù)靈敏度高、特異性好，DNA條形碼技術(shù)成本低、快速可靠，均被廣泛用于食品中進(jìn)行定性檢測;實時熒光PCR技術(shù)不僅可用于定性檢測，還可測定循環(huán)閾值(Ct)值和初始DNA模板濃度進(jìn)行相對定量[15，16];微滴式數(shù)字PCR(dropletdigitalpolymerasechainreaction，ddPCR)是準(zhǔn)確定量核酸的一門新興核酸擴(kuò)增技術(shù)[17，18]，其利用有限稀釋分析和泊松分布分析來實現(xiàn)靶DNA拷貝數(shù)的絕對定量[19-21]，被稱為“第三代PCR”技術(shù)[22]。

　　韓晴等利用植物DNA條形碼技術(shù)與PCR技術(shù)[23]，設(shè)計、篩選了同時能對杏仁、花生、核桃、大豆、芝麻和榛子六個物種進(jìn)行擴(kuò)增的通用引物，并將其應(yīng)用于杏仁露中花生源性成分的檢測，結(jié)果表明引物ITS2-2和trnH-psbA-1分別對六個物種的擴(kuò)增成功率和測序成功率均較高;并通過計算杏仁、花生的基因組DNA提取率，設(shè)計摻假模型在提取的杏仁基因組DNA中摻入花生基因組DNA，引物ITS2-2對于摻入85.80%的花生檢測結(jié)果為杏仁，trnH-psbA-1對于摻入6.94%的花生檢測結(jié)果為花生，引物ITS2-2和trnH-psbA-1可作為鑒別杏仁露中花生源性成分的植物DNA條形碼組合。

　　周巍等起草的植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定(BJS201707)食品檢驗方法規(guī)定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鑒定的實時熒光PCR方法[24]，適用于核桃露(乳)、杏仁露、果仁露等復(fù)合植物蛋白飲料中標(biāo)識含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的檢測及鑒定，但是該方法對植物源性成分無法定量。楊碩等利用PCR方法檢測了椰子汁中椰子種源成分[25]，發(fā)現(xiàn)UBC10基因適用于椰子汁類產(chǎn)品的靶向擴(kuò)增，同時利用實時熒光PCR驗證了大豆、花生等的源性成分引物、探針特異性，發(fā)現(xiàn)6個種源間無交叉反應(yīng)，無非特異性擴(kuò)增曲線。

　　作者利用實時熒光PCR技術(shù)檢測了6份椰子汁中植物源性成分，其中2份樣本檢出大豆成分，且利用特異性、靈敏度更好的ddPCR進(jìn)行了驗證，由于一方面反應(yīng)體系中存在的抑制劑抑制了PCR反應(yīng)，加上樣本基質(zhì)復(fù)雜，熒光背景高，易造成假陰性或假陽性;另一方面抑制劑能影響DNA聚合酶的外切酶活性，導(dǎo)致水解探針的特異性變差，發(fā)出非特異性熒光，造成假陽性，而ddPCRSuper-Mix優(yōu)化了DNA聚合酶穩(wěn)定性和耐抑制劑能力，無限稀釋的反應(yīng)體積削弱了復(fù)雜基質(zhì)對反應(yīng)的抑制效應(yīng)，能夠彌補(bǔ)實時熒光PCR容易錯判可疑結(jié)果的缺陷。分子生物學(xué)方法靈敏度高、重復(fù)性好，用于植物蛋白飲料摻假檢測，有效保護(hù)植物源性成分過敏人群，打擊制假摻假的不法商家，保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益。

　　1.5液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

　　基于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，組織中存在一些蛋白質(zhì)，其含量與總蛋白質(zhì)含量有比較穩(wěn)定的比例關(guān)系，可作為蛋白質(zhì)定量標(biāo)志物[26，27]。因此，通過對這些蛋白質(zhì)定量標(biāo)志物的測定即可推算出物種的總蛋白質(zhì)含量，實現(xiàn)物種蛋白質(zhì)含量的特異性定量。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Liquidchromatogra-phy-massspectrometry，LC-MS)將色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)境和食品安全領(lǐng)域中，特別在食品領(lǐng)域中，諸如食品農(nóng)獸藥殘留、添加劑、成分分析和過敏源等。蛋白通過LC-MS的色譜分離和質(zhì)譜的碎裂分析，得到大量肽段信息，通過數(shù)據(jù)庫查詢分析這些肽段可以對蛋白進(jìn)行鑒定。

　　JosephineB�塶ick，GerdHuschek，HarshadraiM.Rawel等[28]人利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對面包產(chǎn)品中的小麥、斯佩耳特小麥和黑麥的真實性進(jìn)行了檢測，最終利用通用蛋白數(shù)據(jù)庫Blast比對篩選出了三種小麥的特異性肽段，并利用這些特異性肽段對面包中的小麥、斯佩耳特小麥和黑麥含量進(jìn)行了定性定量分析。該技術(shù)是一種穩(wěn)定、靈敏、特異的追溯蛋白物種來源的新方法，同時構(gòu)建肽庫，利用蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等方法研究植物蛋白已經(jīng)成為發(fā)展趨勢，隨著離子化、質(zhì)量分析檢測的不斷完善和發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)必將成為植物蛋白分析的最有效工具[29]。

　　2植物蛋白飲料摻假檢測方法比較

　　植物蛋白飲料摻假檢測技術(shù)有前面所述如理化檢測技術(shù)、紅外光譜技術(shù)、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等眾多方法，根據(jù)這些檢測方法的特點(包括快速性、經(jīng)濟(jì)性、準(zhǔn)確性、可靠性四個方面)進(jìn)行總結(jié)與比較。各種測定方法的特點各不相同。

　　其中紅外光譜技術(shù)具有明顯的快速、經(jīng)濟(jì)無損等優(yōu)點，但是其建模過程復(fù)雜且樣品基質(zhì)復(fù)雜，分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性較低;酶聯(lián)免疫分析技術(shù)成本稍高，且熱加工工藝對檢測結(jié)果影響較大;分子生物學(xué)方法和液質(zhì)聯(lián)用測定蛋白多肽技術(shù)優(yōu)點很突出，是所有方法中最準(zhǔn)確可靠的，但是缺點也很明顯，即成本較高，其中PCR方法無法對摻假比例進(jìn)行準(zhǔn)確定量，而液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可以實現(xiàn)目標(biāo)多肽和蛋白質(zhì)的定性定量測定。隨著蛋白組學(xué)的發(fā)展及隨著各種離子化、質(zhì)量分析檢測及聯(lián)用技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，利用LC-MS技術(shù)對植物蛋白和肽的鑒定、定性定量分析必將成為植物蛋白研究的重要手段之一。

　　3結(jié)論與展望

　　隨著科學(xué)技術(shù)的日益發(fā)展以及高尖端技術(shù)的出現(xiàn)，對于植物蛋白飲料摻假的檢測技術(shù)已經(jīng)由主觀的感官檢測向客觀的科學(xué)分析手段發(fā)展，由簡單的定性檢測發(fā)展為定量檢測。然而，面對多種多樣的摻假現(xiàn)象以及不斷發(fā)展的摻假手段，我國目前尚未建立足夠的檢測標(biāo)準(zhǔn)，而且傳統(tǒng)的理化檢測方法和酶聯(lián)免疫分析法又存在費(fèi)時、費(fèi)力以及受原料加工方式和條件等因素影響，難以做到鑒偽方法的廣泛適用性。

　　假冒偽劣商品的存在需要高科技、先進(jìn)鑒偽技術(shù)的產(chǎn)生，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，特別是液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在蛋白質(zhì)和多肽領(lǐng)域的應(yīng)用，彌補(bǔ)了常用的化學(xué)檢測技術(shù)的諸多不足，為檢測技術(shù)的發(fā)展開辟了新的領(lǐng)域，通過大量的實踐，不斷完善和發(fā)展該檢測技術(shù)，擴(kuò)大其檢測范圍，為進(jìn)一步規(guī)范產(chǎn)品市場，進(jìn)一步支撐食品安全監(jiān)管提供有益的技術(shù)資源。

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　　作者：張淑霞，李珂，祝偉霞，王向軍，劉軍紅