摘要嵌合抗原受體T細胞(chimericantigenreceptorTcell，CAR-T)是通過基因工程技術將自體或異體T細胞改造成針對腫瘤特異性抗原的新型殺傷細胞，具有特異性強、效率高、非MHC限制等優點，在復發/難治性血液系統腫瘤和部分實體瘤中取得了良好的治療效果。CAR-T細胞制備流程包括細胞分離和純化、活化和分化、基因修飾、體外擴增、表型質控、保存和回輸。近年來，隨著流式細胞術的迅速發展，使其廣泛應用于CAR-T細胞治療的各個環節，包括治療前篩查、體外制備和回輸后監測，并在其創新優化過程中發揮著重要的作用。

　　關鍵詞流式細胞術;CAR-T細胞;治療前篩查;細胞制備;回輸后監測

　　細胞免疫治療是繼外科手術、化療、放療后第4種具有顯著優勢及臨床療效的抗腫瘤治療方法。作為細胞免疫治療的重要組成部分，過繼細胞治療利用內源性的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)或基因工程編碼表達T細胞受體(TCR)或嵌和抗原受體(CAR)的T細胞，在腫瘤免疫治療領域表現出顯著的臨床療效和可觀的研究前景。

　　醫學論文投稿刊物：《免疫學雜志》由中國免疫學會和第三軍醫大學主辦，1985年創刊，現為月刊，A4開本，內文92頁，銅板紙、彩圖隨文印刷，國際標準連續出版物號：ISSN：1000—8861，國內統一刊號：CN51—1332/R。本刊堅持以交流學術信息、開展學術爭鳴、繁榮學術園地為其辦刊辦刊宗旨;為本學科及相關學科讀者充實理論、更新知識、積累經驗服務為其目的。

　　2017年FDA相繼批準Kymriah和Yescarta2種CAR-T產品上市，分別用于治療難治/復發性(R/R)的B細胞系急性淋巴白血病(B-ALL)和彌漫大B細胞系淋巴瘤(DLBCL)，這成為細胞免疫治療的里程碑，顯示出CAR-T細胞治療的巨大應用前景[1-2]。CAR-T細胞的制備流程包括細胞純化和分離、活化和分化、基因修飾、體外擴增、表型質控、保存和回輸。制定合理的制備方法和發展高效的檢測技術是目前CAR-T細胞治療快速發展和進入臨床應用所面臨的重大挑戰。

　　流式細胞術(flowcytometry，FCM)是一種能夠對單個細胞或生物微顆粒的生物學性質進行定量分析和分選的檢測手段，具有高效、快速、精準、多參數和高通量等優點，是目前先進的細胞定性和定量分析技術之一[3-4]。近年來，FCM迅速發展，新技術不斷突破，新儀器不斷涌現，FCM基于其獨特的細胞分選原理和強大的熒光標記技術，在CAR-T細胞治療過程表現出顯著的優勢。

　　本文主要討論了FCM在CAR-T細胞治療前檢查、輸注后檢測和各制備環節的應用與優化，以期合成安全高效的CAR-T細胞產品。治療前檢查CAR-T細胞治療成功的關鍵在于準確評估患者腫瘤細胞是否表達靶抗原及靶抗原的表達量。Pan等[5]利用第二代靶向CD19的CAR-T細胞治療42例難治/復發性(R/R)B-ALL和9例FCM-MRD+的B-ALL，要求入組病患的腫瘤細胞利用FCM檢測必須有顯著的CD19表達，90%的R/RB-ALL患者實現完全緩解(CR)，100%FCM-MRD+患者實現MRD-。B細胞成熟抗原(BCMA)只表達于正常和惡性漿細胞，而靶向BCMA的CAR-T細胞可用于治療漿細胞瘤。

　　Salem等[6]利用FCM和免疫組織化學檢測同時評估了43例漿細胞瘤患者腫瘤細胞表面BCMA的表達情況。結果表明，FCM檢測的陽性率顯著高于免疫組織化學檢測(97%vs72%)(P<0.01)。同時，FCM可定量細胞表面BCMA表達量，區分正常和異常漿細胞，使其成為CAR-T細胞治療前篩查和治療后隨訪的重要工具。T細胞的獲取和富集CAR-T細胞批量化生產的初始細胞群來源于病人經過血細胞分離器采集濃縮的外周血單個核細胞(PBMNC)。

　　然而，富含淋巴細胞的PBMNC也包括單核細胞、數量不等的紅細胞、粒細胞和血小板[7]。儀器設備的發展促進了PBMC的有效分離，例如CliniMACSPlus細胞分選儀可富集不同T細胞亞群，如CD3+、CD4+、CD8+T細胞[8]。CD3/CD28磁珠的磁性分選也可以從PBMC濃縮物富集T細胞，還能刺激T細胞體外擴增[9]。流式細胞分選術又稱熒光激活細胞分選術(fluorescenceactivatedcellsorting，FACS)，能在短時間內高效快速分選成千上萬個目標細胞，目前FACS已廣泛應用于T細胞的分離和富集[10]。

　　來自于CD3+T細胞亞群的CAR-T細胞被廣泛應用于臨床[11-12]。有研究表明，低分化階段的干細胞記憶T細胞(Tscm)和中央記憶T細胞(Tcm)能促進CAR-T細胞在體內持續增殖和長期存活，相比于高分化階段的效應記憶T細胞(Tem)和快速效應T細胞(Teff)表現出更強的抗腫瘤活性[13]。有一項臨床試驗證明了Tcm來源的靶向CD19的CAR-T細胞在治療自體造血干細胞移植后復發的高危淋巴瘤患者中的安全性和可行性，表現出較好的臨床療效，且未觀察到細胞因子釋放綜合癥(CRS)等副反應[14]。CD62L、CCR7、CD45RA、CD45RO是CD8+T細胞不同分化階段的表面標記，利用FCM選擇性富集具有高度自我更新潛能的Tscm和Tscm亞群，可顯著提高CAR-T細胞治療的療效[15]。

　　T細胞活化和體外擴增目前，已有多種T細胞活化策略成功應用于臨床級別CAR-T細胞產品的生產，包括與天然或人造抗原呈遞細胞共培養[16]、可溶性抗CD3單克隆抗體(OKT3)聯合IL-2[11,17]、OKT3聯合CD28抗體共刺激[12,18]、Expamer技術[19]等。最新的研究指出，在臨床前腫瘤模型中，OKT3/CD28抗體磁珠刺激活化的T細胞具有相對低分化的表型，優于OKT3聯合IL-2，因此廣泛應用于靶向CD19的CAR-T細胞[20]。

　　FCM是分析T細胞活化和增殖的有力工具，利用特異性熒光素偶聯抗體或特異性熒光探針進行復雜表型分析，評估T細胞活化、增生、效應因子的產生和轉錄因子的表達。Reed等[21]討論了利用FCM評估多種外源因子對T細胞活化、增殖、細胞因子產生和轉錄因子表達影響的試驗方法。熒光素偶聯抗體既可以靶向表面抗原，也可以靶向胞內標記蛋白。特異性熒光探針可以用來分析包括增殖及細胞周期中DNA含量變化等在內的多種細胞過程。T細胞表型質控由于CAR-T細胞產品的復雜性，在應用于臨床之前，必須進行嚴格的T細胞表型質控和放行試驗使其達到明確的放行標準，包括細胞產品的特性、純度、安全性和效能[8]。

　　細胞特性試驗必須保證批量生產的細胞產品是目標亞群細胞，目前主要通過FCM分析細胞表面特異性的標記蛋白來鑒定，細胞增殖和分化能力測定也是常規應用的評估項目。多種方法可以測定細胞增殖能力，如MTT試驗、ATP定量、BrdU染色、基于IP/CFSE的流式細胞術分析等，其中FCM最為方便準確[22]。細胞分化能力主要取決于T細胞的分化階段，不同分化階段表達特定表面標記物，如CD25、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD62L等，利用FCM測定特定分化階段細胞比例可鑒定細胞產品的分化潛能[15]。

　　細胞純度分析主要用來檢查表達抗CAR的CD3+T細胞比例。FCM是目前臨床上檢測CAR-T細胞純度的主要方法。Pan等[23]利用慢病毒轉導的方法構建了SFGαCD19.4-1BB-ζ第二代CAR-T細胞，利用FCM檢測表達CAR的細胞比例在50%以上。細胞安全性分析必須保證細胞產品的無菌性，同時不含內毒素和生產過程中產生的其他有害物質，另一方面還要預防轉基因整合導致的基因毒性。

　　細胞效能分析主要測定細胞產品的靶生物學活性。體外實驗主要測定CAR-T細胞對靶細胞的直接殺傷作用和細胞因子的分泌情況。體外細胞毒試驗包括51Cr釋放試驗[24]、LDH試驗[25]、基于重要生物靶標的FCM[26]、熒光素酶報告試驗[27]以及ELISpot分析[28]等。應用FCM檢測粘附腫瘤細胞系相關參數一直是個挑戰。Martinez等[29]利用高通量流式細胞術探究了CAR-T細胞對多種粘附腫瘤細胞的T細胞依賴性的細胞殺傷作用，并探討了最佳實驗條件，表明高通量FCM在體外測定CAR-T細胞對實體腫瘤細胞毒作用的可行性。

　　近年來發展的流式微珠陣列技術(cytometricbeadarray，CBA)可同時測定多種細胞因子含量，相比于ELISA，CBA具有樣本用量更少、檢驗迅速、多指標檢測、操作方便、靈敏度高、重復性好、無酶-底物干擾的優勢[30]。研究者曾用CBA技術實時動態監測唾液中IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平，靈敏度可達0.274pg/ml[31]。輸注后監測患者回輸CAR-T細胞后需定期檢測體內CAR-T細胞數量、細胞因子水平、患者腫瘤負荷和毒副反應，便于綜合評價CAR-T細胞的治療療效和臨床獲益情況。有臨床試驗表明，CAR-T細胞輸注后的擴增能力和存活時間是其有效殺傷腫瘤細胞的主要影響因素[32]。定位到骨髓的CAR-T細胞可擴增1000倍以上，上升趨勢可維持6個月[33]。

　　監測患者外周血CAR-T細胞數量可有效預測細胞免疫治療反應。目前，CAR-T細胞監測方法主要有FCM[34-35]、定量PCR技術[36]和示蹤劑PET/SPECT成像[37]，其中FCM和定量PCR技術在臨床上使用較普遍。FCM利用特異性熒光標記的抗體可以靶向胞外區分子、抗原結合域或融合蛋白，然而利用不同抗體檢測的FCM容易導致結果的異致性[34]。有一項研究建立了基于熒光標記蛋白L的FACS檢測CAR表達的方法，利用6種靶向不同CAR結構域的抗體，比較了人和小鼠來源CAR結構域的差異，結果表現出一致性[35]。

　　白血病患者腫瘤負荷主要定期評價骨髓細胞學和微小殘留病(MRD)，淋巴瘤患者主要復查PET/CT。MRD是用來描述基于傳統細胞形態學不能檢測到的最小腫瘤負荷，是臨床上廣泛用來評價療效和評估預后的重要指標[38]。MRD定量檢測包括基于識別白血病相關異常免疫表型(LAIPs)的多色流式細胞術和檢測白血病特異性IG/TR基因重排或融合基因的實時定量PCR技術(RTqPCR)[39]。雖然RT-qPCR是目前靈敏度最高的MRD檢測方法，但部分白血病患者缺乏供PCR檢測的遺傳學標記，此時FCM是唯一選擇。FCM作為一種快速便宜的MRD檢測方法，應用于90%ALL患者MRD的檢測，靈敏度達104[40]。

　　展望細胞治療為現代醫學和健康體系帶來了革命性變化，但是將CAR-T細胞批量化生產為臨床用藥仍面臨許多挑戰，需要多學科的密切交叉合作。近年來，流式細胞儀器不斷升級、流式細胞技術不斷發展，使FCM的應用范圍大大的擴展。流式細胞術不僅在CAR-T細胞制備的初始T細胞獲取和富集、體外激活和擴增、表型質控和釋放試驗等多個環節進行優化，也在治療前患者篩查和回輸后體內監測、MRD檢測方面也發揮著重要作用。實驗技術的發展、儀器設備的改善、多學科合作將加速CAR-T細胞研發進展，使CAR-T細胞早日商品化，應用于臨床。

　　參考文獻

　　1PrasadV.Immunotherapy:Tisagenlecleucel-thefirstapprovedCAR-Tcelltherapy:implicationsforpayersandpolicymakers.NatRevClinOncol,2018;15(1):11-12.

　　2Noauthorslisted.FDAapprovessecondCART-celltherapy.CancerDiscov,2018;8(1):5-6.

　　3AdanA,AlizadaG,KirazY,etal.Flowcytometry:basicprinciplesandapplications.CritRevBiotechnol,2017;37(2):163-176.

　　4MckinnonKM.Flowcytometry:anoverview.CurrProtocImmunol,2018;doi:10.1002/cpim.40.

　　5PanJ,YangJF,DengBP,etal.Highefficacyandsafetyoflow-doseCD19-directedCAR-Tcelltherapyin51refractoryorrelapsedBacutelymphoblasticleukemiapatients.Leukemia,2017;31(12):2587-2593.

　　作者：李成功1,2，梅恒1,2*，胡豫1,2