摘要：【目的】為石斛屬的植物生殖生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。【方法】利用半薄切片顯微觀察石斛屬模式植物金釵石斛雌配子體和胚發(fā)育過程。【結(jié)果】在授粉前，胎座未發(fā)育;授粉后30d，位于胚珠原基末端的細(xì)胞體積增大變?yōu)殒咴��?xì)胞;授粉后40d，孢原細(xì)胞變?yōu)榧?xì)胞核明顯的大孢子母細(xì)胞;授粉后60d左右，大孢子母細(xì)胞體積不再繼續(xù)擴(kuò)增，開始進(jìn)行減數(shù)分裂;從授粉到雌配子體成熟大約需要70d的時間;授粉后80d合子進(jìn)行第一次分裂，分裂為兩個細(xì)胞，包括一個基細(xì)胞和一個頂細(xì)胞;授粉后110d，多次分裂后頂細(xì)胞形成早期球形胚;授粉后120d，胚細(xì)胞已填滿囊腔，胚柄開始液泡化;授粉后150d，球形胚結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，胚柄已消失;授粉后180d，胚成熟。【結(jié)論】金釵石斛為側(cè)膜三胎座，倒生型胚珠，薄珠心，單孢子蓼型胚囊。授粉前，胚珠原基未發(fā)育，授粉后180d，胚才能完全成熟，即形成成熟的種子。

　　關(guān)鍵詞：金釵石斛;雌配子體;胚發(fā)育

　　石斛蘭(Dendrobium)是蘭科石斛屬植物的總稱，為蘭科(Orchidaceae)的第二大屬[1]。石斛屬植物有著極高的觀賞價值，與卡特蘭(Cattleya)、蝴蝶蘭(Phalaenopsis)、文心蘭(Oncidium)同為世界上四大觀賞洋蘭[2]。隨著人們對觀賞石斛消費需求的擴(kuò)大，觀賞石斛的育種已成為越來越關(guān)注的熱點[3]。

　　有研究表明石斛屬內(nèi)有很多種有自交不親和現(xiàn)象，部分種也有異交不親和現(xiàn)象[4]，所以研究石斛屬植物胚發(fā)育是解決雜交敗育及進(jìn)行胚搶救育種的第一步。蘭科植物中授粉后花粉管的長出會刺激大孢子的發(fā)育和雌配子體的形成，持續(xù)50～90d。從授粉到果實成熟需要6～8個月。授粉后6周左右，大花杓蘭(Cypripediummacranthum)的種胚發(fā)育為球形胚[5]。無距蝦脊蘭(Calanthetsoongiana)授粉后60d，合子形成完成受精，合子第一次橫向分裂為基細(xì)胞和頂細(xì)胞，頂細(xì)胞發(fā)生縱裂，之后經(jīng)過數(shù)次胚細(xì)胞的分裂形成成熟的胚胎[6]。

　　扇脈杓蘭(Cyp-ripediumjaponicum)授粉前，子房的胎座有稍許分化，在胎座形成一些突起。在授粉10d后，胎座分化出隆起的胚珠原基，胚原基頂端的孢原細(xì)胞，分化為具有明顯細(xì)胞核的大孢子母細(xì)胞，之后胚原基基部的細(xì)胞突起形成內(nèi)珠被，然后外珠被開始發(fā)育。授粉后35d，發(fā)育成熟的雌配子體準(zhǔn)備好受精。受精后經(jīng)95d胚胎發(fā)育成熟，其胚胎發(fā)育過程和無距蝦脊蘭類似，也為石竹型[7]。本研究旨在通過對金釵石斛(Den.nobile)大孢子發(fā)生、雌配子體發(fā)育以及胚發(fā)育等進(jìn)行研究，為石斛屬植物生殖生物學(xué)研究提供相關(guān)資料，為研究石斛屬雜交育種敗育現(xiàn)象奠定基礎(chǔ)。

　　1材料與方法

　　試驗材料為中國林科院科研溫室內(nèi)的金釵石斛。于2017年2、3月份對金釵石斛開花植株進(jìn)行人工授粉、標(biāo)記。金釵石斛授粉后每隔10d取1次果莢，每次3個，以授粉前子房為對照，將樣品切塊放在2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合溶液中，經(jīng)1%的鋨酸室溫固定，然后將樣品依次經(jīng)過50%、70%、80%、90%、100%的丙酮溶液脫水。

　　逐步完成丙酮和Spurr樹脂的置換和浸透，樣品放入新配制的Spurr樹脂中靜置1h后放入60℃烘箱中24h完成包埋與聚合，將包埋好的樣品用超薄切片機(jī)切片，切片厚度3μm，在切片上滴加數(shù)滴濃度為0.5%的甲苯胺藍(lán)溶液，染色3～4min后，用蒸餾水沖洗干凈，在光學(xué)顯微鏡下觀察然后拍照。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育

　　金釵石斛的子房為側(cè)膜胎座三心皮，在授粉前，胎座未發(fā)育。授粉后，胎座之間空隙變大，胎座上細(xì)胞開始迅速增殖分裂，在內(nèi)膜脊上形成指狀突起，授粉后10d每個胎座上分化出一些小枝。授粉后20d，每個胎座上的小枝又繼續(xù)分化，指狀突起數(shù)量變多。隨著胎座小枝上細(xì)胞持續(xù)分裂，子房不斷膨大。授粉后30d，指狀突起分化為成千上萬個胚珠原基，由一列細(xì)胞外加一層表皮細(xì)胞組成，位于胚珠原基末端的細(xì)胞體積增大變?yōu)殒咴��?xì)胞。授粉后40d，相對于其他細(xì)胞，體積明顯增大，孢原細(xì)胞變?yōu)榧?xì)胞核明顯的大孢子母細(xì)胞。

　　隨著大孢子母細(xì)胞的體積不斷增大，胚珠原基開始彎曲，最后整個胚珠體發(fā)生180度的轉(zhuǎn)換，珠柄與珠孔靠近，形成倒生型胚珠。孢原細(xì)胞發(fā)育為大孢子母細(xì)胞之后，胚珠原基基部的表皮層細(xì)胞向外突起生長形成衣領(lǐng)狀結(jié)構(gòu)，為內(nèi)珠被。隨后，外珠被也開始發(fā)生，由內(nèi)珠被靠近底部的細(xì)胞分化而來。在受精前，內(nèi)珠被不斷向上生長，包住大孢子母細(xì)胞，在雌配子體成熟前后內(nèi)珠被生長完成，包住珠心，形成珠孔。隨著內(nèi)珠被的不斷生長，大孢子母細(xì)胞也不斷伸長。

　　授粉后60d左右，大孢子母細(xì)胞體積不再繼續(xù)擴(kuò)增，準(zhǔn)備進(jìn)行減數(shù)分裂。大孢子母細(xì)胞減數(shù)第一次分裂是橫向的，產(chǎn)生2個不對稱的細(xì)胞，靠近珠孔方向的細(xì)胞較小很快便壓縮退化，合點方向的功能性二分體細(xì)胞較大，接下來發(fā)生橫軸方向上的減數(shù)第二次分裂，形成具有4孢子的直列式四分體，4個孢子中只有1個參加雌配子體的發(fā)育，其余3個在四分體形成的過程中先后退化。參加雌配子形成的大孢子進(jìn)行有絲分裂，第一次分裂形成初生珠孔核和初生合點核;第二次分裂珠孔方向產(chǎn)生一對核，合點方向產(chǎn)生一對核;第三次分裂珠孔方向和合點方向各形成4個核，這種由單孢子分裂形成的八核胚囊稱為蓼型胚囊。從授粉到雌配子體成熟大約需要70d的時間，但即使是同一子房其雌配子體發(fā)育的時間也不完全一致。

　　2.2受精后胚的發(fā)育

　　配子結(jié)合形成受精卵后，細(xì)胞質(zhì)呈均勻狀態(tài)。授粉后80d合子進(jìn)行第一次分裂，分裂為兩個細(xì)胞，包括1個基細(xì)胞和1個頂細(xì)胞，頂細(xì)胞在合點方向，細(xì)胞體積小，基細(xì)胞靠近珠孔方向，液泡很大，基細(xì)胞之后會分化為胚柄，胚柄起固定胚體的作用，其他組織細(xì)胞的養(yǎng)分可以通過胚柄運輸至胚。授粉后90d，金釵石斛的頂細(xì)胞發(fā)生橫軸方向上的分裂，基部的細(xì)胞不分裂，形成一 列三細(xì)胞原始胚，依此判斷金釵石斛的胚發(fā)生類型為石竹型。但偶有切片觀察發(fā)現(xiàn)頂細(xì)胞首次分裂為縱軸方向上的分裂。

　　一列三細(xì)胞原胚接下來的分裂也分為兩種情況：原胚頂端細(xì)胞發(fā)生縱軸方向上的分裂形成4細(xì)胞T型胚體;兩個頂細(xì)胞同時在縱軸方向上分裂。繼續(xù)分裂形成6細(xì)胞、8細(xì)胞原胚，同時胚柄體積增大。在胚發(fā)育的整個過程，內(nèi)珠被沒有發(fā)育，和外珠被細(xì)胞相比，內(nèi)側(cè)的珠被細(xì)胞較小，由一層緊密排列的細(xì)胞組成，受精之后并逐漸退化濃縮成為一層緊密包裹胚體的超薄細(xì)胞。授粉后110d，多次分裂后頂細(xì)胞形成早期球形胚。授粉后120d，胚細(xì)胞繼續(xù)分裂，數(shù)量變多，囊腔被填充滿，此時胚柄細(xì)胞已開始裂解。授粉后150d，早期原胚發(fā)育為球形胚，胚柄只留下痕跡，基本完全消失。之后，胚體積穩(wěn)定，有絲分裂停止，胚細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)非常濃厚。

　　3結(jié)論與討論

　　一般有花植物的胚珠是伴隨著花的發(fā)育過程逐漸成熟的，但蘭科植物胚珠發(fā)育具有獨特的模式，即在授粉前胚珠沒有發(fā)育或僅有部分不完全發(fā)育，只有在授粉后才能啟動進(jìn)一步的發(fā)育。金釵石斛雌配子發(fā)育的特點與樹蘭(Epidendrumiba-guense)[5]、卡特蘭(Cattleya)[7]、無距蝦脊蘭(Calanthetsoongiana)[7]和舌唇蘭(Platantherasusannaeil)[8]相同。

　　在授粉前胚珠并沒有開始發(fā)育，只有在授粉后才開始發(fā)育;杓蘭類(Cypripedi-um)[9.10]、玉鳳蘭(Habenriagrandifloriformis)[8]、火燒蘭屬(Epipactis)[11]授粉前胚珠已經(jīng)開始發(fā)育，只是不能分裂形成大孢子細(xì)胞，授粉后大孢子才能進(jìn)一步發(fā)育。在植物進(jìn)化史上，蘭科植物被認(rèn)為是進(jìn)化程度最高的，這可能是在長期的自然選擇中進(jìn)化出最節(jié)省能量的方式—只有授粉后胚珠才能真正開始發(fā)育。對不同植物而言，從花粉落到母本柱頭到受精的時間差別很大，短則幾分鐘，長則幾天數(shù)月，蘭科植物相對于其他植物從授粉到受精間隔時間較長，本研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛授粉后70d完成受精。

　　林業(yè)論文投稿刊物：林業(yè)科學(xué)研究(雙月刊)創(chuàng)刊于1988年，本刊是由中國林業(yè)科學(xué)研究院主辦的營林科學(xué)綜合性學(xué)術(shù)刊物。主要任務(wù)是及時反映以中國林科院為主的營林科學(xué)最新研究成果、學(xué)術(shù)論文和研究報告、科技動態(tài)和信息等，促進(jìn)國內(nèi)外學(xué)術(shù)交流，開展學(xué)術(shù)討論、繁榮林業(yè)科學(xué)，更好地為我國林業(yè)建設(shè)服務(wù)。

　　金釵石斛授粉前胎座未發(fā)育，授粉后胎座上有隆起發(fā)生，子房有少許膨大。說明授粉后產(chǎn)生了某種刺激而促使胎座發(fā)育，這種刺激有可能是人工授粉導(dǎo)致的，也有可能是花粉管生長過程中對子房的刺激從而產(chǎn)生了某些激素或某些物質(zhì)，這些激素能夠調(diào)節(jié)其他營養(yǎng)器官的養(yǎng)分運輸?shù)阶臃浚瑥亩�促進(jìn)胚珠的發(fā)育。蝴蝶蘭授粉后刺激體內(nèi)產(chǎn)生了乙烯從而促進(jìn)了胎座的發(fā)育[12]，金釵石斛的胎座發(fā)育是由上述哪種情況引起，刺激體內(nèi)產(chǎn)生了何種物質(zhì)還有待研究。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1]BillL，WayneH.DendrobiumandItsRelatives[M].U.S.A：TimberPress，2002：8-35.

　　[2]王雁，李振堅，彭紅明.石斛蘭資源生產(chǎn)應(yīng)用[M].北京：中國林業(yè)出版社，2007：11.

　　[3]王雁，周進(jìn)昌，鄭寶強，等.石斛蘭[M].北京：中國林業(yè)出版社，2015：225-281.

　　[4]黃捷.石斛屬植物交配親和性研究[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

　　[5]LituievDS，GrossniklausU.Patterningoftheangiospermfe-malegametophytethroughtheprismoftheoreticalparadigms[J].BiochemicalSocietyTransactions，2014，42(2)：332-339.

　　[6]連靜靜，錢鑫，王彩霞，等.無距蝦脊蘭胚珠發(fā)育及種子形成研究[J].西北植物學(xué)報，2013，33(3)：494-500.

　　[7]鄭寶強，王雁，郭欣.卡特蘭雌配子的發(fā)育[J].林業(yè)科學(xué)研究，2015，28(4)：497-501.

　　[8]SwamyKK，KumarHNK，RamaswamySN.ContributionstothemegasporogenesisandmegagametogenesisinHabenriagrandifloriformisLindl.andPlatantherasusannaeilLindl.(Orchidaceae)[J].AdvancesinPlantSciences，2005，18(2)：439.

　　作者：張艷慧1，鄭寶強1，繆崑1，侯芳梅2*，王雁1*