摘要：生物體內的蛋白質分子常常通過與其他蛋白質分子發生相互作用來發揮其生物功能.因此，研究蛋白質-蛋白質相互作用(protein-proteininteraction，PPI)對于闡明蛋白質分子的生物功能以及分子作用機理具有重要的意義.主要介紹基于生物物理和生物化學原理的檢測蛋白質-蛋白質相互作用的實驗研究方法，并對發展趨勢做出展望.

　　關鍵詞：蛋白質-蛋白質相互作用;生物物理方法;生物化學方法

　　蛋白質是生命體的重要組成部分，是生命活動的主要承擔者和執行者.人類基因組由20000￣30000個可編碼超過50萬種不同蛋白質的基因組成W.隨著人類基因組計劃的完成，旨在研究全基因組水平上所有蛋白質的表達、結構以及功能的蛋白質組學已然成為后基因時代的研究熱點.據估計，超過80%的蛋白質并不是孤立存在，而是與其他蛋白質通過相互作用形成穩定或瞬時的復合物結構%蛋白質-蛋白質相互作用(protein-proteininteractions，PPIs)是分子生物學中最重要的現象之一，幾乎在所有的生命過程如細胞通訊、代謝、轉運、信號轉導、免疫應答和基因轉錄中，都起著核心作用.通過研究蛋白質-蛋白質相互作用，可以探究蛋白質在生命過程中的作用以及發揮功能的機制，更好地理解生命過程.

　　因此，對蛋白質-蛋白質相互作用的研究，已成為生命科學研究的熱點之一W.蛋白質-蛋白質相互作用是生物分子網絡中的基本組成元件，但是異常的蛋白質-蛋白質相互作用很有可能會導致腫瘤的發生和發展.因此，蛋白質-蛋白質相互作用的位點也成為新興的一類藥物IE點，例如G蛋白偶聯受體(Gprotein-coupledreceptors，GPCRs)、核激素受體、離子通道和酶等叭癌癥、心血管疾病、免疫系統疾病等均有以靶向蛋白質-蛋白質相互作用的研究，如細胞色素c-細胞色素c氧化酶[61、?0-1-?0-1^71、人卩￡1-116【-，1、MDM2P53@等.

　　因此，研究PPIs為開發治療疾病的新藥提供了更多機會隨著蛋白質組學的飛速發展，用于表征蛋白質-蛋白質相互作用的方法相繼提出。比較傳統的技術方法有熒光偏振、核磁共振、酵母雙雜交和免疫共沉淀等.近年來新發展的方法包括生物膜干涉技術、微量熱泳動(microscalethermophoresis，MST)技術、AlphaScreen和蛋白質片段互補分析技術等.表1中總結了9種基于生物物理和生物化學原理，并被廣泛用于表征蛋白質-蛋白質相互作用的常用實驗技術以及近年來發展的新檢測方法.

　　1基于生物物理原理的檢測方法

　　1.1表面等離子共振表面等離子共振(surfaceplasmonresonance，SPR)是一種基于物質間相互作用所導致芯片表面質量變化而產生的一種光學現象。目前，SPR生物傳感器已經廣泛用于研究生物分子間的相互作用，可以對蛋白質-蛋白質相互作用進行實時、無標記檢測.

　　SPR的原理 來衡量.傳感器表面與待研究蛋白質之間的界面是傳感器系統的重要組成部分，一般購買商業芯片，其中包括通過氨基偶聯的CM5芯片、用于固定His標簽蛋白的NTA芯片和用于固定生物素化蛋白的SA芯片.與熒光或酶聯免疫吸附測定(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)相比，SPR技術具有很多優點：①測量基于折射率的變化，分析物不需要任何標記，可直接檢測;②測量可以實時進行，研究人員能及時獲得動力學數據和熱力學數據;③作為一種多功能技術，能夠檢測各種分子量的蛋白質.

　　基于以上特點，SPR已成為研究生物分子間相互作用的有力工具#1.以MDM2-P53的相互作用為例，Wu等采用雙通道SPR傳感器測定在肉瘤組織提取的游離態和與P53結合的MDM2的水平，為了獲得更高的靈敏度和特異性，使用MDM2特異單克隆抗體(2A10)識別游離態和與p53結合的MDM2，發現由肉瘤組織提取的游離態和總MDM2(游離和結合形式組合)蛋白質的濃度比正常組織提取的高，并且與P53結合的MDM2蛋白質僅占總MDM2濃度的一小部分.

　　但是，SPR技術的缺點是難以區分實驗過程中的非特異性吸附，對實驗結果造成影響.傳統的SPR技術限于低通量研究，因為標準SPR生物傳感器僅在單個傳感器芯片上包含3￣4個流動池.如今隨著技術的革新，表面等離子共振成像(surfaceplasmonresonanceimaging，SPRI)正在向高通量篩選(high-throughputscreening，HTS)發展.結合蛋白質陣列技術和電荷親合器件(charge-coupleddevice，CCD)相機，并根據反射光的強度制作圖像，SPRI已經發展到能同時處理成千上萬個樣本[1Q，13].

　　1.2生物

　　膜干涉生物膜干涉(biolayerinterferometry，BLI)是近年來新發展起來的一種基于光干涉量度法的檢測技術，可用于實時、快速、以非標記方式分析生物分子之間的相互作用.BLI技術 將相互作用的生物分子之一通過氨基偶聯、生物素/鏈霉親和素、組氨酸標簽/鎳離子螯合劑等方式固定于光纖制成的生物傳感器末端，形成生物膜層.當一束可見光垂直入射生物膜層時，光在生物膜層的兩個界面反射后形成一束能被光譜儀檢測到的干涉光譜.當固定分子與溶液中的分析物發生相互作用時，生物膜層厚度發生變化，通過檢測干涉現象的相位移動，從而能夠分析結合到傳感器上的分子數量的變化I14-15].

　　BLI技術的應用十分廣泛，可以檢測生物分子之間是否存在特異性結合.研究人員已將BLI技術廣泛用于蛋白質-蛋白質相互作用的研究，如Pogoutse等M利用BLI技術測定兩組蛋白質相互作用對Mms2/Ubcl3、鐵轉蛋白/TbpB間的結合常數.該工作采用了鏈霉親和素固定的方式，目標蛋白在體內實現生物素酰化過程，隨后以細胞裂解液取代純化的蛋白，通過BLI測得結合常數，既經濟又省時.

　　BLI技術具備實時監測、非標記、高通量、快速檢測等優點，可檢測親和力為1(T1Q￣104mol/L的相互作用，并且可提供結合的親和力ifD值及動力學信息.相比表面等離子共振的微流控系統，BLI技術侵入即讀的檢測手法更為簡便，且實驗結果不受樣品折射率影響，但是實驗過程中需要注意分析物是否與生物膜層存在非特異結合.另外，樣品緩沖液中所包含的部分去垢劑可能形成非均勻膠束，從而引起生物膜層非均勻性厚度變化，對檢測結果產生影響[15]+

　　1.3微量

　　熱泳動MST技術可以檢測分子在微觀溫度梯度場中的定向運動，因此也被稱之為熱泳動.定向運動現象對由結合引起的分子大小、電荷、構象或水化層的細微變化十分敏感，因而可以用來研究蛋白質-蛋白質之間的相互作用MST技術示意.

　　實驗過程中，對相互作用的蛋白質分子其中之一進行熒光標記，以溶液形式均勻分布于毛細管中.隨后，毛細管在紅外激光照射下形成局部溫度梯度，標記分子因熱泳動作用力而遠離加熱區域，經歷溫度躍遷(T-jump)后達到穩定態.在關閉激光后，標記分子經歷逆向溫度躍遷和反向擴散后，恢復到均勻分布的狀態[18_2Q1.

　　上述這一過程會受到由結合引起的分子大小、電荷或水化層變化的影響，因而通過逐步滴定與標記分子相互作用的蛋白質，MST技術可用來測定蛋白質-蛋白質相互作用的解離常數[21_221MST技術可以很容易地測量蛋白質結合的過程，目前越來越多地應用于與疾病相關的蛋白質相互作用的研究中，從而揭示疾病發生的分子機制.

　　例如，纖毛結構或者長度的失調會引發疾病.纖毛的前體微管蛋白(tubulin)在纖毛內運輸與兩個關鍵蛋白質IFT74和IFT81有關.Bhogaraju等網利用MST技術研究人類重組IFT81、IFT74與牛的ap-tubulin之間的偶聯特征，實驗發現IFT74/81復合物比單獨IFT81與tubulin的結合力大大增強，證明了與tubulin相偶聯的模塊是由IFT74/81復合物組成，而不是單獨的IFT81.

　　MST技術相比與其他體外結合實驗的優勢在于：①樣品無需固定處理;②樣品用量少，可對|iL級的溶液進行檢測;③對相對分子質量沒有限制;④可以進行快速檢測，結合活性實驗可在10min內完成測定;⑤可以測定pmol/L級的親和活性.此外，MST技術可以對復雜的生物體系如細胞裂解液、血漿等進行測定[241+通常，MST技術需要熒光團標記蛋白質分子.

　　2基于生物化學原理的檢測方法

　　2.1熒光共振能量轉移螢光費振能慧轉移(fiuOTes御wreson陽wenergytra取fer，遍指熒光供體在受到激發光激發后不發射出光予而將激發的能纛轉移到熒光受體上的現象(見_2(&))!夠.在對蛋白質-蛋白質相S作用的研究中，分子MFHE1T僅在熒光供體和受體相距非常近即形成復合物時發1喪.

　　因此，要產生FRET現象#要滿足3個條件：①供體發射光譜與受體激發光譜有重疊;@熒光供體和受體之間的距離在10nmoI/L范圍內;@H共體與受體之間迀移偶極子的方向平行^目前，廣泛用子供體與受體標記的熒光染料來自于録色熒光選白(gremifluoreseeBtpmfeiii，GFF)的突靜體包播青色貴光：蛋自-脅色養光蛋：自柄fluorescentprot#n，jr沾ftuor傲centprotein，網、藍色獎光蛋白-Gl?'P(bh^fluoreseeiitprotein-GPP，BrP-GEPJ?，CyPet-YpetW%Sffij^iriK〇M，OfPP-YFP。

　　隨著對FRET方法的優化，該技術已被廣泛應用于體外測定結合活性并篩選氧歲質-蛋白質相II作用抑制劑蛋：白被小1纖泛素樣修飾物(flliallubi職itin-Bketiodi細r，SIJ域O)修憤鳥：真核坐物界的蘺粟修飾：途輕.SUMO可以組裝成寨合鏈，與食賣兩個SCMO相瓦作用：基■(SUMO-城_流通motif，SIM)：的受體蛋白，質粗結氣從而對愛體蛋：：白貨：進行修飾.Kost等設計了一種FRET傳感器，用于測定SUMO線處=聚體與包含SIM蛋白質的結合，利用%來酰亞胺和銅催化的點擊化學反應將合成受體和供體的染料偶聯到SUMO亞基上，在多個進M配體存棚情況下監測PftlT變化.因此;開發PIET傳感器對于研究SCIMO-SIM：的相S作用具有￥常重要的價值.

　　3結束語

　　近年來表征蛋白質-蛋白質相互作用的新技術、新方法不斷涌現，并向高靈敏度、高通量的方向發展.根據研究目標的不同以及蛋白質自身的特點，選擇合理的檢測方法十分重要.若要定性表征蛋白質分子間是否存在相互作用，可以選擇傳統的拉下法、TAP、Co-IP等方法進行檢測;若要定量測量蛋白質分子間的相互作用，可以選擇MST，SPR，PLI等方法進行檢測;若要進行高通量的研究，可以選擇FRET，AlphaScreen，PCA等方法進行檢測.所有方法都有其自身的局限性，可能在檢測中出現假陽性或假陰性的結果.

　　生物方向評職知識：蛋白質工程論文發表指導

　　因此，應該使用基于不同原理的技術方法相互驗證，以獲得更為可靠的結果.同時，不同技術方法的聯用可彌補單種技術的不足.例如，借助質譜的高靈敏度、高通量的優勢，親和層析可以與質譜(massspectroscopy，MS)聯用(即AP-MS)鑒定與目標蛋白質相互作用的蛋白質，以獲得更完整的信息.隨著技術方法的持續進步，在蛋白質-蛋白質相互作用研究領域將會更廣泛地應用上述技術.預計檢測蛋白質-蛋白質相互作用的技術將向高通量方向發展，并將會產生大量的實驗數據，因此需要發展更強大的生物信息處理工具將原始數據轉化成有用的信息.

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　　作者：孔文娜，周宓2，林海霞王任小2