摘要：該試驗研究了酶法修飾對乳蛋白功能性質的影響。乳清蛋白的單酶和雙酶修飾產物的乳化活性并沒有顯著的升高或降低，但乳化穩定性相比于原料乳清蛋白分別下降了18.1%和28.55%。脫脂乳粉的2種酶修飾產物的乳化活性及乳化穩定性都與原料脫脂乳粉基本保持同一水平，無明顯差異。模擬體外消化過程檢測結果顯示，與原料乳清蛋白相比，經酶法修飾后的乳清蛋白產物一步消化和兩步消化后釋放的肽量均有所增加，并且單酶修飾乳清蛋白比雙酶修飾乳清蛋白的消化性更好。

　　疏水性檢測結果顯示，單酶體系和雙酶體系修飾的乳清蛋白和脫脂乳粉的表面疏水性都明顯高于相應的原料蛋白，其中，單酶體系修飾的乳清蛋白表面疏水性要比雙酶修飾乳清蛋白略高，而雙酶體系修飾脫脂乳粉高于單酶體系修飾脫脂乳粉，結果與固有熒光性分析的結果一致。該研究目的是確認單酶及雙氧化酶體系修飾乳蛋白的可行性，闡明其對乳蛋白功能性質的影響，為乳蛋白功能性質的改善提供一種新途徑，對拓寬乳蛋白在食品加工產業中的應用具有實際的理論指導意義和應用價值。

　　關鍵詞：乳清蛋白;脫脂乳粉;雙氧化酶體系;功能性質

　　牛乳蛋白是一種營養豐富的優質動物性蛋白，占牛乳的3.3%～3.5%，含有大部分必需氨基酸，易于消化和吸收[1]。其中，乳清蛋白作為一種重要的食品蛋白質而被廣泛應用于食品工業，尤其是作為食品基料而添加到嬰兒配方乳粉中。本研究以乳清蛋白和脫脂乳粉為原料，分別采用葡萄糖氧化酶單酶體系和葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶結合的雙酶體系處理原料蛋白，并分析該反應對修飾產物結構、功能性質的影響，旨在為乳清蛋白的酶法改性提供有效途徑和技術支持。對于蛋白質改性的相關研究是當前乳制品加工技術研究中的一個熱點。蛋白質改性，就是用物理或生化手段，使其氨基酸殘基和多肽鏈發生變化，改變其功能特性，以此制備具有更優質功能特性的蛋白質。物理方法和化學方法存在反應特異性低、反應條件嚴格、難以控制蛋白變性程度等不足。

　　而酶促反應有著反應條件溫和、副反應少、專一性強的特點，因而酶法修飾蛋白得到了廣泛關注與發展。Nivala等[2]分別用轉谷氨酰胺酶和酪氨酸酶交聯燕麥和蠶豆蛋白，改善了膠體穩定性和發泡性能。黎芳等[3]通過添加葡萄糖氧化酶改善了面團的網絡結構，使面團的韌性得到增強。此外，轉谷氨酰胺酶改性乳蛋白濃縮物并用于酸乳中，增加了酸乳的感官黏度和凝膠強度，使酸乳品質得到提升[4]。近年來，利用轉谷氨酰胺酶交聯蛋白質已被廣泛研究，而利用氧化還原酶，如：葡萄糖氧化酶、漆酶、辣根過氧化物酶來改性蛋白的研究還比較少。

　　葡萄糖氧化酶作為需氧脫氫酶[5]，是一種安全性很高的氧化還原酶，因此可以被應用于食品、藥品等領域中。將葡萄糖氧化酶應用于改善饅頭品質的研究表明，饅頭的比容增加，延展性增加，硬度下降，品質得到改良[6]。辣根過氧化物酶催化的反應中，包括芳香族化合物、酚類化合物等在內的還原性底物，與過氧化氫反應，生成了相對應的自由基。辣根過氧化物酶比活性高、穩定性好，應用于食品工業前景廣闊[7]。

　　已有研究表明，牛乳經辣根過氧化物酶和阿魏酸處理之后，制備的酸乳的質構和流變學特征得到改善[8]。以此為依據，本研究以乳清蛋白和脫脂乳粉為原料，分別采用單酶體系(葡萄糖氧化酶與葡萄糖)和雙酶體系(辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶與葡萄糖)修飾乳蛋白，分別采用一步法與兩步法對雙酶修飾產物的體外消化性進行檢測，并以原料乳蛋白和單酶修飾乳蛋白作為對照，對修飾產物的表面疏水性、乳化性能進行評價，研究酶法修飾對乳蛋白功能性質的影響。

　　1材料與方法

　　1.1實驗材料

　　辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶：美國Sigma公司;乳清蛋白、脫脂乳粉：北京泛亞乳品公司;其他試劑均為國產分析純。UV-2401PC紫外可見分光光度計：日本島津公司;F4500熒光分光光度計：日立高新技術公司。

　　1.2實驗方法

　　1.2.1酶修飾乳清蛋白樣品的制備

　　氧化體系包括葡萄糖氧化酶-辣根過氧化物酶雙酶體系和葡萄糖氧化酶單酶體系。乳清蛋白溶液的濃度為5%(w/v)，葡萄糖氧化酶的添加量為2U/g蛋白質，辣根過氧化物酶添加量為200U/g蛋白質，葡萄糖添加量為0.015mmol/g蛋白質，在37℃恒溫搖床中反應4h。反應結束后，修飾產物滅酶后冷卻凍干備用。同時制備單酶修飾乳清蛋白樣品，除不添加辣根過氧化物酶外，其余條件與雙酶修飾反應條件相同，樣品反應結束后同樣凍干備用。

　　1.2.2酶修飾脫脂乳粉樣品的制備

　　氧化體系包括葡萄糖氧化酶-辣根過氧化物酶雙酶體系和葡萄糖氧化酶單酶體系。脫脂乳粉溶液的濃度為5%(w/v)，葡萄糖氧化酶的添加量為2U/g蛋白質，辣根過氧化物酶添加量為200U/g蛋白質，葡萄糖添加量為0.015mmol/g蛋白質，在37℃恒溫搖床中反應4h。反應結束后，修飾產物滅酶后冷卻凍干備用。同時制備單酶修飾脫脂乳粉樣品，除不添加辣根過氧化物酶外，其余條件與雙酶修飾反應條件相同，樣品反應結束后同樣凍干備用。

　　1.2.3酶修飾產物體外消化性分析

　　修飾產物體外消化性的檢測分為一步水解法和二步水解法，實驗參照Marciniak-Darmochwal等[9]以及Tang等[10]的方法。一步水解法即胃蛋白酶水解，將樣品溶解成濃度為10g/L的樣品分散液，取10mL調節pH至2.0，加入2mg胃蛋白酶，于37℃恒溫水解2h。反應結束后，冷卻至室溫，加入等體積的濃度為200g/L的三氯乙酸溶液終止反應，10000×g離心20min，收集上清液，利用紫外分光光度計測定該稀釋液在280nm下的吸光值。二步水解法即胃蛋白酶-胰蛋白酶水解，將樣品溶解成濃度為10g/L的樣品分散液，取10mL調節pH至2.0，加入2mg胃蛋白酶，于37℃水解2h。反應結束后，置于90℃水浴中滅酶5min，冷卻后在電熱板上蒸干。將蒸干后的物質重新溶解于10mL濃度為0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)中，加入6mg胰蛋白酶，于37℃水解1h。反應結束后，冷卻至室溫，其余同一步水解法處理。

　　1.2.4酶修飾產物疏水性分析

　　1.2.4.1固有熒光發射光譜掃描

　　通過檢測蛋白樣品固有熒光發射光譜，可以分析其特征，進而發現修飾反應引起的蛋白結構上的變化。用pH為7.0的50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液溶解蛋白樣品，蛋白液終濃度為5mg/mL。激發波長280nm，激發波和發射波的狹縫寬度均固定為5nm，掃描速度240nm/min，發射光譜收集范圍290～420nm。

　　1.2.4.2表面疏水性的測定

　　表面疏水性的測定方法參照Yu等[11]的外源熒光探針ANS的方法。準確稱取凍干蛋白樣品，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液溶解，得到0.5mg/mL的蛋白溶液，經同樣的緩沖溶液稀釋得到一系列濃度(0.08～0.5mg/mL)的蛋白樣品溶液。樣品溶液離心(4℃)10000×g15min，取4mL上清液與20μL熒光探針ANS(8mmol/L溶于0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，pH7.0)混合均勻，避光反應15min后，在激發波長390nm、發射波長470nm以及狹縫5nm的條件下，測定ANS結合物的相對熒光強度，然后以相對熒光強度為縱坐標、蛋白濃度為橫坐標，以線性關系良好的回歸曲線的斜率表示表面疏水性。

　　1.2.5酶修飾產物乳化性分析

　　蛋白質乳化性能的檢測分為乳化活性及乳化穩定性，方法參照AgyareKK[12]的方法。用pH為7.0的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液溶解待測樣品，配制成0.1%的蛋白樣品溶液。將蛋白質溶液與一級精煉大豆油按體積比3:1混合，在12000r/min條件下均質1min。以1g/LSDS溶液調整儀器零點，分別在0min和靜止10min時從容器底部同一位置取50μL乳液置于試管中，加入5mL濃度為1g/L的SDS溶液混勻，迅速于500nm處測定吸光度值。重復測定3次。乳化活性指數(EAI)及乳化穩定性指數(ESI)為：EAI(m2/g)=2×2.303×A0×稀釋倍數/[C×(1—φ)×104]ESI(%)=A10×100/A0式中：A0為零時刻的吸光度值;C為蛋白樣品濃度，g/mL;Φ為油相體積分數(0.25);A10為靜置10min后的吸光度值。

　　2結果與分析

　　2.1酶修飾產物的體外消化性分析

　　本研究利用體外消化的方法，分別采用一步水解法(胃蛋白酶水解)和二步水解法(胃蛋白酶-胰蛋白酶水解)，模擬胃腸道環境，來研究酶修飾產物在人體內消化吸收及利用情況。通過測量蛋白質水解物上清液在280nm處吸光度值，可以反映出蛋白質經酶水解后的肽鏈釋放量，以此來分析酶修飾產物在胃腸道內的消化利用情況，與原料乳清蛋白相比，經酶法修飾后的乳清蛋白產物一步水解和兩步水解后釋放的肽量均有所增加，并且單酶修飾乳清蛋白比雙酶修飾乳清蛋白的消化性更好。經一步水解后，原料脫脂乳粉和經酶法修飾的脫脂乳粉產物釋放的肽量沒有明顯的變化，但兩步水解修飾產物中的肽量明顯增多，且兩步水解后單酶修飾產物的消化性高于原料脫脂乳粉和雙酶修飾產物，這與乳清蛋白修飾產物的消化結果一致。

　　2.2酶修飾產物的疏水性分析

　　2.2.1固有熒光性

　　蛋白質內部的發色氨基酸的熒光參數可提供蛋白質結構變化的信息。蛋白質的固有熒光性由酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸決定，主要取決于色氨酸。在蛋白質的所有氨基酸殘基中，色氨酸含有吲哚發色團，具有最高的輻射率和熒光產量，因此對其所在的蛋白質內部環境具有很高的敏感性。通常，當色氨酸所處環境由疏水性變為極性會導致發射熒光強度下降[13]。因此，通過監測色氨酸的熒光參數可準確地提供其鄰近區域蛋白質結構變化的信息。表示經過單酶體系和雙酶體系修飾的乳清蛋白和脫脂乳粉的熒光發射光譜。

　　經過單酶體系和雙酶體系修飾的乳清蛋白的修飾產物的相對熒光強度明顯高于原料乳清蛋白，說明酶法修飾乳清蛋白使蛋白質的疏水基團暴露，導致蛋白質固有熒光性增加。其中，單酶體系修飾的產物相對熒光強度要比雙酶修飾略高。分析圖2B可以發現，經過酶法修飾的脫脂乳粉的相對熒光強度較原料脫脂乳粉有明顯的增強，說明酶法修飾同樣影響脫脂乳粉的蛋白結構，但是，單酶體系修飾的脫脂乳粉的相對熒光強度低于雙酶修飾產物，與乳清蛋白酶法修飾產物不同。

　　2.2.2表面疏水性

　　表面疏水性的測定采用熒光探針ANS的方法。外源熒光物質8-苯氨基-1-奈酚-磺酸(ANS)是一種對極性敏感的疏水性染料探針，優先與蛋白表面暴露的疏水性氨基酸結合，使得疏水位點的熒光強度顯著增加，通過外源發色團可以定量描述蛋白質的表面疏水程度，反映蛋白質結構的變化。測定結果如圖3所示。由圖3中可以明顯看出，單酶體系和雙酶體系修飾的乳清蛋白和脫脂乳粉的表面疏水性明顯高于相應的原料蛋白，說明酶法修飾使蛋白質的疏水基團暴露，顯著增加乳蛋白的表面疏水性。其中，單酶體系修飾的乳清蛋白表面疏水性要比雙酶修飾乳清蛋白略高。單酶體系和雙酶體系修飾的脫脂乳粉的表面疏水性較原料脫脂乳粉有明顯的增強，且雙酶體系修飾產物高于單酶體系修飾產物，這里得到的結果與固有熒光性分析的結果一致。

　　2.3酶修飾產物的乳化性分析

　　對原料乳清蛋白及脫脂乳粉、單酶和雙酶修飾乳清蛋白及脫脂乳粉的修飾產物的乳化活性和乳化穩定性進行檢測，濃度為0.1%(w/v)的乳清蛋白、乳清蛋白單酶修飾產物、乳清蛋白雙酶修飾產物的乳化活性分別為24.59、22.76、26.02m2/g蛋白質，乳化穩定性分別為51.50%、33.42%、22.95%。

　　數據結果表明，相比于原料乳清蛋白，單酶和雙酶修飾的乳清蛋白修飾產物的乳化活性沒有明顯的變化，但乳化穩定性均有明顯下降。濃度為0.1%(w/v)的脫脂乳粉、單酶修飾脫脂乳粉、雙酶修飾脫脂乳粉的乳化活性分別為26.67、26.90、25.96m2/g蛋白質，乳化穩定性分別為34.33%、33.79%、34.04%。脫脂乳粉的單酶修飾產物的乳化活性略有升高，而雙酶修飾產物的乳化活性有所下降，但變化都很小，差異并不顯著。2種酶修飾產物的乳化穩定性與原料脫脂乳粉基本相同，無明顯差異。

　　3討論

　　3.1酶修飾產物的體外消化

　　體外消化基于對胃腸道環境的模擬來評價食品蛋白的營養性，是評價蛋白營養價值的重要指標。因此，研究各種改性方法對乳清蛋白消化能力的影響是非常必要的。本研究采用體外消化的方法評價了單酶體系和雙酶體系處理對乳蛋白消化性的影響，采用一步水解法(胃蛋白酶)和兩步水解法(胃蛋白酶-胰蛋白酶)水解修飾乳蛋白，檢測蛋白水解物上清液在280nm處吸光度值，能夠反映出蛋白質經酶水解后釋放的肽鏈量，以此來分析酶修飾產物在胃腸道內的消化利用情況。經分析結果發現，無論是單酶體系修飾乳蛋白還是雙酶體系修飾乳蛋白，修飾產物的消化能力與原料相比都沒有受到損害，反而有所提高。

　　其中，單酶體系修飾的乳清蛋白產物在一步水解和兩步水解之后，消化能力要強于雙酶體系修飾的乳清蛋白產物，但2種酶修飾乳清蛋白的消化能力均高于原料乳清蛋白。在一步水解檢測結果中，2種酶法修飾的脫脂乳粉和原料脫脂乳粉的消化能力基本相同，沒有明顯差異;而兩步水解的結果表明，雙酶體系修飾脫脂乳粉的消化能力與原料脫脂乳粉相比沒有明顯變化，但單酶修飾產物的消化性有明顯提高。消化能力的提高，可能是因為酶的修飾作用使蛋白的部分結構發生伸展，從而易于被胃蛋白酶和胰蛋白酶分解利用。Liu等[14-15]的研究也發現改性后乳清蛋白的消化性增加。由以上分析可以看出，酶法修飾乳蛋白并不會損害乳蛋白的消化能力。

　　3.2酶修飾產物的疏水性

　　蛋白質分子是由各種氨基酸相互聯接并折疊卷曲成特定的空間結構而形成的生物大分子，其中疏水相互作用是支撐蛋白質三級結構主要的作用力之一。蛋白質的表面疏水性主要與蛋白質分子表面疏水性氨基酸殘基的分布情況有關，若蛋白質分子表面的疏水性氨基酸殘基較少或尚未形成較連續的疏水區域，則蛋白質在界面的吸附力也較差[16]。表面疏水性能反映出蛋白質分子所發生的化學或物理變化，因此是評價蛋白質變性的一個重要參數[17-18]。

　　本研究利用外源熒光探針ANS對酶修飾產物的固有熒光性進行定量測定。結果表明，單酶體系修飾的乳清蛋白表面疏水性要比雙酶體系修飾乳清蛋白略高，而脫脂乳粉的雙酶體系修飾產物要高于單酶體系修飾產物，總體分析經酶法修飾的蛋白產物的表面疏水性均比其相應的原料蛋白高，結果與固有熒光性的分析結果一致。酶法修飾改變了蛋白質的結構，蛋白質之間交聯后蛋白分子結構展開，蛋白分子內部的非極性氨基酸殘基暴露出來，使修飾產物表面疏水性增大[19]。

　　Hiller[20]的研究表明，與原料蛋白相比，經3種氧化酶(包括轉谷氨酰胺酶、漆酶和葡萄糖氧化酶)分別交聯處理后的乳清分離蛋白和全牛乳蛋白的表面疏水性均得到提高，并指出這是由于聚合作用導致蛋白質結構展開，埋藏在蛋白質結構內部的疏水性氨基酸暴露的結果。這與本研究得到的結果一致。

　　3.3酶修飾產物的乳化性

　　蛋白質和油脂是食品的重要組成部分，它們的存在狀態和相關作用會影響蛋白質的乳化性質，從而影響蛋白質在食品工業的應用。在食品所在的乳化體系中，蛋白質能夠使油水之間的界面張力得到減小，從而降低了體系中油滴的聚集作用，使體系的穩定性得到提高。但是蛋白質要溶解并存在于兩相界面區域，才能在界面性質中起作用，因此蛋白質的乳化能力隨其溶解性增大而提高，不易溶解的蛋白質對乳化能力作用影響不大。

　　本研究是通過測定EAI和ESI來考察酶修飾對乳蛋白的乳化性能的影響。結果表明，相比于原料乳清蛋白，乳清蛋白單酶體系和雙酶體系的修飾產物的乳化活性沒有明顯的變化，但乳化穩定性有明顯下降。脫脂乳粉的單酶修飾產物的乳化活性略有升高，而雙酶修飾產物有所下降，但變化都很小，差異并不顯著。2種酶修飾產物的乳化穩定性與原料脫脂乳粉基本相同，無明顯差異。分析乳清蛋白酶修飾產物乳化穩定性下降的原因，可能是因為酶催化蛋白質反應過程中，蛋白質發生交聯，生成了大分子聚合物，降低了修飾產物的溶解性，因而導致了其乳化活性和乳化穩定性的降低。Hiller[20]的研究采用漆酶、葡萄糖氧化酶交聯酪蛋白的乳化穩定性分別降低了53%與75%，與本研究結果一致。

　　4結論

　　通過本研究得出以下結論：酶修飾乳蛋白產物的乳化活性沒有明顯變化，但乳清蛋白修飾產物的乳化穩定性有明顯降低;酶法修飾乳蛋白產物的體外消化性和表面疏水性相比于原料蛋白都有較為明顯的上升。本研究為乳蛋白加工過程中功能性質的改善提供了一種新途徑，對拓寬乳蛋白在食品加工產業中的應用具有實際的理論指導意義和應用價值。

　　參考文獻：

　　[1]金律.酶解乳蛋白在嬰兒配方乳粉中的應用[J].食品安全導刊,2014,15(8):42-43.

　　[2]NivalaO,MäkinenOE,KruusK,etal.Structuringcolloidaloatandfababeanproteinparticlesviaenzymaticmodification[J].FoodChemistry,2017,231.

　　[3]黎芳,劉佳,王冉冉,等.葡萄糖氧化酶對全麥面團及全麥饅頭品質改良的研究[J].食品工業科技,2019,(14):78-83.

　　[4]ChenL,LiY,HanJ,etal.Influenceoftransglutaminaseinducedmodificationofmilkproteinconcentrate(MPC)onyoghurttexture[J].InternationalDairyJournal,2018,78:65-72.

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