摘要：氣候“變干”和“變暖”是影響內(nèi)蒙古草原生態(tài)系統(tǒng)的2個關(guān)鍵氣候限制因子。為了明確氣候變化對荒漠草原土壤微生物群落數(shù)量及多樣性的影響，本研究在荒漠草原開展大面積人工增溫及干旱模擬，應(yīng)用稀釋平板法及微生物PCR分子鑒定技術(shù)，研究不同土壤深度可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量以及多樣性。

　　結(jié)果表明：溫度增加會使0～30cm土壤細(xì)菌數(shù)量減少，且表層數(shù)量變化強(qiáng)烈，中深層相對穩(wěn)定。干旱缺水同樣使0～30cm土壤細(xì)菌數(shù)量減少，但水分增加后，土壤細(xì)菌數(shù)量快速上升，表層變化更為明顯。氣候變干變暖對土壤細(xì)菌的群落多樣性影響較輕微，無顯著差異。不同處理的土壤細(xì)菌群落物種多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)均呈現(xiàn)出：增溫處理>溫度對照處理;減水處理>水對照處理>增水處理的趨勢，均勻度指數(shù)呈現(xiàn)出增溫處理>溫度對照處理;減水處理>水分對照處理>增水處理的趨勢。這主要是因為高溫和缺水的環(huán)境中激發(fā)了一些土壤細(xì)菌的生長，使分布較均勻，這可以作為指示細(xì)菌為以后深入研究荒漠草原的微生物變化提供一定的資料。

　　關(guān)鍵詞：人工增溫;干旱模擬;土壤細(xì)菌;群落多樣性

　　在全球氣候變暖的大背景下,中國草原區(qū)近50年氣候日趨變暖,以冬季升溫幅度最大[1-3];增溫和降水變異增大,導(dǎo)致草原牧區(qū)干旱化加劇,近90%的草原出現(xiàn)了不同程度的退化[3]。中國的荒漠草原主要分布在北部的干旱和半干旱區(qū)，是對氣候變化最為敏感的草原類型。從20世紀(jì)后40年間氣象站記載的氣溫和降水變化特征分析,處于中國北方中緯度區(qū)域的荒漠草原區(qū)年平均氣溫表現(xiàn)出上漲趨勢,是北半球中緯度地區(qū)升溫的一個非常好的例子。

　　降水則表現(xiàn)為長年波動狀態(tài),春季、冬季降水有明顯減少的趨勢[4]。20世紀(jì)50年代以來，氣溫升高、降雨量減少，造成了嚴(yán)重的水分虧損，正在明顯地影響著草原生態(tài)系統(tǒng)。氣候變化的“變干”和“變暖”是草原生態(tài)系統(tǒng)中兩個關(guān)鍵限制因素[5]。因此，氣候變化對草原生態(tài)系統(tǒng)的影響已經(jīng)成為研究焦點。但當(dāng)前的研究多為氣候變化對草原生產(chǎn)力、植被及群落組成等的影響[6]，而對草原區(qū)土壤微生物與環(huán)境變化的研究相對較少[4,6-8]。

　　草原是以土-草-畜為主體構(gòu)成的一個相對獨(dú)立的生態(tài)系統(tǒng)，土壤微生物在草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)中有很重要的作用，也是反應(yīng)環(huán)境變化的敏感指示生物，其數(shù)量和種群組成是評價草地土壤環(huán)境質(zhì)量的重要參數(shù)之一[9]。土壤中微生物數(shù)量繁多，種類豐富，而土壤細(xì)菌相對其他微生物來說其數(shù)量和種類更多。

　　土壤微生物是土壤有機(jī)質(zhì)的主要分解者，同時許多微生物具有固氮、溶磷、分解鉀素等作用，因此，土壤微生物在草地生態(tài)系統(tǒng)中營養(yǎng)元素循環(huán)、有機(jī)物質(zhì)的形成和分解、土壤肥力的保持和提高方面具有十分重要的作用。由于微生物的微觀性，結(jié)構(gòu)簡單、繁殖速度快，缺少準(zhǔn)確的基線用于種群數(shù)量統(tǒng)計等原因，人們對它們的研究遠(yuǎn)沒有像宏觀生物那樣受到重視，而對于草地土壤微生物的研究就更加滯后，1980年以前關(guān)于草地土壤微生物研究報道極少，近20多年來，才受到一些學(xué)者的關(guān)注。

　　因此，加強(qiáng)對草地微生物多樣性和功能的研究，特別是加強(qiáng)氣候變化與微生物關(guān)系研究，對恢復(fù)草地生態(tài)系統(tǒng)的生物學(xué)功能，實現(xiàn)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

　　1材料和方法

　　1.1研究區(qū)概況

　　試驗地設(shè)在內(nèi)蒙古自治區(qū)中部、烏蘭察布市西北部的四子王旗，地處北緯41°10′～43°22′，東經(jīng)110°20′～113°，屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫1～6℃，1月最冷，平均氣溫自北向南由-14℃遞降到-17℃。極端最低氣溫-39℃，7月最熱，平均氣溫自南向北由16℃遞升到24℃。極端最高氣溫35.7℃。積年平均降水量110～350mm。

　　四子王旗以畜牧業(yè)為主，資源豐富，植被類型為典型的荒漠草原,建群種為短花針茅(Stipabreviflora),優(yōu)勢種為冷蒿(Artemisiafrigida)和無芒隱子草(Cleistogenessongorica),伴生種主要有木地膚(Kochiaprostrata)、阿氏旋花(Apgarbindweed)、細(xì)葉蔥(Alliumtenuissimum)、羊草(Leymuschinensis)、狹葉錦雞兒(Caraganastenophylla)和小葉錦雞兒(Caraganamicrophylla)等。

　　1.2試驗設(shè)計

　　1.2.1增溫試驗

　　增溫試驗是在荒漠草原上建立12個3m×4m的小區(qū)，其中6個小區(qū)上方2.25m高處放置紅外加熱器;紅外加熱器所放高度保證其不會對土壤微生物產(chǎn)生影響;每個小區(qū)的間隔為4m，避免重復(fù)加溫;每個小區(qū)不同的土壤深度設(shè)置土壤溫度測定儀，根據(jù)土壤及地表溫度確定加熱強(qiáng)度。試驗設(shè)增溫處理(T)及增溫對照處理(Tck)，6次重復(fù)，小區(qū)隨機(jī)分布。增溫?zé)艄荛L邊方向為南北方向，燈管離地面高度為2.25m。利用燈管加熱保證增溫處理區(qū)地表溫度增溫1.5℃。

　　1.2.2干旱模擬試驗

　　干旱模擬試驗與增溫試驗在相同的地點，保證相同的草原類型及氣候條件，建立12個6m×15m小區(qū),其中在對照處理區(qū)每一個重復(fù)內(nèi)設(shè)1個2m×4m的旱棚，旱棚頂部的開放面積為總面積的一半，用來模擬干旱的氣候條件;旱棚收集的雨水用于增水處理區(qū)。每一小區(qū)土壤中設(shè)立自動水分測定儀，動態(tài)測定不同土壤深度的水分含量改變情況。

　　每一試驗都設(shè)有空白對照區(qū)，并保證對照及各處理區(qū)間在年內(nèi)據(jù)有相同的農(nóng)事活動。控水試驗設(shè)對照處理(WCK)、增水處理(+W)、減水(-W)處理，6次重復(fù)，各小區(qū)隨機(jī)分布。其中增水處理為增加當(dāng)年自然降雨量的一半水量，減水處理為減少到年度自然降雨量的一半。

　　1.3主要儀器和試劑

　　主要儀器：天馬牌TD型電子天平、50mL離心管、SW-CJ-1F雙人單面凈化工作臺、Finnpipette單道移液器、YX280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器、HY-4多用調(diào)速振蕩器、JCZ-GPL050B智能程控型干燥/培養(yǎng)兩用箱、Tocan透射防護(hù)蓋紫外分析儀及成像系統(tǒng)、BlueMarlinTC-960FPCR儀等。

　　主要試劑：pH試紙、ParafilmPM-996封口紙、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、NaCl、無水乙醇、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉紅、青霉素、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、NaCl、FeSO4·7H2O、1mol·L-1NaOH溶液、EB染液、超純水等。

　　1.4試驗方法

　　1.4.1土樣采集

　　本研究地點選在內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學(xué)院四子王旗野外定位站，在荒漠草原上進(jìn)行人工增溫水分控制試驗，即采用紅外加熱器和人工化旱棚模擬不同氣候變化，并設(shè)置空白對照區(qū)進(jìn)行對比。本研究土樣采自2012年8月初，包括增溫處理、增溫對照處理、增水處理、減水處理和水分對照處理。每處理隨機(jī)選取多個樣點，用土鉆在每一個點取0～2，2～5，5～10，10～20，20～30cm5層土樣各約30g，用封口塑料袋密封，并在最短時間內(nèi)帶回實驗室放于冰箱中，在冷凍條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.4.2土壤細(xì)菌的培養(yǎng)方法

　　采用稀釋平板法對土樣進(jìn)行分離，計數(shù)。采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[10]對土樣細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過預(yù)試驗確定細(xì)菌計數(shù)在30～300菌落數(shù)的稀釋濃度是4～10g·mL-1，此時不僅菌落利于計數(shù)，而且分離充分、特征明顯。每個處理的土樣稀釋液設(shè)3個重復(fù)，涂布均勻后，將平板倒置放在溫度為28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3d，根據(jù)菌落特征進(jìn)行初步分類、拍照和編號并進(jìn)行菌落計數(shù)，最后挑選生長良好、有代表性的菌落進(jìn)行分離與純化。

　　1.4.3土壤細(xì)菌的分子鑒定

　　用土壤DNA提取試劑盒提取菌落的DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用的引物序列為341F-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGCGAGGCAGCAG-3′)57bp和534R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)17bp。PCR反應(yīng)體系為50μL：10×EsBuffer(含Mg2+)5μL;dNTP4μL(各2.5mmol·L-1),上游引物2μL，下游引物2μL,TapEsDNA聚合酶0.5μL(5U·μL-1)，模板1μL(10ng·μL)1，加超純水至50μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min,30次循環(huán)：94℃變性1min，55℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃下延伸10min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

　　細(xì)菌16sDNA電泳檢測出條帶的PCR產(chǎn)物送交北京六合華大基因科技股份有限公司測序。將測序結(jié)果在NCBI中的BLAST里面的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，找出相似度最高的序列，使用CLASTALX進(jìn)行比對，根據(jù)其與已知菌種16SDNA序列的相似性來進(jìn)行菌種分類與鑒定。

　　1.5數(shù)據(jù)處理

　　采用Sigmaplot13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的圖表處理,利用SPSS13.0進(jìn)行單因素方差、(One-WayANOVA)分析。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1氣候變干、變暖條件下土壤細(xì)菌數(shù)量的變化

　　為了明確增溫對草原土壤細(xì)菌數(shù)量的影響,比較了溫度對照處理與增溫處理土壤細(xì)菌在不同土壤深度的差異。在土層0～2，2～5，5～10和20～30cm中，增溫組的土壤細(xì)菌數(shù)量低于空白對照組。其中僅在表層土壤0～2cm和2～5cm存在顯著性差異，分別下降了32.94%，1.52%。在0～2cm土層中溫度對照處理細(xì)菌數(shù)量較多，與增溫處理細(xì)菌數(shù)量相差最大。究其原因，可能是0～2cm表層土受溫度影響最大，由于人工增溫導(dǎo)致0～2cm表層土的溫度超過部分細(xì)菌的最適生長溫度，從而細(xì)菌數(shù)量迅速減少。

　　在10～20cm中，增溫反而增加了土壤中細(xì)菌的數(shù)量，且存在顯著性差異。綜合考慮，增溫處理后該土層深度的土壤溫度比對照處理的稍高，其正好適宜細(xì)菌生長。20～30cm土層中二者相差較小，可能是深層土壤的溫度及理化性質(zhì)比較穩(wěn)定。整體來看，在0～30cm土壤中，增溫顯著降低了土壤細(xì)菌數(shù)量。與空白對照相比，增溫組土壤細(xì)菌數(shù)量下降了8.40%。

　　說明，在人工增溫的試驗條件下，高溫會對土壤部分細(xì)菌的生長產(chǎn)生抑制，造成其數(shù)量相對較少。在水分試驗中，對比3個處理結(jié)果可見：在5個土層中，0～2，2～5，5～10cm土壤細(xì)菌數(shù)量均呈現(xiàn)：增水處理>水分對照處理>減水處理。增水處理增加了土壤表層的細(xì)菌數(shù)量，對中深層影響不顯著。其中，0～2，2～5，5～10cm土層中，與空白對照組相比，增水組土壤細(xì)菌數(shù)量分別增加了12.40%，11.05%，4.94%。

　　隨著土層加深，增水對土壤細(xì)菌數(shù)量的影響逐漸減弱。整體來看，0～30cm中增水組的土壤細(xì)菌數(shù)量增加了2.82%，差異不顯著。0～2，2～5，5～10cm中，減水組的土壤細(xì)菌數(shù)量與對照相比分別下降了23.14%，12.11%和5.35%。原因可能是表層土壤中干旱缺水會影響部分細(xì)菌的生長，導(dǎo)致數(shù)量較少，且0～2cm土壤層的水分相差最顯著。在10～20，20～30cm土層中，3個處理的細(xì)菌數(shù)量差別較小，趨于平衡，主要是由于隨著土層深度的增加，土壤中的水分狀況比較穩(wěn)定，3個處理的差別較小。

　　整體來看，0～30cm土壤細(xì)菌總量在降雨量減少一半之后下降了9.62%。總體而言，高溫和缺水會對土壤細(xì)菌的生長條件產(chǎn)生很大的負(fù)面作用，導(dǎo)致其數(shù)量與對照區(qū)相比有所下降。首先，溫度增加會使土壤可培養(yǎng)細(xì)菌減少約5.5×106cfu·g-1，與對照相比降低6.16%;而干旱缺水土壤可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量將減少7.5×106cfu·g-1，與對照相比降低9.62%。

　　對比發(fā)現(xiàn)缺水對于土壤可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的影響稍大一些，主要因為缺水對細(xì)菌數(shù)量影響較大。同時發(fā)現(xiàn)在人工增水處理情況下，與減水處理相比，土壤可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量會有一定的恢復(fù)，并且稍多于水分對照處理。可見干旱情況在增水處理之后，土壤可培養(yǎng)細(xì)菌會得到相應(yīng)的改善，其恢復(fù)力也較強(qiáng)。

　　2.2土壤細(xì)菌種屬鑒定結(jié)果

　　經(jīng)過鑒定，取樣土壤中的土壤細(xì)菌類群包括芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌(Arthrobacterspp.)、黃桿菌(Flavobacteriumsp.)、耐鹽節(jié)桿菌(Arthrobacterpascens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)、金色桿菌(Chryseobacteriumsp.)、雙歧桿菌屬(Bifidobacteriumsp.)、污泥顆粒菌(Sludgegranulebacterium)、產(chǎn)氫菌(Clostridiumsp.)。其中芽孢桿菌屬包括嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilu)、臘狀芽孢桿菌(B.cereus)、球形芽孢桿菌(B.spaericus)、泛酸芽孢桿菌(B.pantothenticus)，且在各處理中芽孢桿菌屬均占絕對優(yōu)勢，占細(xì)菌總量的80%。

　　2.3氣候變干、變暖條件下土壤細(xì)菌多樣性的變化

　　氣候變干變暖條件下不同土層細(xì)菌群落的多樣性。其中增溫處理中，除10～20cm土層外，其余土層土壤中細(xì)菌群落的Shannon-wiener指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)均高于空白對照，優(yōu)勢度指數(shù)低于空白對照。說明增溫使土壤細(xì)菌群落多樣性略微增高，但差異不顯著。但是在20～30cm的深層土壤中細(xì)菌群落的物種多樣性都趨于相似。

　　這主要與表層土壤環(huán)境受外界環(huán)境影響較大，尤其是在溫度升高的情況下，會刺激一些細(xì)菌類群的生長，而深層土壤理化性質(zhì)相對穩(wěn)定有關(guān)。在減水處理中，土壤表層即0～2，2～5，5～10cm中，土壤細(xì)菌群落的Shannon-wiener指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)均高于空白對照和增水處理，優(yōu)勢度指數(shù)均低于空白對照和增水處理。說明減水處理使土壤細(xì)菌群落的多樣性有增高的趨勢，且高于增水處理的效果，但差異不顯著。隨著土壤深度的增加，3個處理之間的多樣性指數(shù)差距相對較小。說明土壤表層受土壤水分的影響比較明顯，深層土壤受其影響較小。

　　3結(jié)論與討論

　　在本研究中，氣候變化對內(nèi)蒙古荒漠草原土壤細(xì)菌的數(shù)量產(chǎn)生了一定的影響。增溫和干旱導(dǎo)致0～30cm深度土壤細(xì)菌數(shù)量有所下降，而水分增加一半后，土壤細(xì)菌數(shù)量快速增加。研究表明，土壤微生物具有很強(qiáng)的恢復(fù)力，能在加水后的幾天甚至幾小時內(nèi)快速恢復(fù)[11]。還有研究表明，適當(dāng)?shù)臏囟壬�高會增加土壤�?xì)菌的數(shù)量，但是超過其最適生長溫度范圍，土壤細(xì)菌數(shù)量就有一些種類的細(xì)菌數(shù)量稍有一些減少[12]。

　　水分條件充足有利于土壤細(xì)菌的生長繁殖。因而，隨著近年來內(nèi)蒙古地區(qū)荒漠草原環(huán)境的惡化，尤其是缺水嚴(yán)重，會影響土壤中細(xì)菌的數(shù)量，使其有一定程度的減少。本研究還發(fā)現(xiàn)在五區(qū)樣地的0～20cm土層土壤細(xì)菌數(shù)量明顯多于20～30cm土層，二者相差10倍左右。表現(xiàn)為隨土層深度的增加，土壤細(xì)菌數(shù)量呈明顯下降的趨勢，這與大多數(shù)的研究結(jié)果相一致[13]，主要因為土壤表層牧草根系分布密集，根系分泌物和枯枝落葉積累多，營養(yǎng)和水熱條件比深層土壤好，有利于細(xì)菌的生長和繁殖。

　　四子王旗試驗樣地的不同處理中土壤細(xì)菌的Shannon-Wiener指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)都有一定的差異。該區(qū)土壤細(xì)菌種類多，各樣點差異不大。溫度對照處理比增溫處理的細(xì)菌優(yōu)勢度指數(shù)略高，而細(xì)菌物種多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)增溫處理高于對照處理，但差異不顯著。類似的結(jié)果在其他研究中也有發(fā)現(xiàn)，短期的增溫對土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)影響較為明顯，但多樣性和豐富度影響不大[14]。

　　增減水與對照區(qū)相比，細(xì)菌物種多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)大致呈現(xiàn)：減水處理>對照處理>增水處理的趨勢，水分對照處理優(yōu)勢度指數(shù)最高，增減水兩區(qū)差別不顯著。說明在內(nèi)蒙古荒漠草原，減水區(qū)土壤中物種多樣性指數(shù)相對較高，表層更為明顯，隨土層加深各指數(shù)也是趨于相同。可能是因為干旱會導(dǎo)致某些細(xì)菌種類數(shù)量分布較均勻。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1]趙吉，廖仰南，張桂枝，等.草原生態(tài)系統(tǒng)的土壤微生物生態(tài)[J].中國草地，1999(3)：57-67.

　　[2]王家玉.浙江稻田土坡的微生物區(qū)系研究閉[J].土壤通報,1984,15(6)：274-278.

　　[3]ZHAOQG,XUMJ.SustainableagricultureevaluationforredsoilhillregionofsoutheastChina[J].Pedosphere,2004,14(3)：313-321.

　　[4]JENKINSONDS，DAVIDSONSA，POWLSONDS.Adenosinetriphosphateandmicrobialbiomassinsoils[J].Soilbiology&biochemistry,1979,11(5):521-527.

　　[5]GUOJ,ZHUT.StudyontherelationshipbetweenmicroorganismsandecologicalenvironmentinLeymuschinesisgrassland[J].Actaagerstiasinica,1996(4):240-245(inchinese).

　　[6]ANDERSONTH,DOMSCHKH.Aphysiologicalmethodforthequantitativemeasurementofmicrobialbiomassinsoils[J].Soilbiologyandbiochemistry,1978,10:215-222.

　　土壤方向刊物推薦：土壤通報是中國科協(xié)主管、中國土壤學(xué)會主辦、沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)承辦的土壤學(xué)與肥料學(xué)學(xué)術(shù)期刊。為農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)科學(xué)類核心期刊。