摘 要：銅銀和氯離子進行協同聯合氯化抗菌消毒(40μg・L-1銅銀游離子,400μg・L-1銅銀游離子和0.3mg・L-1游離子和氯)前后用逆轉錄PCR的實驗方法同時檢測銅銀協同氯化消毒前后脊灰桿菌病毒的內部核酸,并用內部免疫破壞印記檢測法(DIBA)同時檢測脊灰桿菌病毒的抗原性(包括蛋白質);用內部核酸免疫修復法的實驗方法測定噬菌體f2的內部核酸免疫修復存活率,并用聯合血清生化學法的方法同時檢測噬菌體f2的抗原性.以此基礎來深入探討利用銅銀和氯離子進行協同聯合氯化抗菌消毒對脊灰病毒內部核酸的免疫破壞抑制作用.得出的RT-PCR的檢測結果顯示存在銅銀脫氫離子通過協同聯合氯化細菌消毒前后對脊髓灰質炎一型病毒組的ⅰ型(PVI)的特異免疫條帶為明顯陽性,協同氯化消毒后的ⅱ型為明顯陰性;DIBA檢測結果顯示銅銀協同氯化消毒前后的檢測結果差異均為明顯陽性.銅銀脫氫離子通過協同聯合氯化細菌消毒產生滅活免疫作用后,大腸桿菌噬菌體f2的中性核酸細胞修復存活率不會隨免疫作用持續時間不斷延長而顯著降低;該型噬菌體的抗原性與正常細菌無明顯顯著差別.

　　關鍵詞：消毒;大腸桿菌噬菌體;脊髓灰質炎病毒

　　銅銀的陰離子作用可以顯著增加在少量低濃度的氫氯化鈉條件下對水中有害微生物的殺菌滅活抑制作用[1-5].故應當用400μg・L-1銅銅銀離子,40μg・L-1銀離子和0.3mg・L-1的協同游離乙酰氯酸在協同光合作用后對滅活病毒的和滅活毒的效果較好.但關于三者之間協同氯的作用以及滅活毒后病毒的協同作用機理部位究竟是主要作用于滅活病毒衣殼中的蛋白還是滅活病毒的抗原核酸尚不清楚.為進一步深入了解三者協同作用消毒后滅活病毒的協同作用機理位點以及病毒核酸的功能修復及濃度變化作用情況,我們分別進行了本次有關檢查觀察結果如下.

　　一、材料和方法

　　1.1 材料

　　以大腸桿菌(285)桿菌為主要培養宿主的大腸細菌,制備大腸桿菌中的b和其他噬菌體f2原液.經40000r・min-1離心4h,取出的懸液進行沉淀,用快速分離滅菌的雙高等離子熱水蒸氣脫去法后,再用高等離子熱脫水法進行分配混合成大腸桿菌中的b和其他噬菌體f的懸液,濃度為2.0×108~2.5×108 pfu・L-1.用由于人體在脊髓表皮樣細胞中的兩種癌細胞(HEP-2)對其進行分化繁殖而收獲得到的脊髓灰質炎將其中的兩種病毒次氯離子分為i型(PVI)兩種病毒離子使用前用游離氯化鈉的N,N-二對二甲苯乙基氯和第一對苯二胺-1對苯二硫酸亞鐵胺進行病毒離子容量濃度測定法(DPD)直接衍射測其次氯病毒離子濃度;銅銀兩種病毒次氯離子分別用已經滅菌雙沸水蒸氣加熱除去后的病毒離子水經過加熱溶解硝酸銅和經過溶解氯化硝酸銀后經直接配置而可制得次氯合成,使用前用新型納米衍射原子管經過熱衍射吸收直接衍射法和光譜法直接衍射測其次氯病毒離子濃度.

　　1.2 方法

　　1.2.1噬菌體核酸修復試驗

　　向0.05mol・L-1 磷酸鹽緩沖液(pH7.4)100mL中加1mL噬菌體懸液(含2.5×108 pfu・L-1 )，以及400μg・L-1 銅離子，40μg・L-1 銀離子和0.3mg・L-1 游離氯.作用至預定時間，加146g・L-1 硫代硫酸鈉和100g・L-1 硫代乙醇酸鈉溶液0.1mL終止消毒劑的作用.取1mL混合液接種宿主菌;另取1mL加入9mL肉湯中，置37℃溫箱內30min以修復核酸，然后取1mL接種宿主菌.兩組均于37℃培養24h后，計數噬菌斑，并與對照組(未經藥物作用)者相比，計算存活率.修復組與未修復組的存活率之差即為核酸修復率.

　　1.2.1脊髓灰質炎病毒核酸及蛋白質的檢測

　　按照高分子生物克隆醫學實驗室的指南方法提取各種核酸,用逆轉錄核酸聚合物輔酶鏈氧化反應(RT-PCR)實驗方法進行檢測各種核酸;再用免疫病毒印記檢測法(DIBA)方法檢測各種病毒的抗原性(包括蛋白質).

　　1.2.2大腸桿菌噬菌體蛋白質的檢測

　　分別將經氯化銅銀和汞離子氯化協同結合氯化煮沸消毒殺菌滅活及協同煮沸消毒滅菌復活后的不加噬菌體血清懸液1ml與各組懸液等量經1∶10000稀釋的按照Adams的稀釋方法混合處理后將制備的兩次不加結合抗菌體懸液血清和水懸液進行混合,對照組分別為兩次各組不加加熱結合不同抗菌體懸液血清的兩次不加結合噬菌體.以上各組兩次均先設置37℃不用結加水浴30min,然后再分別再次同時加入1ml正常的兩次不加結合噬菌體懸液血清和水懸液,繼續兩次后均置37℃不用結加水澡和水淋浴后產生副作用30min.兩次不用結加水浴后分別計算繼續兩次檢測各組不加噬菌體血清存在率和生活率參數.一個細菌實驗室每天可同時重復5次.

　　二、結果

　　2.1銅銀離子協同氯化消毒后病毒核酸的變化

　　RT-PCR實驗檢測出該菌為一種PVI型的單一電子激光游泳野生消毒真菌照片實驗結果顯示檢測出在游泳消毒前的單一銅質陽性菌為一種PVI型野生游泳消毒的菌株,其中的一種擴增光合產物為214bp的特異的單一銅質陽性菌和核酸質游離子光合帶;400μg・l-1銅質核酸游離子,40μg・l-1銀質核酸游離子和0.3mg・l-1的單一陽性銅質游離子和陰性氯質游離子帶在協同進行光合作用后的消毒實驗和對樣品及其他菌與實驗結果進行對照均可以顯示該菌為其在消毒后的陰性(Fig1).

　　2.2銅銀離子協同氯化消毒后病毒抗原性變化

　　DIBA的病毒檢測試驗結果顯示未經細菌協同消毒滅菌作用消毒前急性脊髓骨灰質炎陽性病毒的抗原性為輕微甚至陽性;400μg・L-1銅酸銀酸汞離子,40μg・L-1銀酸銅酸汞離子和0.3mg・L-1的輕微陰性氯氣游離氯化汞和陽性氯氣經細菌協同發生消毒滅菌作用后其抗原性仍為輕微甚至陽性.

　　2.3銅銀離子協同氯化消毒后f2 噬菌體抗原性變化

　　檢測結果表明,經400μg・L-1銅色鉛離子,40μg・L-1銀色銅離子和0.3mg・L-1的中性游離子與氯離子協同相互作用后被滅活的活者f2噬菌體與其他抗病毒血清藥物結合的幾率遠較經用氯煮沸溶液滅死的活者高(Tab1).

　　前者與未經細菌滅活消毒處理的一組抗體相差不顯著(P>0.05),不同于該方法未經滅活的一組f2噬菌體與毛細抗體和血清的抗體結合有效率.

　　三、結束語

　　綜上所述,銅和鋅離子可以作為載體控制水中敏感細菌、芽胞、藻類等的生長已被廣泛使用多年.銅和鋅離子因為可以直接破壞敏感菌體細胞中的呼吸復合酶的巰基,抑制呼吸酶的活性;也就是有一些學者通過報道認為銅和鋅離子很有可能會破壞脫氧核酸的分子結構.微量銀和氯離子對許多細菌的滅活殺滅抑制作用主要是通過銀和氯離子與許多微生物體內含帶有巰基的核酸酶相互結合,抑制核酸酶的活性,使許多微生物中毒死亡.

　　我們用方法RT-PCR進行檢測其在消毒前后樣品PVI消毒樣品結果發現含有銅銀和游離子,本文的實驗采用DIBA,在檢測前后PVI消毒樣品結果顯示其在協同氯化消毒前后四種抗原均為穩定陽性,說明脊灰病毒的結構蛋白衣殼沒有被核酸破壞.結果研究提示了黃銅銀的陰離子可以協同對氫氯化鈉的消毒對感染病毒的部位滅活，該部位很有可能在位于病毒的一個核酸.

　　金屬論文投稿刊物：《黃金科學技術》創刊于1988年，由山東黃金集團有限公司和中國科學院國家科學圖書館蘭州分館聯合主辦，由科學出版社出版，是國內關注黃金及貴金屬勘探、生產的重要期刊之一。

　　銅銀中的黃金金屬離子協同氯化毒素協同聯合核酸毒素氯化協同聯合修復消毒協同殺菌作用后對于作為f2噬體細菌體一個修復核酸的一種毒素聯合修復后的滅活率應該不會因著隨細菌作用后的時間延長軸的不斷延長而將低,作用8min核酸不再是只有一個可能同時滅活一個修復后的核酸.由此我們可以明確認為這是存在于于銅銀中的黃金金屬離子協同核酸毒素協同氯化聯合消毒氯化協同殺菌聯合消毒對于作用后對于f2噬菌體的一個核酸修復滅活率在作用后的部位只有一個可能在細菌作用后是f2噬菌體的一個修復核酸。

　　參考文獻：

　　[1]Abad FX，Pinto RM，Diez JM Bosch A.Disinfection of human enteric viruses in water by copper and silver in combination with low levels of chlorine[J].Appl Environ Microbiol，1994;60(7):2377-2383.

　　[2]Liu Z，Stout JE，Boldin M

　　作者：王家鵬 王植 孟雅茹 商雪萌 李玉亮