摘要基于靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜/串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜，建立了一種鑒別奶牛、水牛、牦牛、山羊、綿羊、馬、驢和駱駝共8個(gè)物種奶的分析方法。針對(duì)8個(gè)物種奶中6種乳蛋白酶解產(chǎn)生的特征多肽進(jìn)行分析，利用同位素內(nèi)標(biāo)法實(shí)現(xiàn)多條多肽的同時(shí)檢測(cè)及比較，通過(guò)理論多肽分析、實(shí)際多肽檢測(cè)、干擾考察、線性與最大酶解時(shí)間比較，最終篩選出13條特征多肽。依據(jù)13條特征多肽對(duì)模擬混合奶樣品中的不同物種奶進(jìn)行分析，對(duì)市售16個(gè)奶制品中的奶源物種進(jìn)行鑒別。結(jié)果表明，特征多肽在奶源物種鑒別中具有良好的穩(wěn)定性與特異性，本方法對(duì)多物種奶制品行業(yè)的質(zhì)量控制與監(jiān)管具有參考價(jià)值。

　　關(guān)鍵詞靶向蛋白質(zhì)組學(xué);液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù);物種鑒別;乳蛋白

　　奶制品是日常膳食體系中常見的飲品和營(yíng)養(yǎng)攝入源之一。常見的奶制品除奶牛奶外，還有山羊奶、綿羊奶、水牛奶、牦牛奶、馬奶、驢奶和駱駝奶等產(chǎn)量較少的奶源，這些奶各具獨(dú)特營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1-4]。例如，山羊奶致敏性低[5]，含有大量的脂肪和蛋白微粒，容易水解吸收[6-7];驢奶富含乳清蛋白，其乳清蛋白與酪蛋白的比例與人乳接近，更易于吸收[7];駱駝奶含有比奶牛奶高30倍的維生素C[8]，并且富含內(nèi)胰島素，可作為治療糖尿病的輔助食品[9-10]。

　　蛋白質(zhì)論文范例： 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法

　　由于產(chǎn)量少且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，這些奶在市場(chǎng)上的價(jià)格高于奶牛奶。在利益的驅(qū)使下，這些奶及其奶制品在加工過(guò)程中存在摻入奶牛奶或直接以奶牛奶冒充等問(wèn)題。因此，建立奶制品物種成分的鑒別方法以識(shí)別不同物種奶，對(duì)于奶制品行業(yè)的品質(zhì)監(jiān)管具有重要意義。目前，有關(guān)不同物種來(lái)源奶(簡(jiǎn)稱多物種奶)的鑒別研究已有許多報(bào)道，例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)[11]、酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)[12]、凝膠電泳法[13]、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[14-15]和基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF)[16]等。PCR和ELISA法通過(guò)基因或抗原抗體免疫結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)多物種奶中標(biāo)志物的識(shí)別，具有較高的靈敏度。

　　但是，該類檢測(cè)方法通常僅適用于定性或半定量分析，并且易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。HPLC-MS和MALDI-TOF法通過(guò)分子質(zhì)荷比的分析實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性識(shí)別。但是，由于蛋白質(zhì)分子量大、修飾多，在諸如高溫滅菌奶、乳粉等奶制品加工過(guò)程中，其結(jié)構(gòu)組成容易因溫度、壓力等因素的影響而發(fā)生變異，使檢測(cè)方法容易受到干擾。靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[17-18]是一種基于已知蛋白質(zhì)氨基酸序列信息，利用蛋白酶水解結(jié)合HPLC-MS技術(shù)，篩選出待測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特征多肽，并通過(guò)對(duì)特征多肽的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)定性和定量分析的方法。

　　由于特征多肽序列短、質(zhì)量數(shù)小、檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性高，并且其結(jié)構(gòu)組成在加工過(guò)程中受溫度和壓力等因素的影響較小[19]，因此在全脂粉和嬰兒配方奶粉[20]等檢測(cè)中具很強(qiáng)的抗干擾能力。目前，靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已在水牛與奶牛乳清蛋白特征多肽鑒別[21-22]、山羊與奶牛的乳清蛋白差異分析[23]等方面得到應(yīng)用。Camerini等[21]利用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了水牛奶酪中殘留的乳清成分，并建立了鑒別水牛與奶牛β乳球蛋白的分析方法。

　　Ke等[24]利用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)山羊奶與奶牛奶中6種乳蛋白的特征多肽進(jìn)行了對(duì)比與篩選，利用特征多肽實(shí)現(xiàn)了山羊奶制品中奶牛奶成分摻假的檢測(cè)。但是，目前的研究通常僅針對(duì)少數(shù)物種奶與奶牛奶的鑒別分析，由于奶制品行業(yè)中奶源物種繁多，建立一種針對(duì)多物種來(lái)源乳制品的同時(shí)檢測(cè)方法，有利于更全面地分析奶制品的物種來(lái)源，實(shí)現(xiàn)大批量奶制品的快速鑒別。本研究基于靶向蛋白質(zhì)組學(xué)和液相色譜-質(zhì)譜法相結(jié)合的鑒別方法，建立了奶牛、水牛、牦牛、山羊、綿羊、馬、驢和駱駝8個(gè)物種奶的物種鑒別方法。本方法利用胰蛋白酶酶解技術(shù)和同位素二甲基衍生化技術(shù)作為輔助，實(shí)現(xiàn)了對(duì)物種的特征多肽的檢測(cè)，并鑒別了模擬樣品與實(shí)際奶制品中乳蛋白的物種來(lái)源。

　　1實(shí)驗(yàn)部分

　　1.1儀器與試劑

　　Q-Exactive超高效液相色譜組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀(UHPLC-OrbitrapMS，美國(guó)ThermoFisher公司);TQ-XS超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(UHPLC-TQMS，美國(guó)Waters公司);CascadaⅠ型超純水儀(美國(guó)Pall公司)二硫蘇糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(IAA)、氰基硼氫化鈉(HPLC級(jí)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司);甲醛、同位素甲醛(13CD2O)(HPLC級(jí)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司);NaHCO3、氨水(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);乙腈(ACN)、甲酸(FA)(HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司);測(cè)序級(jí)重組胰蛋白酶(Trypsin，上海雅心生物科技有限公司)31個(gè)純鮮奶樣(奶牛奶5個(gè)、水牛奶3個(gè)、牦牛奶5個(gè)、山羊奶5個(gè)、綿羊奶2個(gè)、驢奶和馬奶各3個(gè)、駱駝奶5個(gè))均來(lái)自當(dāng)?shù)厝槠菲髽I(yè)。采樣后，立即在-20℃冷凍儲(chǔ)存。16個(gè)市售奶制品樣品(水牛鮮奶2個(gè)、牦牛鮮奶1個(gè)、牦牛高溫滅菌奶2個(gè)、牦牛乳粉1個(gè)、山羊鮮奶2個(gè)、山羊乳粉2個(gè)、綿羊乳粉2個(gè)、驢鮮奶1個(gè)、驢乳粉1個(gè)和駱駝鮮奶2個(gè))通過(guò)網(wǎng)購(gòu)或當(dāng)?shù)夭少?gòu)獲得。

　　1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與模擬混合樣品的配制

　　8個(gè)物種奶的標(biāo)準(zhǔn)樣品由各物種鮮奶與超純水混合配制，其混合比例(V/V)依次為0∶100、5∶95、10∶90、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20和100∶0。模擬混合樣品由奶牛奶與其它7個(gè)物種奶分別混合獲得，其混合比例(V/V)為0∶100，5∶95、10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、95∶5、100∶0。屬內(nèi)物種間混合樣品，由牦牛奶與水牛奶，山羊奶與綿羊奶及驢奶與馬奶兩兩混合獲得，其混合比例(V/V)為0∶100、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20、100∶0。

　　1.3樣品前處理

　　1.3.1酶解準(zhǔn)確稱取樣品(乳粉樣品0.05g，奶樣0.5mL)，加入超純水充分溶解，定容至10mL。移取稀釋后的樣品溶液100μL于2mL離心管中，加入100μL超純水、500μL100mmol/LNaHCO3溶液、100μL100mmol/LDTT溶液，混勻，于70℃恒溫反應(yīng)30min;冷卻至室溫，加入100μL300mmol/LIAA溶液，避光靜置30min;加入100μL100μg/mLTrypsin，混勻，于37℃恒溫酶解4h，冷卻至室溫，15000r/min離心5min，待二甲基化。

　　1.3.2二甲基化反應(yīng)從離心后樣品溶液中吸取100μL上清液，加入4μL1%(V/V)甲醛溶液(同位素內(nèi)標(biāo)樣品中加入等量同位素甲醛溶液)和4μL0.6mol/L氰基硼氫化鈉溶液，在室溫下反應(yīng)1h。加入16μL1%(V/V)氨水，中止二甲基化反應(yīng)，并加入10μL甲酸中和過(guò)量的氨水，于室溫下靜置至樣品溶液不再產(chǎn)生氣泡。取50μL二甲基化后的樣品溶液與50μL同位素二甲基化的內(nèi)標(biāo)溶液混合，待測(cè)。

　　1.4液相色譜條件色譜柱:ACQUITYUPLCBEH300C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm，30nm);柱溫35℃;進(jìn)樣量:10μL;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:15℃;色譜流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈溶液，流速:0.3mL/min。梯度洗脫:0～1min，2%B;1～4.5min，2%～80%B;4.5～5.5min，80%～100%B;5.5～6.5min，100%B;6.5～7min，100%～2%B;7～9min，2%B。

　　1.5Orbitrap質(zhì)譜條件鞘氣流量:40L/min;輔助氣流量:10L/min;離子源電壓:3.5kV;毛細(xì)管溫度:320℃;輔助氣溫度:350℃。質(zhì)譜檢測(cè)掃描范圍:m/z200～3000;分辨率:70000;AGCtarget3e6;最大進(jìn)樣時(shí)間:100ms。dd-MS2參數(shù)為分辨率17500，AGCtarget1e5，最大進(jìn)樣時(shí)間為50ms，循環(huán)計(jì)數(shù)為10，質(zhì)量間隔窗口為m/z4.0。蛋白質(zhì)分析軟件Proteomediscoverer2.1(美國(guó)Thermo-Fisher公司)參數(shù)為酶切模式Trypsin;漏切位點(diǎn)0～2;質(zhì)量偏移為10ppm(10-6);氨基酸固定修飾:半胱氨酸的甲�；�，多肽N端以及賴氨酸的二甲基化;氨基酸的動(dòng)態(tài)修飾:磷酸化和氧化。

　　1.6三重四極桿質(zhì)譜條件毛細(xì)管電壓:3.0kV;離子源溫度:150℃;脫溶劑溫度:350℃;脫溶劑氣流量:800L/min;錐孔反吹氣流量:150L/h;質(zhì)譜碰撞氣流量0.12mL/min。所得數(shù)據(jù)由Masslynx軟件采集(美國(guó)Waters公司)。

　　2結(jié)果與討論

　　2.1理論特征多肽的序列分析

　　常見的乳蛋白主要分為乳清蛋白和酪蛋白兩大類，在乳清蛋白中，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是主要的組成部分;在酪蛋白中，αs1酪蛋白、αs2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白是主要的組成部分。這6種蛋白的含量常占乳蛋白組成的90%以上，是各物種最具代表性的乳蛋白。故本研究主要針對(duì)8個(gè)物種奶中的上述6個(gè)乳蛋白進(jìn)行分析，其中，僅駱駝奶不含有β-乳球蛋白。

　　為了確定各乳蛋白中具有物種代表性的多肽，首先對(duì)乳蛋白的氨基酸序列進(jìn)行了理論分析。通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，獲得共計(jì)47種乳蛋白的氨基酸序列信息。通過(guò)模擬Trypsin酶切，對(duì)相應(yīng)多肽進(jìn)行特異性篩選[21，24]。以奶牛奶為例，對(duì)奶牛與其它7個(gè)物種乳蛋白的氨基酸序列進(jìn)行了比較，在奶牛奶的6種乳蛋白中，篩選出6條在其它物種乳蛋白中無(wú)重復(fù)氨基酸序列的理論特征多肽。

　　通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)網(wǎng)站提供的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的局部序列比對(duì)工具(BLAST)對(duì)這6條多肽在已知的8個(gè)物種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有其它蛋白質(zhì)包含與這6條多肽一致的氨基酸序列，證明這些多肽具有物種特異性。通過(guò)相同方式，在其余7個(gè)物種乳蛋白中篩選出總計(jì)110條理論特征多肽，詳見電子版文后支持信息表S1～S7。

　　2.2理論特征多肽的靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜檢測(cè)

　　為確認(rèn)理論特征多肽是否存在于實(shí)際奶制品中，使用UHPLC-OrbitrapMS對(duì)按照1.3節(jié)所述步驟處理后的8個(gè)物種奶樣中的多肽進(jìn)行分析，并使用數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)監(jiān)測(cè)模式(ddms2)對(duì)多肽的二級(jí)質(zhì)譜信息進(jìn)行采集。采集到的數(shù)據(jù)通過(guò)軟件Proteomediscoverer2.1進(jìn)行處理，以Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)信息作為參考，對(duì)8個(gè)物種奶樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選匹配。

　　2.3特征多肽的篩選

　　2.3.1特征多肽的二甲基衍生化

　　依據(jù)各候選特征多肽的OrbitrapMS數(shù)據(jù)，利用UHPLC-TQMS建立相應(yīng)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)檢測(cè)方法。奶牛奶、水牛奶和牦牛奶候選特征多肽的MRM參數(shù)，其余物種的特征多肽MRM參數(shù)見電子版文后支持信息表S8～S10。為了克服質(zhì)譜離子化效率及穩(wěn)定性對(duì)候選多肽的影響，采用同位素標(biāo)記法對(duì)候選特征多肽進(jìn)行校正。

　　考慮到本研究包含的目標(biāo)候選多肽數(shù)量較多，常見的合成同位素多肽法所需的時(shí)間與經(jīng)濟(jì)成本過(guò)高，本研究采用同位素二甲基衍生化法[26]對(duì)所研究的目標(biāo)多肽進(jìn)行同位素標(biāo)記。針對(duì)同一種多肽，以其二甲基衍生化產(chǎn)物與同位素二甲基衍生化產(chǎn)物峰面積比值作為其相對(duì)峰面積，實(shí)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)。為確保所有候選多肽都能被完全衍生化，首先考察了各候選多肽的二甲基衍生化效率。在二甲基衍生化與同位素二甲基衍生化處理的樣品中，均未發(fā)現(xiàn)未被衍生化的多肽，表明其衍生化效率高。同時(shí)，二甲基衍生化的多肽與同位素二甲基衍生化的多肽之間不存在干擾。

　　2.3.2特征多肽酶解水平與線性考察

　　在確定MRM參數(shù)以及二甲基衍生化效率之后，本研究考察了候選特征多肽在0～6h(0、0.5、1、2、3、4和6h)內(nèi)的酶解水平，平行實(shí)驗(yàn)3次，比較了各多肽達(dá)到最大酶解程度所需的時(shí)間。如表2所示，奶牛奶、水牛奶、牦牛奶的10條候選多肽酶解程度均可在3h內(nèi)達(dá)到最大，表明多肽酶解效率較高;但水牛奶多肽YNVPQLEIVPNLAEEQLHSMK等4條多肽(表2中標(biāo)記*)在達(dá)到最大酶解水平后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)含量明顯下降，表明其穩(wěn)定性或抗基質(zhì)干擾能力較弱。

　　奶牛、水牛和牦牛3個(gè)物種奶的候選多肽的線性結(jié)果。奶牛與牦牛奶的候選特征多肽均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)r2均大于0.994。在水牛奶的候選多肽中，多肽FQSEEQQQMEDELQDK與多肽FFNDK線性相關(guān)系數(shù)均低于0.95，多肽LSFNPTQLEEQCHV與SCQAQPTTMTR線性相關(guān)系數(shù)大于0.99，具有較好的線性關(guān)系。

　　依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，奶牛奶與牦牛奶中候選多肽符合酶解水平與線性考察的要求，因此確定候選多肽LSFNPTQLEEQCHI(奶牛)與LSFNPTQLEGQCHI(牦牛)即為其對(duì)應(yīng)物種的特征多肽;而在水牛奶中，選擇來(lái)自乳清蛋白的候選多肽LSFNPTQLEEQCHV(水牛)與來(lái)自酪蛋白的特征多肽SCQAQPTTMTRK(水牛)共同作為水牛奶特征多肽。此外，同時(shí)采用兩條多肽可識(shí)別目標(biāo)蛋白，以確定其來(lái)源于水牛酪蛋白，還是來(lái)源于水牛乳清蛋白，在嬰兒配方粉等強(qiáng)化奶制品中可以實(shí)現(xiàn)乳清蛋白與酪蛋白的分別鑒定。同理，在其余5個(gè)物種奶中，共有9條多肽(除驢奶1條以外，其余物種奶均選擇乳清蛋白與酪蛋白中特征多肽各1條)被最終選作對(duì)應(yīng)的特征多肽。

　　2.4模擬混合樣品的檢測(cè)

　　為考察所篩選的13條特征多肽對(duì)各物種奶的分辨能力，采用上述方法對(duì)奶牛奶與其它7個(gè)物種奶的模擬混合樣品進(jìn)行了MRM檢測(cè)，以奶牛奶標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品作為參考，分析各混合樣品中奶牛奶特征多肽的含量，并計(jì)算出奶牛奶的混合比例。同理，以各物種奶標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品作為參考，獲得對(duì)應(yīng)混合樣品中各物種奶的混合比例，并與理論值進(jìn)行比較，結(jié)果見電子版文后支持信息表S11。通過(guò)各物種奶特征多肽計(jì)算的樣品混合比例與理論混合比例基本一致，并且依據(jù)多肽計(jì)算的比例所繪制的濃度曲線線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明各物種奶特征多肽在與奶牛奶混合樣品的鑒別過(guò)程中可保持良好的特異性。

　　3結(jié)論

　　本研究基于靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的分析原理，采用UHPLC-OrbitrapMS與UHPLC-TQMS，建立了奶牛、水牛、牦牛，山羊、綿羊，驢、馬和駱駝8個(gè)不同物種奶的鑒別方法。利用二甲基衍生化實(shí)現(xiàn)對(duì)不同物種來(lái)源的多條多肽的分析比較，最終篩選出13條具有物種特異性的特征多肽，實(shí)現(xiàn)了對(duì)混合樣品及實(shí)際奶制品中乳蛋白物種來(lái)源的鑒別。研究結(jié)果表明，特征多肽分析在多物種乳蛋白鑒別過(guò)程中不僅表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性、特異性，同時(shí)還可滿足高溫滅菌乳或乳粉等加工奶制品的檢測(cè)需求。本研究有望在奶制品行業(yè)的品質(zhì)監(jiān)管中發(fā)揮積極作用。

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　　作者：陳雨湉1任一平2王麗麗*1黃忠平*1