摘要：為了解發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中微生物代謝產(chǎn)物的組成和變化規(guī)律，采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，檢測分析發(fā)酵2、4、6、8和10d時培養(yǎng)料的代謝組數(shù)據(jù)。結(jié)果表明：在正離子(POS)模式下，分別在T2vsT1、T3vsT2、T4vsT3和T5vsT4中篩選得到331、145、161和115種差異代謝物;在負(fù)離子(NEG)模式下，分別篩選得到251、159、106和76種差異代謝物。這些差異代謝物主要包括糖類及其衍生物、氨基酸、肽類及其類似物、脂肪酸類、維生素類、苯丙素類和聚酮類物質(zhì)及其他次級代謝產(chǎn)物。此外，在發(fā)酵培養(yǎng)料中還含有植物生長調(diào)節(jié)劑(如吲哚-3-乙酸、茉莉酸和赤霉素)和抑菌物質(zhì)(如綠原酸、抗生素、白藜蘆醇)。該研究可為制備質(zhì)量穩(wěn)定的發(fā)酵培養(yǎng)料和掌握發(fā)酵培養(yǎng)料栽培平菇技術(shù)提供參考。

　　關(guān)鍵詞：平菇;發(fā)酵料;代謝組學(xué);差異代謝物

　　平菇Pleurotusostreatus(Jacq.)P.Kumm.，是世界上栽培最廣泛的食用菌之一[1-3]，也是重要的食藥用真菌[4-5]。平菇的栽培技術(shù)主要有3種：生料栽培、熟料栽培和發(fā)酵料栽培[6]。與生料和熟料栽培相比，發(fā)酵料栽培平菇由于具有低污染、低成本、工藝簡單和經(jīng)濟(jì)效益高的優(yōu)點而在世界范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用[6]。

　　發(fā)酵論文范例：復(fù)合蛋白發(fā)酵酸奶飲料的穩(wěn)定體系研究

　　平菇栽培用發(fā)酵料是以秸稈、玉米芯等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物為主要原料，加入少量的麩皮、石灰等，在微生物的參與下，經(jīng)短期、好氧發(fā)酵而制備的[3]。玉米芯約占玉米產(chǎn)量的21%，是一種產(chǎn)量巨大的農(nóng)副產(chǎn)品，來源廣泛、價廉易得[7]。目前，玉米芯除用于制備糠醛、木糖醇等外，很大一部分被作為農(nóng)業(yè)廢棄物直接燃燒，造成資源浪費和環(huán)境污染。

　　玉米芯組織均勻、硬度適宜、吸水性強(qiáng)，將其堆制發(fā)酵后用于平菇栽培，不僅有助于平菇產(chǎn)量和品質(zhì)的提高，而且可以實現(xiàn)農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的高效生物轉(zhuǎn)化[8]。筆者在前期的研究中發(fā)現(xiàn)：平菇玉米芯發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中，變形菌門Proteobacteria在早期階段(T1)占優(yōu)勢(相對豐度35.67%~44.10%)，在高溫階段(T2，T3)，厚壁菌門Firmicutes成為新的優(yōu)勢門(相對豐度41.50%~48.52%)，而在堆肥后期(T4、T5)，變形菌門重新成為優(yōu)勢門(相對豐度33.55%~36.89%)[9]。這些微生物對發(fā)酵過程中植物秸稈中木質(zhì)纖維素的降解起著至關(guān)重要的作用。

　　Pearson相關(guān)分析表明，發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中的理化性質(zhì)變化與其中微生物菌落的組成變化顯著相關(guān)[9]。微生物能將培養(yǎng)料中復(fù)雜的有機(jī)質(zhì)(纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等)進(jìn)行降解，使其變成簡單、易于利用的低分子物質(zhì);有些特定微生物如Actinobacteria、Thermus和Bacillus還可以產(chǎn)生抗菌、殺蟲的物質(zhì)，這可能是發(fā)酵培養(yǎng)料栽培平菇可以采用開放式接種的原因之一[10]。

　　目前對玉米芯發(fā)酵培養(yǎng)料的研究主要集中在栽培平菇[11-13]和制備過程中發(fā)酵培養(yǎng)料中微生物及其功能的演替方面[3]，而對玉米芯發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中微生物代謝產(chǎn)物的研究還未見報道。代謝組學(xué)(metabolomics)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后出現(xiàn)的新興組學(xué)技術(shù)，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[14]。代謝組學(xué)是從整體角度出發(fā)，運用現(xiàn)代檢測技術(shù)對盡可能多的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測[15]。

　　目前，代謝組學(xué)在真菌領(lǐng)域的應(yīng)用也日益廣泛，為人們提供了一個了解真菌代謝的獨特途徑[14-16]。因此，筆者通過采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析檢測玉米芯發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中發(fā)酵微生物代謝產(chǎn)物的種類和含量，進(jìn)而探討制備過程中主要代謝物的組成及變化規(guī)律，為穩(wěn)定發(fā)酵料質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。

　　1材料與方法

　　1.1發(fā)酵料發(fā)酵料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為：玉米芯84%，麩皮10%，石灰5%，尿素1%;含水量68%。

　　1.2試劑與儀器玉米芯(中值粒徑0.5cm)、麩皮、石灰、尿素均購自本地農(nóng)貿(mào)市場;LC-MC級甲醇、水、甲酸、醋酸銨(CNWTechnologiesGmbH,Germany)。BSA124S-CW天平(Sartorius);1290UHPLC色譜儀(AgilentTechnologiesInc.,USA);TripleTOF6600質(zhì)譜儀(ABSciexPte.Ltd.,USA);D3024R高速冷凍離心機(jī)(Scilogex,USA);JXFSTPRP-24全自動樣品快速研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司);GWB-1普析純水儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);KS-7200DV超聲儀(昆山潔力美超聲儀器有限公司)。

　　1.3發(fā)酵料制備和取樣

　　該試驗于2020年3—4月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗示范基地進(jìn)行。根據(jù)以往的報道[12]，制備平菇發(fā)酵料。發(fā)酵料制備試驗包含6個重復(fù)，每個重復(fù)包含250kg原料(干質(zhì)量)。

　　玉米芯原料按照質(zhì)量比為1∶2.4~2.5的料水配制，機(jī)械攪拌30min，堆置1d后進(jìn)行建堆，堆高60cm，寬1.5m左右，長度不限。此時培養(yǎng)料的含水量約為70%，pH值9~10，顏色為金黃色。用直徑5cm的木棒在料堆上部、橫豎間隔30~40cm打通風(fēng)孔，木棒要求插到料堆底部。發(fā)酵周期為10d，第3天溫度升至45~55℃開始翻堆，培養(yǎng)料溫度升至70℃以上每隔1d翻堆1次，共4次，直至發(fā)酵完成。分別在發(fā)酵2、4、6、8、10d時采集樣品，標(biāo)注為T1、T2、T3、T4、T5。為了獲得具有代表性的樣本，分別從發(fā)酵料堆的9個不同位置采集子樣本，然后將子樣本進(jìn)行混合得到一個樣本[3]。

　　1.4代謝組學(xué)分析

　　取發(fā)酵培養(yǎng)料樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析，按北京諾禾致源科技股份有限公司非靶向代謝組學(xué)分析方法提取代謝物、超高效液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(ultraperformanceliquidchromatography-quadrupoletime-of-flightmassspectrometry，UPLC-QTOF-MS)分析代謝物，采用ProteoWizard和XCMS軟件對代謝組下機(jī)數(shù)據(jù)(.raw)實施峰的識別、提取、積分及對齊等處理。

　　利用mzCloud(https://www.mzcloud.org/)、mzVault和Masslist數(shù)據(jù)庫進(jìn)行峰比對，同時采用blank樣本去除背景離子，進(jìn)一步進(jìn)行峰面積的批次歸一化和自適換算標(biāo)準(zhǔn)化處理，從而得到代謝物的鑒定和定量結(jié)果。采用SIMCA軟件(version14.1，sartoriusstedimdataanalyticsAB，Umea，Sweden)對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(principalcomponentanalysis，PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonalpartialleastsquaresdiscriminantanalysis，OPLS-DA)[17]。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1發(fā)酵培養(yǎng)料代謝物的主成分分析

　　基于非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對發(fā)酵2、4、6、8、10d的培養(yǎng)料樣品進(jìn)行檢測，分別在正離子(POS)和負(fù)離子(NEG)模式下鑒定得到1208和472種代謝物，對所有代謝物進(jìn)行PCA分析。培養(yǎng)料樣品中的代謝物分成5組，組內(nèi)樣本均集聚良好，這說明5組培養(yǎng)料樣品的微生物代謝物具有顯著的差異。為更充分地提取不同發(fā)酵時期培養(yǎng)料樣品中代謝物的差異信息，分析篩選不同組間的差異代謝物，因此進(jìn)一步采用有監(jiān)督的OPLS‐DA分析數(shù)據(jù)。

　　T2vsT1、T3vsT2、T4vsT3、T5vsT4中的樣品點均分布在不同的區(qū)域且明顯分為兩個簇，實現(xiàn)了兩組樣品間的完全分離。結(jié)果表明，不同發(fā)酵時期培養(yǎng)料樣品中微生物代謝產(chǎn)物在種類和(或)含量上存在明顯差異。

　　POS模式下T2vsT1、T3vsT2、T4vsT3、T5vsT4的OPLS‐DA模型質(zhì)量參數(shù)分別為：R2Y(cum)=1.00，Q2Y(cum)=0.99;R2Y(cum)=1.00，Q2Y(cum)=0.99;R2Y(cum)=1.00，R2Y(cum)=0.98;R2Y(cum)=1.00，Q2Y(cum)=0.95。NEG模式下分別為：R2Y(cum)=1.00，Q2Y(cum)=0.99;R2Y(cum)=1.00，Q2Y(cum)=0.99;R2Y(cum)=1.00，Q2Y(cum)=0.98;R2Y(cum)=0.99，Q2Y(cum)=0.97。R2Y和Q2Y均大于0.5，這表明依據(jù)兩種采集模式所得數(shù)據(jù)建立的OPLS‐DA模型都具有較好的擬合性和較強(qiáng)的預(yù)測能力。

　　3討論與結(jié)論

　　筆者在本研究中采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對不同發(fā)酵時期的平菇培養(yǎng)料中的代謝物進(jìn)行分析，差異代謝物總數(shù)最多的是T2vsT1，其次是T3vsT2，最少的是T5vsT4。這與筆者前期對5個發(fā)酵時期培養(yǎng)料中微生物的代謝功能差異的分析結(jié)果基本一致[3]。發(fā)酵培養(yǎng)料中的漆酶、木聚糖酶和蛋白酶活性峰值出現(xiàn)在發(fā)酵降溫階段[3]，表明木質(zhì)纖維素和蛋白質(zhì)的分解主要是在發(fā)酵后期發(fā)生，因此T2vsT1和T3vsT2時糖類及其衍生物和氨基酸、肽類及其類似物相對含量顯著下降。

　　這可能是因為發(fā)酵前期(T2和T3)微生物代謝旺盛，需要大量的糖類和氨基酸以滿足其生長和繁殖所需，導(dǎo)致T2和T3時發(fā)酵料中的糖類和氨基酸含量均較發(fā)酵前一時期(T1和T2)有所下降;到發(fā)酵后期(T4和T5)，木質(zhì)纖維素降解酶和蛋白酶活性大幅升高， 大量木質(zhì)纖維素和蛋白質(zhì)被降解生成低分子糖、肽類和氨基酸，因而其含量均比發(fā)酵前一時期(T3和T4)有所增加。發(fā)酵料中的Actinobacteria、Thermus和Bacillus屬的微生物具有產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的能力[18]。

　　發(fā)酵料中的抑菌物質(zhì)含量隨發(fā)酵進(jìn)程逐漸增加，為后期平菇開放式接種創(chuàng)造了良好的條件。這與筆者前期研究結(jié)果一致，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵料浸提液對青霉和木霉的抑制作用也隨之增強(qiáng)[19]。維生素可以作為輔酶因子參與多種重要的生化反應(yīng)，是生物不可或缺的生長因子。不同微生物之間可能憑借維生素的種間傳遞而建立相互作用關(guān)系，對微生物群落結(jié)構(gòu)形成和功能發(fā)揮起著重要作用[20]。與抑菌物質(zhì)含量變化趨勢相似，發(fā)酵培養(yǎng)料中的維生素含量也較發(fā)酵前一時期有所增加。

　　在自然界中，木質(zhì)纖維素可以被微生物分解成低分子的芳香族化合物，如水楊酸、阿魏酸等[21-22]。與T1相比，T2時期發(fā)酵培養(yǎng)料中的苯丙素類和聚酮類物質(zhì)相對含量明顯下降，這可能是因為微生物優(yōu)先利用易降解的低分子物質(zhì)，而T3、T4和T5時的苯丙素類和聚酮類物質(zhì)相對含量分別比發(fā)酵前一時期有所增加，隨著發(fā)酵的繼續(xù)，玉米芯中易于降解的物質(zhì)被利用完，微生物開始降解復(fù)雜高分子物質(zhì)如木質(zhì)素和酚類物質(zhì)，進(jìn)而生成了較多的低分子苯丙素類和聚酮類物質(zhì)。

　　研究表明，植物生長調(diào)節(jié)劑如吲哚乙酸、赤霉素、脫落酸可以促進(jìn)平菇菌絲的生長[23-24]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，T5時期發(fā)酵培養(yǎng)料浸提液對平菇菌絲生長促進(jìn)作用最為明顯，尤其是體積分?jǐn)?shù)為80%時，平菇菌絲生長速度和生物量分別比對照增加0.53cm·d-1和0.179g[25]。這可能與發(fā)酵培養(yǎng)料中的植物生長調(diào)節(jié)劑如脫落酸、吲哚-3-乙酸和赤霉素的相對含量均在發(fā)酵后期達(dá)到最高值有關(guān)。綜上所述，不同發(fā)酵時期的玉米芯培養(yǎng)料中的微生物代謝產(chǎn)物具有明顯的差異，并且其中含有豐富的抑菌物質(zhì)和植物生長調(diào)節(jié)劑。該研究為平菇栽培獲得穩(wěn)定的發(fā)酵料質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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　　作者：劉皓皓1，劉芹2，崔筱2，靳榮線3，高玉千1，李亞楠1，孔維麗2，裴瑞杰4，邱立友1