摘要：栽培大豆起源于我國黃淮海地區(qū)，我國具有悠久的大豆種植歷史和豐富的大豆遺傳資源。然而，近年來我國大豆進(jìn)口依賴度極高，嚴(yán)重威脅到我國的糧食安全，因此培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的大豆品種至關(guān)重要。株高，籽粒大小等是影響大豆產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀，因此，挖掘調(diào)控這些農(nóng)藝性狀的基因，及解析其分子機(jī)制具有重要意義。FRUITFULL(FUL)基因?qū)儆贛ADS-box類轉(zhuǎn)錄因子，在植物的開花，生長發(fā)育，果實成熟等方面起著重要的作用。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在大豆中含有6個FUL基因，它們均具有一個保守的MADS-box和一個較為保守的K-box結(jié)構(gòu)域，并主要在豆莢中表達(dá)，說明該基因家族可能能夠調(diào)控大豆種子相關(guān)性狀。其中，只有GmFUL3b基因在葉片中高度表達(dá)，說明該基因在進(jìn)化過程中功能可能產(chǎn)生了分化。此外，還發(fā)現(xiàn)6個FUL之間的進(jìn)化規(guī)律不同。為進(jìn)一步確定其生物學(xué)功能，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，分別構(gòu)建6個FUL基因的敲除突變體載體，轉(zhuǎn)化大豆毛根進(jìn)行靶點驗證，并成功鑒定出其中5個基因的有效靶點，為進(jìn)一步獲得穩(wěn)定的大豆突變體材料及解析GmFULs家族基因的功能提供了重要的理論基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞：大豆;FUL基因;生物信息學(xué)分析;CRISPR/Cas9技術(shù)

　　大豆(Glycinemax)是世界上重要的糧食兼經(jīng)濟(jì)作物之一，也是人類主要的植物蛋白來源[1]。大豆具有非常高的營養(yǎng)價值[2]，例如，大豆蛋白中所含人體必需氨基酸的含量與肉類相近，同時大豆油脂中的人類必需脂肪酸也較為豐富。栽培大豆起源于我國黃淮海地區(qū)[3]，目前主要種植在西北地區(qū)、東北地區(qū)、黃淮海地區(qū)和南方地區(qū)[4-5]。我國生產(chǎn)的大豆僅能滿足國內(nèi)食品加工消費需求，飼料使用的大豆仍然需要依賴大量的進(jìn)口來維持，從2015年至今對外依存度始終超過80%，年均進(jìn)口量超過8000萬噸左右。因此，提高大豆產(chǎn)量具有重大的戰(zhàn)略意義[6]。通過分子育種技術(shù)能夠更加有目的性，更加快捷地培育新品種，因此找到控制大豆生長發(fā)育相關(guān)基因，并理清這些基因之間的調(diào)控機(jī)制是培育高產(chǎn)量大豆品種的關(guān)鍵。

　　農(nóng)作物論文范例：重茬大豆高產(chǎn)栽培技術(shù)

　　MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子家族在植物的生長發(fā)育與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的作用[7]。MADS-box家族蛋白具有一個由56~58個氨基酸組成的高度保守區(qū)域——MADS-box，和一個約由70個中度保守結(jié)構(gòu)域氨基酸組成的K-box。MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子一般能夠形成同源或異源二聚體，例如，擬南芥中MADS-box家族的AGAMOUS(AG)、APETALA1(AP1)、AGAMOUS-LIKE(AGL)和NMHC5的蛋白能夠與自身形成同源二聚體[8]，而APETALA3(AP3)/PISTILLATA(PI)、NoduleMADS-boxHomologue7(NMH7)/NGL9能夠形成異源二聚體[9-10]，從而能夠結(jié)合特定的DNA序列調(diào)控基因的表達(dá)。

　　在花器官發(fā)育的ABCDE模型中[11]，絕大部分控制花發(fā)育的基因都屬于MADS-box家族，例如，AP1、CAULIFLOWER(CAL)和FRUITFULL(FUL)同屬于MADS-box的AP1/FUL亞家族的A類基因，且三者在控制花分生組織特異性發(fā)育的功能方面具有冗余性[12]。其中，F(xiàn)UL基因在控制植物的生長發(fā)育具有非常重要的作用，且在不同物種中的功能上存在差異。例如，在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中只含有1個FUL基因，F(xiàn)UL不僅參與控制開花時間，而且對于維持花序分生組織繼續(xù)發(fā)育成花的過程具有調(diào)控作用，并能夠抑制其逆轉(zhuǎn)為營養(yǎng)分生組織[13]。

　　此外，F(xiàn)UL基因還參與調(diào)控擬南芥葉片的發(fā)育[14]，角果的伸長[15]以及裂片細(xì)胞的發(fā)育[16]。在番茄(Solanumlycopersicum)中有3個FUL的同源基因，分別為TM4[17]，SLMBP7[18]和SLMBP20[19]。其中，TM4與擬南芥FUL同源性最高，它能夠和SEPALLATA-LIKE(SEP-like)編碼的蛋白RIPENINGINHIBITOR(RIN)相互作用，同時也能和SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1-LIKE(SOC1-like)編碼的蛋白TM3相互作用，協(xié)同控制番茄開花時間和果實成熟[20]。FUL基因在不同植物組織中的表達(dá)也存在著差異，例如在水稻(Oryzasativa)中存在2個FUL同源的基因，分別為OsMADS18[21]和OsMADS14[22]。OsMADS18在水稻所有的組織中均有表達(dá)，OsMADS14只在花發(fā)育的特定階段表達(dá)[23]。在陸地棉(Gossypiumhirsutum)中，F(xiàn)UL-like基因GhMADS22在發(fā)育中的莖尖、苞片和萼片中高度表達(dá)，可以促進(jìn)開花和延緩衰老[24]。

　　黃瓜(Cucumissativus)中有兩個FUL的旁系同源基因Csa004592和Csa004120。它們主要在黃瓜的花與初期的果實中表達(dá)，可能通過細(xì)胞周期相關(guān)基因來控制細(xì)胞分裂與細(xì)胞大小，從而調(diào)控黃瓜果實的長度[25]。盡管FUL基因?qū)χ参锏纳�長發(fā)育至關(guān)重要，但在大豆中的FUL基因的功能尚未見報道。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物突變體的創(chuàng)制，對深入解析基因的功能具有重要的作用。目前，在擬南芥[26]、煙草[27]、水稻[28]、小麥[29]、大豆[30-31]、玉米[32]、番茄[33]等多種模式植物及農(nóng)作物中成功實現(xiàn)了基因定向敲除。

　　例如，Cheng等[30]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功創(chuàng)制了大豆LATEELONGATEDHYPOCOTYL(LHY)四突突變體植株，發(fā)現(xiàn)純合四突變體植株導(dǎo)致株高降低，節(jié)間距縮短。Chen等[31]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建了大豆GmAP1純合四突變體，并發(fā)現(xiàn)GmAP1對大豆開花與株高具有重要的影響。本研究利用蛋白質(zhì)同源比對和進(jìn)化樹分析的方法鑒定出大豆中含有6個GmFUL基因，參照Cao等[34]將其命名為GmFUL1a、GmFUL1b、GmFUL2a、GmFUL2b、GmFUL3a、GmFUL3b，并通過生物信息學(xué)分析，對該家族基因的功能進(jìn)行了初步分析，同時，利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了GmFUL家族基因的敲除載體，為創(chuàng)制穩(wěn)定大豆GmFUL家族基因的多突變體及進(jìn)一步研究該基因家族在大豆中的生物學(xué)功能提供了理論基礎(chǔ)。

　　1材料與方法

　　1.1試驗材料

　　植物材料為大豆品種Williams82(W82)、發(fā)根農(nóng)桿菌菌株為K599，由廣州大學(xué)分子遺傳與進(jìn)化創(chuàng)新研究中心實驗室保存。CRISPR/Cas9載體構(gòu)建質(zhì)粒AtU3d、AtU3b、AtU6-1、AtU6-29、CRISPR/Cas9，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光實驗室提供。DH5α感受態(tài)細(xì)胞購買自深圳康體生命科技有限公司，BsaI酶、T4連接酶購買自NewEnglandBiolabs公司，DNA提取試劑盒購買自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，高純度小量質(zhì)粒試劑盒購買自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

　　1.2同源比對及進(jìn)化樹分析

　　在Phytozome12數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/)中，搜索擬南芥AtFUL基因在大豆中的同源基因，并獲取同源基因的氨基酸序列。在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用BLAST比對與CD-Search功能，獲取與大豆中FUL家族基因同源性較高的其他豆科基因序列及其結(jié)構(gòu)域相關(guān)信息。利用DNAMAN軟件(Highlighthomologylevel設(shè)為大于50%)，對FUL蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源比對。利用NCBI數(shù)據(jù)庫查詢各個同源基因的UTR和CDS以及其蛋白序列的結(jié)構(gòu)域，最后利用MEGA_X軟件中Neighbor-Joiningtree法(Bootstrap值設(shè)為1000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

　　1.3共線性化分析

　　從Phytozome12數(shù)據(jù)庫上下載擬南芥品種ArabidopsisthalianaTAIR10與大豆品種W82的基因組序列，利用TBtools[35]軟件對這兩個物種進(jìn)行共線性化分析，標(biāo)注出AtFUL基因與大豆GmFUL1a、GmFUL1b、GmFUL2a、GmFUL2b、GmFUL3a、GmFUL3b基因之間的聯(lián)系。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1進(jìn)化樹與同源比對

　　在Phytozome12數(shù)據(jù)庫中，搜索并下載與擬南芥生物鐘基因AtFUL(AT5G60910)同源的大豆基因序列，發(fā)現(xiàn)在大豆中存在6個FUL基因，分別命名為GmFUL1a(Glyma.04G159300.1)、GmFUL1b(Glyma.06G205800)、GmFUL2a(Glyma.05G018800.2)、GmFUL2b(Glyma.17G081200.1)、GmFUL3a(Glyma.08G250800.1)、GmFUL3b(Glyma.18G273600.1)。為了進(jìn)一步分析大豆中的FUL基因家族蛋白的功能是否具有保守性，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索并下載與AtFUL基因同源的其他豆科植物的氨基酸序列。

　　利用DNAMAN軟件與MEGA軟件，將6個FUL與4個豆科植物，分別為菜豆(Phaseolusvulgaris，XM_007138315.1)、非洲相思子(Abrusprecatorius，XP_027339183.1)、豇豆(Vignaunguiculata，XP_027942348.1)、木豆(Cajanuscajan，XP_020234496.1)的氨基酸序列進(jìn)行同源比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果表明，在不同的豆科植物中，F(xiàn)UL蛋白均存在2個保守結(jié)構(gòu)域：MADS-box結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域。其中MADS-box結(jié)構(gòu)域位于1~77位氨基酸，保守率達(dá)92.89%。K-box結(jié)構(gòu)域位于88~174位氨基酸，保守率達(dá)82.65%。

　　從系統(tǒng)進(jìn)化樹中可以看出，GmFUL1a和GmFUL1b聚類在一個分支中，且與豆科植物聚類在一起，說明GmFUL1a/1b編碼的蛋白可能是豆科作物中比較保守的蛋白，而擬南芥AtFUL與GmFUL2a/2b親緣關(guān)系較近，說明GmFUL2a/2b可能與AtFUL的生物學(xué)功能較為相似，GmFUL3a和GmFUL3b聚類在一個分支中，且并未與其他FUL蛋白聚類在一起，說明GmFUL3a和GmFUL3b編碼的蛋白可能與其他的FUL蛋白功能不同。用MEME網(wǎng)址對該11個蛋白進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)11個FUL基因可分為2大類，其中GmFUL2a/b、GmFUL3a/b與AtFUL被歸為為一類，GmFUL1a/b與菜豆、豇豆、木豆的FUL基因被歸為一類。

　　3討論

　　在MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族中，一般存在兩個結(jié)構(gòu)域，MADS-box結(jié)構(gòu)域能夠與特異的DNA序列結(jié)合，并調(diào)控下游基因的表達(dá)。K-box主要參與蛋白二聚體和多聚體的特異性結(jié)合。C末端是序列和長度最具變化的結(jié)構(gòu)域，主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄激活和參與蛋白多聚體復(fù)合物形成，這3個關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域在維持轉(zhuǎn)錄因子活性、發(fā)揮正常功能起重要作用[39]。大豆GmFULs蛋白屬于MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。

　　與其他植物的FUL同源蛋白相比，大豆GmFULs蛋白在MADS-box與K-box結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成與序列長度上都十分保守，但GmFUL3a/b在C末端的氨基酸序列具有較大差異，推測GmFULs在功能上會呈現(xiàn)一定的保守性，同時GmFUL3a/b與GmFUL1a/b、GmFUL2a/b可能會呈現(xiàn)一定的功能分化。在被子植物系統(tǒng)發(fā)育過程中，單子葉植物和基部被子植物的MADS-box基因只有FUL-like進(jìn)化支，伴隨核心真雙子葉植物的起源與演化而產(chǎn)生了序列重復(fù)和功能分化成euAP1、euFUL和FUL-like3個分支[40]。而真雙子葉植物euFUL型基因是由祖先的FUL-like基因通過1次主要的基因重復(fù)后產(chǎn)生的[41]。

　　在大豆與擬南芥、大豆自身的共線性分析中表明，GmFUL1b、GmFUL2b、GmFUL3a可能來自于擬南芥的FUL基因，而GmFUL1a、GmFUL2a、GmFUL3b可能通過自身FUL基因發(fā)生的一次基因重復(fù)事件而產(chǎn)生。植物中MADS-box基因不同的表達(dá)模式與其功能有明顯的相關(guān)性。例如，豆科植物苜蓿(Medicagotruncatula)中有3個FUL-like型基因，其中MtFULa和MtFULb在生長發(fā)育階段均有表達(dá)，但在開花前表達(dá)量最高，主要參與促進(jìn)植物開花;而MtFULc在開花后表達(dá)量最高，主要參與促進(jìn)花的發(fā)育[42]。

　　禾本科植物小麥(Triticumaestivum)具有3個FUL同源基因，分別是WFUL1、WFUL2和WFUL3，它們之間也存在著功能分化。WFUL1在葉片中表達(dá)，WFUL2調(diào)控花分生組織特性決定、外稃和內(nèi)稃的發(fā)育，WFUL3則參與調(diào)控果實的發(fā)育[43]。而油菜(Brassicanapus)的FUL-like基因則具有參與調(diào)控長角果開裂的功能[44]。不同植物中的FUL-like基因可能由于氨基酸序列或基因結(jié)構(gòu)的差異，導(dǎo)致表達(dá)模式產(chǎn)生差異，并主要參與其表達(dá)量最高的組織內(nèi)的發(fā)育與調(diào)控。

　　我們的研究中發(fā)現(xiàn)，GmFUL1a/b、GmFUL2a/b、GmFUL3a的組織特異表達(dá)較為相似，主要在花器官和豆莢的表達(dá)較高，而GmFUL3b與其他的GmFULs基因不同，它在葉片的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其在花器官和豆莢中的表達(dá)量。推測GmFUL1a/b、GmFUL2a/b、GmFUL3a這五個基因在果實發(fā)育的過程中，可能起著重要的作用。而GmFUL3b可能在調(diào)控開花等途徑中具有重要功能。

　　通過對FUL家族基因的深入生物信息學(xué)分析后，發(fā)現(xiàn)盡管不同的FUL之間在氨基酸序列及基因結(jié)構(gòu)中較為相似，但其進(jìn)化規(guī)律及表達(dá)模式并不相同，因此推測它們之間可能在功能上存在差異，為了更加深入解析不同F(xiàn)UL之間的功能差異，在今后的研究中將進(jìn)一步獲得不同F(xiàn)UL基因的單突變體，并觀察其農(nóng)藝性狀，為應(yīng)用到大豆育種中，提供重要的理論依據(jù)。

　　目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功在各種重要作物中實現(xiàn)了基因編輯，如擬南芥、水稻、玉米及大豆等[45]。盡管CRISPR/Cas9技術(shù)較傳統(tǒng)方法更加高效便捷，但是在大豆的應(yīng)用中仍然會出現(xiàn)編輯效率較低的情況。因此在構(gòu)建Cas9載體時，需要設(shè)計兩個或兩個以上的敲除靶點，再通過發(fā)根轉(zhuǎn)化實驗對靶點效率進(jìn)行驗證檢測，確保大豆的編輯效率。

　　本研究成功利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建用于誘導(dǎo)大豆GmFULs突變的Cas9載體，同時結(jié)合根毛轉(zhuǎn)化系統(tǒng)與CRISPR/Cas9技術(shù)，驗證了3個靶點GmFUL1T1、GmFUL2T1、GmFUL3T1能夠有效編輯5個基因(GmFUL1a/b、GmFUL2a/b、GmFUL3a)，提高了檢測靶點的編輯效率，為挑選編輯效率高且特異性好的靶點再進(jìn)行大豆全株轉(zhuǎn)化節(jié)省了大量時間。而GmFUL3b基因未被靶點GmFUL3T2、GmFUL3T3成功編輯，證明設(shè)計的這兩個敲除靶點脫靶率較高，需要重新設(shè)計GmFUL3b基因的特異性靶點并進(jìn)一步進(jìn)行靶點效率的驗證。

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　　作者：黎永力，杜浩，李泰，甘卓然，侯智紅，董利東，劉寶輝，程群