摘要鐵觀音是高香茶樹品種的選育親本骨干，具有品種獨(dú)特的“觀音韻”，其鮮葉加工成烏龍茶，香氣馥郁持久;萜類合成酶(TPS)是茶樹萜類化合物合成過程中的關(guān)鍵酶，在茶葉香氣的形成中起到關(guān)鍵作用。為探究茶樹TPS基因家族的潛在功能，利用生物信息學(xué)方法及熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)茶樹TPS基因家族進(jìn)行了鑒定及表達(dá)分析。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，從茶樹鐵觀音基因組中鑒定出48條TPS基因，分別命名為CsTPS1-CsTPS48，均含有N末端結(jié)構(gòu)域和C端金屬離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，CsTPS基因家族分為5個(gè)亞家族，為TPS-a、TPS-b、TPS-g、TPS-c和TPS-e/f。相同亞家族的CsTPS基因外顯子-內(nèi)含子數(shù)目基本一致。上游啟動(dòng)子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)大量與植物發(fā)育、激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，CsTPS基因在茶樹特定發(fā)育時(shí)期發(fā)揮重要作用。熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CsTPS3、CsTPS23、CsTPS25、CsTPS29和CsTPS30在MeJA處理下的表達(dá)量顯著上調(diào);CsTPS3在GA處理下的表達(dá)量顯著上調(diào);CsTPS29和CsTPS30在低溫和干旱處理下表達(dá)量顯著上升。綜上所述，CsTPS基因在茶葉香氣的形成中發(fā)揮重要作用，并且與茶樹生長(zhǎng)發(fā)育、激素和脅迫響應(yīng)緊密相關(guān);結(jié)果可為進(jìn)一步探究茶樹TPS基因家族的功能及在茶葉香氣形成中的作用提供參考。

　　關(guān)鍵詞茶樹;萜類合成酶;系統(tǒng)進(jìn)化;脅迫;表達(dá)分析

　　萜類化合物是植物重要的次生代謝物，具有揮發(fā)性和芳香味，賦予植物特殊的香氣。同時(shí)對(duì)傳粉、植物防御、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育等方面產(chǎn)生重要影響[1]。次生代謝物中的萜類化合物有倍半萜(sesquiterpenes，C15)、單萜(monoterpenes，C10)、二萜(diterpenes，C20)、三萜(triterpenes，C30)等。萜類合成酶(terpenesynthase,TPS)在植物萜類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶。TPS家族系統(tǒng)分為7個(gè)亞家族，分別為TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g和TPS-h，其中TPS-a主要合成倍半萜合酶，TPS-b和TPS-g主要合成單萜合酶，TPS-c和TPS-e/f主要合成二萜合酶[2]。

　　此外，Pfam(http://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，TPS有兩個(gè)保守域，分別為N末端結(jié)構(gòu)域(PF01397)和C端金屬離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PF03936)[3]。TPS還具有RRX8W、RXR、DDXXD、NSE/DTE基序等保守的結(jié)構(gòu)特征。萜烯類代謝途徑與茶葉香氣形成密切相關(guān)[4]。特別是揮發(fā)性單萜和倍半萜，單萜中的香葉醇(玫瑰花香)和芳樟醇(木清香和花香)等，以及倍半萜中的橙花叔醇(橙花香)和α-法尼稀(花香)等，在茶葉香氣組分中占據(jù)重要地位[5]。

　　目前，課題組已對(duì)茶樹萜烯類代謝途徑中的相關(guān)基因進(jìn)行了克隆或鑒定等相關(guān)研究，如二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(CsMVD)、甲羥戊酸激酶基因(CsMVK)、單萜合成酶(CsTPS)和萜類合成相關(guān)基因[6-9]。近些年來(lái)，TPS基因已在多個(gè)物種得到鑒定，如擬南芥、番茄、煙草、中粒咖啡、水稻、葡萄、茶樹等[10-16]。鐵觀音(Camelliasinensis„Tie-guanyin‟)因其制茶品質(zhì)優(yōu)異，已成為高香茶樹品種尤其是烏龍茶品種的選育親本骨干，鐵觀音制作的烏龍茶，沖泡后具有天然的蘭花香，香氣馥郁持久，滋味醇厚而甘甜，具有品種獨(dú)特的“觀音韻”。前人通過茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定出80個(gè)CsTPS基因，并參與激素和非生物脅迫應(yīng)答[16]。但有關(guān)茶樹品種鐵觀音TPS基因家族的鑒定及表達(dá)分析還未見報(bào)道。

　　因此，本研究在全基因組水平對(duì)茶樹TPS基因家族進(jìn)行鑒定，利用生物信息學(xué)分析CsTPS基因家族及其在6個(gè)組織中的表達(dá)模式。通過熒光定量PCR檢測(cè)研究CsTPS基因家族在MeJA、GA、低溫和干旱處理過程下的表達(dá)模式，以期為探究茶樹TPS基因家族的功能及在香氣形成中的作用提供參考。

　　1材料與方法

　　1.1材料處理以國(guó)家級(jí)優(yōu)良茶樹品種„鐵觀音‟為試驗(yàn)材料，將環(huán)境溫度下的茶樹分別進(jìn)行低溫(4℃)和干旱(10%PEG-6000溶液)處理。用新鮮配制的100μmol/LMeJA、GA溶液進(jìn)行激素處理。收集MeJA、GA激素處理0(對(duì)照)、6、12、24、48h和4℃、PEG處理0(對(duì)照)、24、48h后的第二葉。每個(gè)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，錫箔紙包裹標(biāo)記，液氮固樣后保存于–80℃冰箱備用。

　　1.2茶樹TPS基因家族成員的鑒定從茶樹鐵觀音基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載蛋白序列，在Pfam(http://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載PF01397和PF03936的隱馬爾可夫模型，利用HMMER軟件搜索茶樹TPS基因家族的候選序列，去除掉只含有一個(gè)結(jié)構(gòu)域的基因，得到同時(shí)含PF01397和PF03936這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的基因序列，并在CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和SMARAT(http://smart.embl-heidelberg.de)網(wǎng)站進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，去除不完整的序列，得到具有全長(zhǎng)蛋白序列的TPS家族成員序列。利用ExPASy(http://www.expasy.org)網(wǎng)站對(duì)茶樹TPS蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。利用WOLFPSORT(https://wolfpsort.hgc.jp)網(wǎng)站進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

　　1.3茶樹TPS基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建和基因結(jié)構(gòu)分析整理擬南芥[10]和番茄[11]中已鑒定出的TPS基因序列，從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)下載對(duì)應(yīng)TPS序列，用軟件MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap值設(shè)置為1000。在GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)網(wǎng)站分析茶樹TPS基因結(jié)構(gòu)[17]。

　　茶樹TPS基因家族序列比對(duì)和保守基序分析用WebLogo(https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)網(wǎng)站和DNAMAN軟件對(duì)CsTPS基因家族的保守序列進(jìn)行分析。利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)網(wǎng)址預(yù)測(cè)保守基序，設(shè)置基序最大數(shù)目為15。使用TBtools軟件[18]可視化茶樹TPS基因在染色體上的位置。

　　茶樹TPS基因啟動(dòng)子順式元件分析用TBtools軟件提取CsTPS基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp的序列，利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)網(wǎng)站進(jìn)行順式元件預(yù)測(cè)分析[19]。

　　茶樹TPS基因組織特異性表達(dá)分析下載鐵觀音茶樹的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，參照前人方法計(jì)算獲得CsTPS基因在芽、幼葉、老葉、莖和根的FPKM值[20]，使用TBtools軟件[18]制作熱圖。

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析通過Primer3plus(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)網(wǎng)站設(shè)計(jì)熒光定量引物。以CsGAPDH作為內(nèi)參基因。參照前人方法合成cDNA作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR模板[21]。熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)：94℃30s;94℃5s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系使用Transstart®TipGreenqPCRsuperMix試劑盒的方法。用2-ΔΔCt算法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平[22]，用prism軟件統(tǒng)計(jì)基因表達(dá)水平，用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1茶樹TPS基因家族的鑒定與序列分析通過鑒定最終得到48條TPS基因家族成員序列，并按照所在染色體位置分別命名為CsTPS1到CsTPS48。CsTPS基因編碼序列為1002-2664bp，編碼氨基酸數(shù)目為333-887。CsTPS家族的分子量在38.93-102.19kDa，等電點(diǎn)為4.6-6.66，CsTPS蛋白的等電點(diǎn)小于7，表明該家族基因?yàn)樗嵝缘鞍住�CsTPS均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)大部分CsTPS定位于細(xì)胞質(zhì)(25個(gè))和葉綠體(17個(gè))，5個(gè)CsTPS定位于細(xì)胞核，其中僅1個(gè)CsTPS定位于線粒體。

　　2.2CsTPS基因家族系統(tǒng)發(fā)育和基因結(jié)構(gòu)分析

　　構(gòu)建茶樹與擬南芥及番茄的系統(tǒng)進(jìn)化樹。分析結(jié)果表明，CsTPS分為5個(gè)亞家族，其中TPS-a有16個(gè)成員，TPS-b有19個(gè)成員，TPS-g、TPS-e/f和TPS-c分別有6、5和2個(gè)成員。TPS-a和TPS-b這兩個(gè)亞家族較大，包含了72.9%的CsTPS成員。這與只用CsTPS構(gòu)建的進(jìn)化樹的分類結(jié)果一致。

　　CsTPS基因家族的基因結(jié)構(gòu)圖顯示，CsTPS5基因組序列最長(zhǎng)，超過37000bp。TPS-a亞家族所含外顯子數(shù)目除CsTPS2(12個(gè))、CsTPS1(4個(gè))和CsTPS16(4個(gè))外，CsTPS基因所含外顯子數(shù)目為6-9個(gè);TPS-b亞家族外顯子數(shù)目為6-8個(gè);TPS-e/f亞家族所含外顯子較多有11-13個(gè);TPS-c亞家族中的CsTPS18和CsTPS40分別有6和15個(gè)外顯子，差異較大;TPS-g亞家族外顯子數(shù)目為7-9個(gè)。可以看出，相同亞家族的CsTPS基因通常外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)也相似。

　　2.3CsTPS家族基因功能預(yù)測(cè)用NCBI的BLASTP將CsTPS蛋白序列與已知功能植物的萜類合成酶蛋白序列進(jìn)行比較(E 90)，預(yù)測(cè)CsTPS基因可能存在的功能。其中，單萜合成酶：2個(gè)芳樟醇合成酶;倍半萜合成酶：10個(gè)大根香葉烯合成酶，8個(gè)α-法尼烯合成酶，2個(gè)橙花叔醇合成酶;雙功能萜類合成酶：3個(gè)芳樟醇/橙花叔醇合成酶;二萜合成酶：3個(gè)香葉基芳樟醇合成酶，1個(gè)貝殼杉烯合成酶，1個(gè)柯巴基焦磷酸合酶。可以看出，CsTPS基因主要編碼合成倍半萜合成酶。

　　2.4CsTPS家族染色體定位對(duì)茶樹TPS基因染色體進(jìn)行定位分析發(fā)現(xiàn)，CsTPS1和CsTPS2定位在1號(hào)染色體上，CsTPS3和CsTPS4定位在2號(hào)染色體上，CsTPS47和CsTPS48定位在14號(hào)染色體上，CsTPS40定位在11號(hào)染色體上，CsTPS41定位在12號(hào)染色體上，5個(gè)基因(CsTPS15、CsTPS36-CsTPS39)定位在10號(hào)染色體，5個(gè)基因(CsTPS42-CsTPS46)定位在13號(hào)染色體，有6個(gè)基因(CsTPS5-CsTPS10)定位在5號(hào)染色體上，10個(gè)基因(CsTPS11-CsTPS20)定位在7號(hào)染色體上，14個(gè)基因(CsTPS21-CsTPS34)定位在8號(hào)染色體上。其中，24個(gè)CsTPS基因分布在7號(hào)和8號(hào)染色體上。可以看出，CsTPS基因主要以串聯(lián)重復(fù)的方式分布在染色體上。

　　3討論與結(jié)論

　　不同植物的TPS基因家族數(shù)量存在顯著差異，在被子植物中，TPS基因數(shù)量大約在40-152個(gè)[2]。前人通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在舒茶早中共鑒定出23個(gè)具有完整編碼序列的CsTPS基因[16]。而本研究在鐵觀音基因組中檢索同時(shí)含有PF01397和PF03936且具有全長(zhǎng)序列的基因，共鑒定出48個(gè)CsTPS基因，是舒茶早中CsTPS基因數(shù)目的2倍左右。另外，本研究對(duì)CsTPS基因進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CsTPS基因家族可分為5個(gè)TPS亞家族，其中TPS-b是CsTPS家族中最大的亞家族，其次是TPS-a，這與舒茶早、擬南芥和番茄等研究結(jié)果相反[10,16,25]。

　　另外，前人沒有對(duì)舒茶早進(jìn)行染色體定位分析[16]，而本研究通過分析發(fā)現(xiàn)TPS基因不均勻地分布在10條染色體上，且以串聯(lián)重復(fù)的形式出現(xiàn)，說(shuō)明茶樹TPS基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了基因復(fù)制擴(kuò)增[25]。這與中粒咖啡和番茄的研究結(jié)果相似[13,25]。基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)在一定程度上反映了基因結(jié)構(gòu)與功能的差異[24]。本研究中，相同亞家族的CsTPS基因外顯子數(shù)量基本一致，與舒茶早、擬南芥及番茄TPS家族的基因結(jié)構(gòu)分布相符[10,16,25]。已有研究表明，在舒茶早、農(nóng)抗早和擬南芥中分別發(fā)現(xiàn)23、11和32個(gè)功能性TPS基因[10.16,26]。在本研究中，預(yù)測(cè)出32個(gè)功能性CsTPS基因，分別編碼不同的萜類合成酶。

　　在舒茶早中，花或葉中大量表達(dá)的CsTPS基因被注釋為倍半萜合酶基因[16]。這與本研究預(yù)測(cè)出的CsTPS基因功能相符，大部分為倍半萜合成酶。本研究中預(yù)測(cè)的TPS-g中5個(gè)CsTPS基因可能編碼雙功能芳樟醇/橙花醇合成酶和橙花叔醇合成酶，這與舒茶早、番茄、楊樹中TPS-g中TPS基因已注釋的功能相同[11,16,27]。

　　另外，本研究預(yù)測(cè)出2個(gè)CsTPS基因可能編碼芳樟醇合成酶。有研究發(fā)現(xiàn)CsTPS基因殺青前表達(dá)量達(dá)到鮮葉的3.8倍，搖青后的做青葉具有典型的蘭花香，推斷該基因與烏龍茶香氣品質(zhì)的形成有關(guān)[8]。橙花叔醇、芳樟醇等具花果香的香氣物質(zhì)是烏龍茶香氣的主要成分[4]。這暗示了鐵觀音加工成烏龍茶后香氣馥郁持久可能與橙花叔醇、芳樟醇等化合物有關(guān)。

　　農(nóng)藝師論文投稿刊物：《茶葉科學(xué)技術(shù)》(季刊)創(chuàng)刊于1960年，是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所主辦的茶葉科技綜合性學(xué)術(shù)期刊。主要報(bào)道茶樹栽培、茶樹育種、茶園土壤肥料、茶葉機(jī)械、茶葉加工、茶樹生理生化、茶樹植保與茶葉經(jīng)濟(jì)等領(lǐng)域的新成果、新技術(shù)、新品種、新工藝與科學(xué)種茶、制茶經(jīng)驗(yàn)、經(jīng)營(yíng)管理經(jīng)驗(yàn)以及應(yīng)用理論等。

　　在舒茶早中，CsTPS70被注釋為貝殼杉烯合酶[16]。且擬南芥中的AtTPSGA1和AtTPSGA2分別編碼柯巴基焦磷酸合酶和貝殼杉烯合酶，共同參與赤霉素的合成[10]。這暗示本研究中的CsTPS11和CsTPS40可能參與了茶樹體內(nèi)赤霉素的合成。已有研究證明擬南芥和楊樹中TPS-f中的AtTPS4和PtTPS10被推測(cè)為二萜合成酶，能夠?qū)�GGPP轉(zhuǎn)化為香葉基芳樟醇[10,27]。本研究預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TPS-e/f中的CsTPS26、CsTPS31、CsTPS33可能編碼香葉基芳樟醇合成酶。本研究預(yù)測(cè)的CsTPS基因是基于與已知功能的植物萜類合成酶同源基因序列的分析，具有較高的序列比對(duì)跨度和相似度[26]。但這些基因的化學(xué)功能仍需后續(xù)試驗(yàn)逐一驗(yàn)證。

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　　作者：高婷鄭玉成王鵬杰谷夢(mèng)雅陳雪津洪雅萍侯炳豪葉乃興