醫師在線雜志淺談常見皮膚癬菌基因分型 推薦本站特色雜志：《醫師在線》是由國家食品藥品監督管理局南方醫藥經濟研究所主管主辦的國內外公開發行的國家級學術性期刊。國內刊號CN：44-1700/R;國際刊號ISSN：1671-8725。是一份由中國醫師協會和SFDA南方醫藥經濟研究所聯手打造的面向醫療機構的臨床醫師、醫療機構的管理人員、衛生行政管理機構管理人員、和藥學研究人員的醫學專業周報。

　　【摘要】 目的 建立快速、簡便鑒別4種常見皮膚癬菌(紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌和石膏樣小孢子菌)的分子生物學基因分型方法。方法 將我室分離培養得到的18株紅色毛癬菌、12株須癬毛癬菌、8株絮狀表皮癬菌和6株石膏樣小孢子菌接種于PDA培養基上培養2周后,分別收集菌絲體并用氯化芐法提取DNA,運用隨機擴增多態性DNA分析的方法，以單個引物(GACA)4進行隨機擴增。檢測聚合酶鏈反應產物，并根據電泳后指紋圖譜的差異進行種屬間鑒別。結果 同種不同株的皮膚癬菌電泳后指紋圖譜相同,不同種皮膚癬菌電泳后指紋圖譜有顯著差異。結論 運用隨機擴增多態性DNA分析的方法，可對紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌和石膏樣小孢子菌的基因型進行快速鑒別,能夠協助臨床早期診斷。

　　【關鍵詞】 醫師在線雜志,表皮癬菌屬,基因型,隨機擴增多態DNA技術

　　皮膚癬菌是淺部真菌病的主要致病菌種，是一群淺在寄生性真菌，主要侵犯皮膚、毛發和指(趾)甲，寄生或腐生于表皮角質、毛發和甲板的角蛋白組織中。淺部真菌病簡稱癬，包括體癬、手足癬、頭癬、甲癬等，是皮膚科常見病，其發病率、復發率均較高，所以對其主要致病菌種——皮膚癬菌的鑒定是非常必要的。傳統的皮膚癬菌鑒定方法主要依據菌落形態、鏡下結構特征，必要時輔以必需的鑒別試驗。但皮膚癬菌菌落形態多樣，容易變異，給鑒定帶來了很多困難[1]。近年來，逐漸開展了多種真菌的分子生物學鑒定方法，PCR技術因具有特異性強、敏感性高的特點，很早就被用于深部真菌病的診斷。本文采用隨機擴增多態性DNA(RAPD)指紋圖譜分析的方法,從基因型的角度對常見的皮膚癬菌的DNA進行鑒別，以快速穩定區分4種常見皮膚癬菌的基因型。現報告如下。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料及其來源

　　1.1.1 菌株 紅色毛癬菌18株，須癬毛癬菌12株，絮狀表皮癬菌8株，石膏樣小孢子菌6株，從青島大學醫學院附屬醫院、青島市人民醫院等5家醫院甲癬病人病甲標本中分離培養取得。

　　1.1.2 試劑 DNA抽提緩沖液按文獻[2]方法配制，氯化芐為上海山蒲化工公司產品，TaqDNA聚合酶PCR反應緩沖液以及dNTPS為大連寶生物公司產品。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 真菌DNA制備 實驗菌株于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上28 ℃培養2周，用無菌生理鹽水洗滌下菌絲體,研磨后離心得孢子沉淀，用氯化芐法[2]提取基因組DNA。

　　1.2.2 聚合酶鏈反應(PCR)擴增 以寡核苷酸重復序列(GACA)4為單個引物，反應體系25 μL,其中包括:50 ng模板DNA，2 μL 10×PCR反應緩沖液(不含Mg2+)，0.5 μL dNTPs(10 mmol/L),2 U的TaqDNA聚合酶,2 μL合成引物(10 μmol/L),2 μL MgCl2(25 mmol/L)。反應條件:起始變性94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 1 min，退火47 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min,37個循環;延伸72 ℃ 6 min。產物于20 g/L瓊脂糖凝膠電泳(4.5 V/cm) 1.5 h,紫外線燈下照相觀察。

　　2 結 果

　　從電泳凝膠上可觀察到，4種菌株均得到有效擴增,不同種皮膚癬菌產生具有不同特征的電泳帶型。其中紅色毛癬菌的主要擴增條帶有4條，大小分別約590、530、480、350 bp，特征主條帶為590、350 bp;須癬毛癬菌主要擴增條帶有7條,大小約690、590、540、500、450、390、350 bp,特征主條帶為690、590、500 bp共3條;絮狀表皮癬菌主要擴增條帶有4條,大小約590、390、350、210 bp,特征主條帶為350、210 bp;石膏樣小孢子菌主要擴增條帶有5條，大小約590、490、350、310、250 bp,特征主條帶為490、310、250 bp共3條。相同菌種的DNA主要帶型一致：18株紅色毛癬菌帶型一致，未見種內差異;12株須癬毛癬菌帶型一致，未見種內差異;8株絮狀表皮癬菌帶型一致，未見種內差異;6株石膏樣小孢子菌帶型一致，未見種內差異(圖1)。

　　3 討 論

　　RAPD分析是一種利用隨機合成的單個寡核苷酸引物，通過PCR反應擴增靶細胞DNA,擴增產物經凝膠電泳,分析DNA片段大小和數量多態性,從而比較靶基因差異的技術。該方法操作簡便、迅速,便于大規模使用,已陸續用于酵母菌和絲狀真菌的鑒定、分類和流行病學研究。MEYER等[3]用寡核苷酸重復序刊(GACA)4、(GTG)及M13中心序列(5′?GAGGGTGGCGGTTCT?3′)等3種引物作為RAPD的隨機單引物,對42株新生隱球菌進行研究,結果表明RAPD具有高度重復性,且在種、變種和單個菌株水平上存在差異。LOUDON等[4]報道，RAPD對曲霉菌鑒定和分型有良好的應用價值。

　　本文應用RAPD方法和引物(GACA)4對4種常見的皮膚癬菌(包括紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌和石膏樣小孢子菌共44株)進行了PCR擴增，結果顯示，不同種的真菌DNA經擴增后產生不同的DNA帶型;同一菌種的同一樣品在不同次實驗中，相同引物產生的DNA帶型一致，并且帶型清晰，重復性良好。另外,我們分離的紅色毛癬菌表型為羊毛型、絨毛型的有10株，粉末、溝紋型的6株，顆粒型的2株，擴增后其基因型相同。須癬毛癬菌表型為羊毛、絨毛型8株，粉末型4株，擴增后其基因型亦相同。可見本方法具有種屬間特異性而無種內特異性。本文結果與FAGGI等[5]的結果不一致,其原因可能是地方菌株差異所致。

　　目前，在臨床上對皮膚癬菌傳統鑒別主要依據培養菌形態、生理、生化等方法。但在分離培養過程中，皮膚癬菌受培養基類型、pH值、培養溫度等因素的影響容易失去典型的表型特性而難以鑒別[6]。例如，紅色毛癬菌的菌落產紅現象受外界因素的影響在失去產紅能力后菌落形態與須癬毛癬菌極為相似,某些表型的紅色毛癬菌菌株也會使尿素瓊脂培養基變色;而須癬毛癬菌某些菌株產生色素后也酷似紅色毛癬菌。這些現象可能造成檢驗時間延長甚至引起誤檢。而我們采用的RAPD方法是以皮膚癬菌的基因組DNA為模板PCR擴增后進行指紋圖譜分析，有效解決了以上問題。且該方法操作簡便、節省時間、重復性良好，是形態學鑒定方法的一個有力補充。隨著檢驗科室設備的不斷更新,技術人員水平的不斷提高,相信該項技術一定會在臨床逐步開展。

　　【參考文獻】

　　[1]LIU D, COLOE S, BAIRD R, et al. Application of PCR to the identification of dermatophyte fungi[J]. Med Microbiol, 2000,49(4):493?497.

　　[2]ZHU H, JUN F, ZHU L H. Isolation of genomic DNA from plant fungi and bacteria using benzyl, chloride[J]. Nucl Acid Res, 1993,21:5279?5280.

　　[3]MEYER W, MITCHELL T G. Polymerase chain reaction fingerprinting in fungi using single primers specific to minisatellites and simple repetitive DNA sequences: strain variation in Cryptococcus neoformans[J]. Electrophoresis, 1995, 16 (9): 1648?1656.

　　[4]LOUDON K W, BURNIE J P, COKE A P, et al. Application of polymerase chain reaction to fingerprinting Aspergillus fumigatus by random amplification of polymorphic DNA[J]. J Clin Microbiol, 1993,31(5):1117?1121.

　　[5]FAGGI E, PINI G, CAMPISI E, et al. Application of PCR to distinguish common species of dermatophytes[J]. J Clin Microbiol, 2001,39(9):3382?3385.

　　[6]徐永生，徐健，武靜，等. 真菌性鼻竇炎的診斷及鼻內鏡手術治療效果[J]. 齊魯醫學雜志， 2006,21:317?318.