摘要：丹參水溶性有效成分多具有酚酸性結構,丹參素(化學名為β?3,4?二羥苯乳酸,β?3,4?dihydroxybenyl lacticacid)是各種丹酚酸的基本化學結構:丹酚酸A是一分子丹參素與兩分子咖啡酸縮合而成;丹酚酸B為三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成;丹酚酸C 則為二分子丹參素縮合而成;其他丹酚酸亦有類似結構。丹參水溶性成分中的迷迭香酸(ros?marinic acid A,Ros)也是由一分子丹參素和一分子咖啡酸縮合而成。此外,還有四甲基丹酚酸(tetramethyl salvianolic acid A,Sal M)等等[1]。

　　目前, 工業上提取丹參有效成分主要以熱回流法為主,而酚酸類性質不穩定、易氧化水解,因而提取工藝的研究應多指標綜合考慮。選擇不穩定成分作為提取工藝篩選的指標性成分,有利于篩選出合理的工藝條件,防止成分在提取工藝中損失過大[2-3]。本研究以提取物得率和丹酚酸B含量為指標,進行丹酚酸提取工藝研究, 以確定最佳的提取工藝,探索適合工業化提取的工藝條件。

　　關鍵詞：現代診斷與治療期刊征稿,期刊投稿,丹酚酸,提取工藝

　　1 儀器與試劑

　　1.1 儀器

　　FA1004N型電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司),JZ8002天平(上海精密科學儀器有限公司),RE5298A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠),LXJ?II型離心沉淀機(上海醫用分析儀器廠),YL?015型實驗型噴霧干燥機(上海雅程儀器設備有限公司),QT?330型柱溫箱(QM,旗美),LC?10ATVP型泵(日本島津),SPD?10AVP型紫外檢測器(日本島津),高效液相色譜柱(Diamonsil 鉆石),電子天平(SHIMADZU AY120),KQ?100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),pHS?25型pH計(上海智光儀器儀表有限公司)。

　　1.2 試藥與試劑

　　丹參藥材系唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖(購自廣州市天河寶潤堂中藥飲片廠),經廣州中醫藥大學高英主任藥師檢驗,符合《中國藥典》2005版一部丹參項下規定。乙醇(分析純,天津市富宇精細化工有限公司),甲醇、乙腈(色譜純,迪馬科技有限公司),甲酸(分析純,廣州化學試劑廠),D101大孔吸附樹脂(天津市光復精細化工研究所),鹽酸(分析純,廣州市白云區良田光明化工廠), FeCl3(分析純,天津市大茂化學試劑廠),丹酚酸B對照品(批號:200504,中國藥品生物制品檢定所)。

　　2 方 法

　　2.1 丹酚酸提取工藝

　　2.1.1 實驗設計 采用均勻設計法,選擇影響醇提的3個主要因素:乙醇濃度(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)為考察指標,乙醇濃度選擇9個水平,提取時間及提取溫度各選擇3水平、各水平循環3次,采用U9(96)表安排試驗,見表1。表1 因素水平表

　　2.1.2 樣品溶液的制備 取丹參藥材100 g,加入3 000 mL的圓底燒瓶中,按表1實驗列號各條件操作,于恒溫水浴鍋中加熱浸提,趁熱抽濾,濾渣再按原條件進行第2次乙醇浸提,趁熱抽濾,合并2次濾液。 將提取液用旋轉蒸發儀進行減壓濃縮至乙醇除盡,將濃縮液用配制好的質量分數10%的鹽酸溶液調至pH=3,用離心機(2 000 r/min,5 min)離心濃縮液,用布氏漏斗抽濾,作為樣品溶液備用。

　　2.2 大孔吸附樹脂分離純化

　　2.2.1 樹脂的預處理 D101樹脂用體積分數95%的乙醇浸泡24 h,除去上層漂浮物,濕法裝柱,用乙醇流動清洗,應不時檢查流出的乙醇液,至乙醇液與水混合(1∶5)不呈白色渾濁為止,然后用水沖洗至無醇味止。

　　2.2.2 丹參提取液分離純化 離心后的樣品溶液通過D 101大孔樹脂(藥材與樹脂用量比為1∶4;流速為2.0~3.0 BV/h),用水進行沖洗,除去水溶性雜質。采用FeCl3檢測法,判斷洗脫液中有無丹酚酸B成分被洗脫,用水6倍量沖洗,繼用體積分數30%的乙醇7倍量洗脫(流速為0.5~1.0 BV/h) 。收集體積分數為30%的乙醇洗脫液,用旋轉蒸發儀(60 ℃)減壓濃縮,濃縮至液體相對密度為1.15。濃縮液噴霧干燥(進風溫度220 ℃,出風溫度80 ℃),最終得淡黃色固體粉末。置干燥器內,備用。

　　2.3 丹酚酸B含量測定

　　2.3.1 供試品溶液的制備 精密稱取丹參提取物粉末10 mg,加入100 mL量瓶中,加水溶解定容,搖勻,過0.45 μm 微孔濾膜,即得。

　　2.3.2 色譜條件 色譜柱: C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm); 流動相:甲醇?水?乙腈?甲酸(體積比30∶59∶10∶1);流速:1 mL·min-1;檢測波長:286 nm;進樣量:10 μL;柱溫:35 ℃;

　　2.3.3 含量測定方法[4] 精密量取供試品溶液10 μL,注入液相色譜儀中,按“2.3.2”項下條件操作,測定丹酚酸B吸收峰的峰面積積分值,計算丹酚酸B含量。

　　2.4 樣品的固形物含量

　　將洗脫液于60 ℃恒溫水浴,揮干乙醇和部分水分成稠膏狀,膏狀物移至真空干燥箱(60 ℃,0.09 MPa)減壓干燥,置干燥器0.5 h(防回潮),待樣品冷卻后,精密稱量。

　　3 結 果

　　丹酚酸提取工藝正交試驗結果見表2。將實驗數據進行多元回歸, 求得回歸方程Y=1961+2.0861X1+5.4653X2-0.0356X12-2.055X22+0.0186X1X3,R2=0.954 5,F=6.150 1,方程顯著有效,并得到最佳工藝參數為:乙醇濃度為45%,提取2次,每次1 h,溫度為70 ℃。對最佳處方進行驗證,3批樣品丹酚酸B含量分別為:70.23%、69.04%、69.69%。

　　4 討 論

　　4.1 提取丹參藥材中水溶性成分丹酚酸B,大部分文獻采用水提醇沉法。本文采用乙醇浸提的方法提取,其目的是為了避免用水提取時提取液中含有糖類等水溶性雜質而使液體黏稠。表2 U9(96)均勻設計表及試驗結果

　　4.2 丹酚酸B對熱不穩定,易氧化水解,對受熱溫度和受熱時間敏感,所以丹參提取液不宜長時間高溫濃縮。試驗結果表明,丹酚酸提取宜采用減壓濃縮和噴霧干燥等工藝,降低工藝過程的溫度和受熱時間,有利于提取物中丹酚酸保存率的提高[4]。

　　4.3 將濃縮液pH值調至3,可以使部分雜質析出,且酸性體系有利于丹酚酸B水溶液在受熱條件下的穩定;同時調節溶液的pH可以改變丹酚酸在溶液中的游離狀態,酸性條件下丹參酚酸的極性下降,有利于大孔吸附樹脂對丹酚酸的吸附。

　　4.4 以體積分數為95%的乙醇濕法裝柱,清洗,然后用水沖洗,沖洗速度宜慢,使大孔樹脂堆實以利于吸附藥液;藥液通過D 101大孔樹脂,流速控制為樹脂體積2.0~3.0 BV/h,這樣可以使藥液與樹脂充分接觸,靜置一段時間再用水進行沖洗,洗脫糖等水溶性雜質,而丹酚酸B類成分未被洗脫。用體積分數為30%的乙醇洗脫,丹酚酸B具有良好的解吸附性。