摘要我國黃瓜品種繁多，但黃瓜的抗逆性不強，容易產生病蟲害。因此，分析和驗證抗病相關的基因，探究黃瓜抗病的分子機理，可為培育黃瓜抗性品種奠定基礎。本研究以黃瓜為試驗材料，采用RT-PCR技術克隆了黃瓜銅伴侶蛋白基因CsATX1的cDNA序列全長，并對其進行生物信息學分析;采用熒光定量PCR的方法分析CsATX1基因在細菌性角斑病侵染0~96h下的表達情況，以期探究其與黃瓜抗病性的關系。結果表明：CsATX1基因序列全長為768bp，含有一個288bp的ORF閱讀框，可編碼95個氨基酸，該基因編碼蛋白的相對分子質量約為9.95kD，理論等電點是5.07，為親水性蛋白，不具有跨膜結構，不含信號肽序列。系統(tǒng)進化樹分析表明CsATX1與葫蘆科同源蛋白的親緣關系最近。qRT-PCR分析表明，CsATX1在黃瓜葉中有表達，在黃瓜細菌性角斑病菌侵染下，該基因在黃瓜葉中表達顯著增高，受黃瓜細菌性角斑病菌的誘導。該研究結果為深入探究CsATX1基因功能提供科學依據(jù)。

　　關鍵詞黃瓜;銅伴侶蛋白;基因克隆;細菌性角斑病;熒光定量PCR

　　銅(Cu)是植物生長發(fā)育所必需的微量元素，在正常生理條件下，主要以兩種離子形式存在：Cu+和Cu2+，且這兩種Cu的狀態(tài)可以相互轉換，這一特點使得Cu能夠作為細胞內的輔助因子來參與植物體內一些重要的氧化還原反應(袁金紅等,2016)，如在光合作用、呼吸作用、氧化脅迫防御等生理活動中發(fā)揮重要功能(Yruela,2009)，植物中銅含量為2~50μg/gDW(dryweight)，當植物中銅水平低于正常值時，植物開始表現(xiàn)缺銅癥狀，如生長緩慢、幼葉失綠、葉緣卷曲、果實形成減少等;而銅離子含量過高則會對植物產生毒害(Laliotietal.,2009)，主要表現(xiàn)為：根系生長受阻，新葉失綠、老葉壞死，葉柄和葉背變?yōu)樽仙�等。維持細胞內銅離子穩(wěn)態(tài)是通過一系列的轉運蛋白和金屬結合蛋白來完成的(Lengetal.,2015)。

　　農業(yè)論文投稿刊物：《湖北農業(yè)科學》創(chuàng)刊于1955年，以學術性、科學性和實用性為特色，主要報道國內外農業(yè)最新科技成果和科研動態(tài)，傳播科技信息。主要欄目有：綜述、硒谷論壇、育種·栽培、資源·環(huán)境、植物保護、園藝·特產、畜牧·獸醫(yī)、水產養(yǎng)殖、貯藏·加工、檢測分析、農業(yè)工程、信息工程、生物工程、經濟·管理、鄉(xiāng)村振興等。本刊為半月刊，上下半月分別于每月10日、25日出版。歡迎廣大作者針對各欄目特色踴躍投稿。見刊后，我們給每文作者提供2本樣書和10份獨立文章的單行本，以快遞形式送達。

　　銅伴侶蛋白可與銅離子進行結合，其含有銅離子結合區(qū)，是一類低分子量的金屬傳遞蛋白，通過將銅離子向靶位點轉移和運輸，以達到平衡細胞內銅離子的量進而避免其產生毒害的目的(衛(wèi)浩等,2019)。銅伴侶蛋白首先在釀酒酵母中被發(fā)現(xiàn)(LinandCulotta,1995)，對ATX1基因功能的研究表明它參與轉運銅離子，并證明這一過程可以有效阻止氧自由基進一步對細胞的破壞作用。植物中有ATX1-type和CCH-type兩種ATX-like銅伴侶蛋白。研究表明銅離子可以調控銅伴侶蛋白的表達量(PuigandThiele,2002)，同時研究還發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過表達ATXlike基因后可起到降低銅離子脅迫的作用。

　　此外，研究其他植物ATX-like銅伴侶蛋白發(fā)現(xiàn)該蛋白可能具有不同的功能，如水稻ATX基因不僅受水楊酸、脫落酸、茉莉酸等激素誘導，而且也可以響應Cu+和病原菌(Magnaporthegrisea)的誘導，該結果表明銅伴侶蛋白可能在植物抵御不良環(huán)境或病原菌的侵害過程中發(fā)揮作用(Agrawaletal.,2002)。黃瓜(CucumissativusL.)隸屬于葫蘆科甜瓜屬，是世界上最重要的蔬菜作物之一，我國很早就開始選擇和培育黃瓜品種并在各地廣泛種植(張文爍等,2020)。黃瓜生長過程中會受到不同病原菌的侵染，嚴重影響了黃瓜的品質及產量。在上世紀70年代，我國黃瓜種植業(yè)大面積爆發(fā)細菌性角斑病，到目前為止仍是影響黃瓜優(yōu)質高產的最重要的病害之一(孫福在和何禮遠,1988)。

　　然而至今我們仍不了解黃瓜及其病原菌——細菌性角斑病它們之間互作的分子機制。本研究根據(jù)前期構建的黃瓜葉cDNA文庫數(shù)據(jù)進行篩選比對，獲得了編碼CsATX1基因的全長序列，通過生物信息學分析預測該基因的功能。此外，進一步采用熒光定量PCR技術檢測了CsATX1基因在黃瓜細菌性角斑病菌誘導下的表達水平，為探求黃瓜銅伴侶蛋白基因的功能奠定基礎。

　　1結果與分析

　　1.1黃瓜葉片總RNA檢測采用試劑盒提取總RNA后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示rRNA條帶清晰，無彌散條帶，表明黃瓜葉片總RNA提取的完整性較好;進一步通過核酸蛋白儀分析總RNA的純度，結果顯示OD260/OD280為1.88，在1.8~2.1范圍內，說明所提取的黃瓜葉片總RNA純度較高，可進行后續(xù)的反轉錄實驗。

　　1.2黃瓜CsATX1基因cDNA全長的獲得以上述提取的黃瓜葉片總RNA反轉錄的cDNA為模板，用設計的特異性引物(AF1、AR1)進行PCR擴增。結果表明，在Marker的750bp附近出現(xiàn)1個CsATX1基因的特異條帶，與預測片段大小吻合。PCR擴增產物經膠回收試劑盒回收純化，送公司測序后獲得一段768bp長度的電子序列。

　　1.3CsATX1全長序列生物信息學分析通過NCBI網(wǎng)站上的ORFFinder對黃瓜CsATX1基因全長(768bp)的開放閱讀框即編碼區(qū)進行查找，結果表明CsATX1基因包含一個288bp的開放閱讀框(啟動子為ATG，終止子為TAA)，編碼95個氨基酸，此外，在編碼區(qū)的上游和下游分別含有一段145bp的5′非翻譯區(qū)和一段335bp的3′非翻譯區(qū)，HMA重金屬結合相關區(qū)域位于氨基酸序列的11-63位。

　　1.5CsATX1基因響應細菌性角斑病菌誘導的表達情況分析采用細菌性角斑病菌處理黃瓜葉片0~96h，通過熒光定量PCR技術分析不同時間處理下的CsATX1基因表達情況。結果表明，在0~96h內，CsATX1基因的表達水平呈先升高，再降低，然后再升高的變化趨勢。從總體上看，經細菌性角斑病菌處理后，CsATX1基因的表達量顯著高于對照組(未處理)，最高表達量出現(xiàn)在誘導96h，為對照的190.5倍。以上結果可以看出，黃瓜銅伴侶蛋白CsATX1基因受細菌性角斑病菌的顯著誘導，由此可推測CsATX1基因可能具有抵御外來生物脅迫的功能，尤其在防御黃瓜細菌性病害中發(fā)揮作用。

　　2討論

　　近年來，雖然有關植物銅伴侶蛋白的研究已取得了一定進展，但仍然遠滯后于對酵母銅伴侶蛋白的研究。就植物比較而言，其中模式植物擬南芥銅伴侶蛋白的研究處于領先地位(杜亞琳,2016)，主要存在兩種類型的ATX1-like銅伴侶蛋白基因，ATX1-type和CCH-type;其中ATX1-type蛋白在無銅鋅超氧化物歧化酶SOD參與時，可以通過其自身具有的抗氧化能力對細胞起保護作用(Puigetal.,2007)，即ATX1是一個獨立于SOD途徑的氧自由基消除劑(Itohetal.,2009)。近年來，黃瓜中雖然有關銅吸收、轉運基因(CCH)被發(fā)現(xiàn)(井鑫,2006)，但我們對該類蛋白了解得十分有限，尤其在抗病防御方面的生理功能仍不清楚。本研究中，我們克隆了黃瓜銅伴侶蛋白ATX1基因的cDNA全長序列，并利用生物信息學方法對CsATX1進行序列分析和結構預測。

　　研究發(fā)現(xiàn)CsATX1無跨膜結構和信號肽，這與擬南芥AtATX1蛋白預測的結果一致，推測CsATX1并非膜結合蛋白，且沒有翻譯后的轉運過程，預測其在細胞質中行使功能。CsATX1的氨基酸序列進行潛在磷酸化位點分析，預測結果顯示該蛋白有10個磷酸化位點，通常來說，蛋白質中磷酸化位點的數(shù)目與其發(fā)揮的生物學功能呈正比，即位點越多，該蛋白發(fā)揮的生物學功能越多。此外，系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)CsATX1的結構非常保守，與擬南芥AtATX1的相似度達70%左右，推測黃瓜CsATX1銅伴侶蛋白的功能可能與擬南芥銅伴侶蛋白AtATX1功能類似，側重于參與細胞內銅運輸和活性氧的清除。在黃瓜侵染性病害中，細菌性角斑病是其中最為重要的病害之一。近年來，該病害幾乎為害全國各大黃瓜種植區(qū)，嚴重時發(fā)病率可高達100%，致使整個溫室大棚的黃瓜全部染病而死，給瓜農們造成了巨大經濟損失(彭月等,2021)。

　　目前該細菌性病害的防治仍以化學防治為主，眾所周知，化學防治不僅會帶來農藥殘留，污染環(huán)境，而且長期使用還會導致病害產生抗藥性，提高對其防治的難度系數(shù)。因此十分有必要進一步深入研究寄主植物與病原物之間互作的分子機制，為今后有效防治黃瓜細菌性角斑病奠定基礎。

　　3材料與方法

　　3.1試驗材料本研究所用到的黃瓜品種(D0462)和細菌性角斑病菌均由東北農業(yè)大學園藝學院惠贈。(1)開展時間：在黃瓜處于3片真葉期時進行;(2)處理方法：制備1×108cfu/mL菌懸液，用噴霧器向黃瓜葉面均勻噴灑，噴至葉面布滿水珠但不滴下即可，對照組噴灑等量的無菌水;(3)誘導時間：分別誘導0、8、24、48、72、96h;(4)誘導后收集葉片，用無菌水沖洗葉面3~4遍，并用濾紙吸干水分，液氮中速凍后，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　3.2黃瓜葉片總RNA的提取將黃瓜葉片在液氮中快速研磨至粉末狀，采用植物RNA試劑盒提取總RNA，具體方法按照說明書進行。提取黃瓜葉片總RNA后，分別采用瓊脂糖凝膠電泳和核酸分析儀對其質量進行檢測。

　　3.3CsATX1全長基因克隆根據(jù)課題組前期獲得的黃瓜cDNA文庫數(shù)據(jù)進行比對分析(劉關君等,2009)，獲得了一個銅伴侶蛋白CsATX1基因全長序列，根據(jù)該序列設計特異性引物AF1、AR1，以提取的黃瓜總RNA反轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增該序列，具體反應體系如下(50μL)：cDNA模板2.5μL，引物AF1、AR1(濃度為10μmol/L)各2μL，2×PCRMix25μL，其余用ddH2O補足。PCR擴增條件如下：首先，95℃預變性5min;95℃變性30s、58℃退火40s、72℃延伸40s，40個循環(huán);最后再72℃延伸7min。PCR產物經膠回收純化后送哈爾濱生物公司測序。

　　3.4序列分析CsATX1基因所包含的編碼區(qū)序列采用NCBI中的ORF(Openreadingframe)程序查找。氨基酸的理化性質采用ProtParamtool軟件進行分析。CsATX1蛋白跨膜區(qū)預測采用TMHMM在線軟件;CsATX1蛋白的信號肽預測采用Signalp5.0軟件。CsATX1蛋白的保守結構域通過NCBI中CDD程序進行分析。CsATX1蛋白的潛在磷酸化位點用Netphos3.1server進行分析。CsATX1亞細胞定位分析分別采用Plant-mPloc和psortprediction在線程序進行。CsATX1氨基酸序列的二級、三級結構分析，分別利用SOPMA和SWISS-model進行預測。最后，下載與CsATX1比對相似性較高的氨基酸序列，采用軟件ClustalX和MEGA10.1構建系統(tǒng)進化樹。

　　3.5qRTPCR分析CsATX1基因的表達情況采用細菌性角斑病菌對黃瓜葉片進行不同時間的誘導處理，侵染時間分別為0、8、24、48、72和96h，侵染后分別提取不同時間處理的黃瓜葉總RNA，并逆轉錄成cDNA后，采用熒光定量PCR方法，對細菌性角斑病菌處理下的黃瓜CsATX1基因表達情況進行檢測。在PCR管中加入cDNA為模板1μL，10μmol/L引物(AF-q,AR-q)及內參引物(18S-F1,18S-R1)(表1)各0.8μL，2×SYBRPremixExTaq混合液10μL，體系為20μL，不足用ddH2O補足。采用核酸擴增熒光檢測儀(AgilentMx3000P)進行qRT-PCR反應，反應條件為：95℃預變性30s;95℃15s，58℃30s，72℃30s，40個循環(huán)，反應結束后根據(jù)2-ΔΔCt計算相對表達量(LivakandSchmittgen,2001)。

　　參考文獻

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　　(杜亞琳,2016,擬南芥缺銅敏感突變體的鑒定分析,貴州農業(yè)科學,44(8):80-83.)ItohS.,OzumiK.,KimH.W.,NakagawaO.,McKinneyR.D.,FolzR.J.,ZelkoI.N.,Ushio-FukaiM.,andFukaiT.,2009,NovelmechanismforregulationofextracellularSODtranscriptionandactivitybycopper:roleofantioxidant-1,FreeRadicalBiologyandMedicine,46(1):95-104.

　　作者：孫婷婷1孟令波2李淑敏