摘要:電紡絲支架已被廣泛用于組織工程領(lǐng)域，其中硅酸鈣等生物活性陶瓷復(fù)合的電紡絲支架，在應(yīng)用中展現(xiàn)出了優(yōu)異的生物活性。硅酸鈣復(fù)合電紡絲支架中硅酸鈣降解釋放的硅酸根離子(SiO32-)已被證實(shí)具有促進(jìn)成血管性能，但其有效活性離子濃度范圍比較窄，僅在0.79~1.8μg/mL之間。因此精確控制組織工程材料的離子釋放濃度，使材料釋放的離子能較長(zhǎng)時(shí)間保持在有效活性濃度范圍，對(duì)于組織工程應(yīng)用具有重要意義。本研究通過調(diào)節(jié)電紡絲孔徑大小及硅酸鈣納米線的不同復(fù)合方式，制備了多種硅酸鈣復(fù)合電紡絲纖維支架，并比較了其在體外環(huán)境下的離子釋放模式及對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，混紡及同時(shí)電噴-電紡復(fù)合方式的小孔徑硅酸鈣復(fù)合電紡支架由于高分子的疏水作用和小孔徑結(jié)構(gòu)對(duì)離子擴(kuò)散的阻礙，可以實(shí)現(xiàn)離子緩釋。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，具有離子緩釋效果的支架可以更好地促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，說(shuō)明通過調(diào)控支架離子緩釋，可以有效調(diào)控其生物活性，獲得最佳組織工程應(yīng)用效果。

　　關(guān)鍵詞:硅酸鈣;靜電紡絲;可控釋放;降解;靜電噴霧

　　靜電紡絲支架因具有類細(xì)胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)、大比表面積、高孔隙率[1-3]，被廣泛應(yīng)用于血管[4-5]、心肌[6-7]、神經(jīng)[8-9]等組織工程創(chuàng)傷修復(fù)[10]領(lǐng)域。電紡絲支架經(jīng)過多年的研究發(fā)展，通過在其中引入活性藥物[11]和活性陶瓷等[12]賦予了電紡絲支架粘附、增殖、遷移、分化等生物活性。硅酸鈣等生物活性陶瓷分解釋放的SiO32-，不僅被證實(shí)具有促進(jìn)骨[13]、牙齒[14]等硬組織再生的作用。

　　近年來(lái)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)SiO32-還具有促進(jìn)血管[15]、脂肪[16]、皮膚創(chuàng)面[17]、毛囊[18]、心肌[19]等多種軟組織修復(fù)的生物活性。前期研究中，硅酸鈣等生物活性陶瓷通過混紡[19]或者噴涂[20]的方式與電紡絲進(jìn)行復(fù)合，促進(jìn)了組織的修復(fù)。但是，不同的組織修復(fù)所需的活性SiO32-濃度范圍各有差異[21]，以促進(jìn)成血管性能為例，據(jù)Li等[22]報(bào)道，SiO32-有效促進(jìn)成血管的濃度范圍為0.79~1.8μg/mL，有效濃度范圍較窄，這對(duì)于材料中SiO32-的釋放行為提出了要求。

　　雖然前述工作報(bào)道的硅酸鈣等生物活性陶瓷復(fù)合電紡絲支架中釋放的SiO32-具有促進(jìn)軟組織修復(fù)的作用，但并未關(guān)注材料中SiO32-的釋放行為對(duì)于軟組織修復(fù)效果的影響。因此，精確控制組織工程材料中硅酸鹽陶瓷降解產(chǎn)生的SiO32-的釋放行為具有重要意義。 前期的研究[23-25]表明，孔徑的大小對(duì)材料內(nèi)部的藥物釋放有重要影響，因此本研究提出的第一個(gè)假設(shè)是，通過調(diào)節(jié)電紡絲的孔徑結(jié)構(gòu)可以有效調(diào)控生物活性離子的釋放行為。

　　此外，醫(yī)用電紡絲支架常用的高分子主要有聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸(PLA)等疏水性高分子，有文獻(xiàn)[26]報(bào)道這些疏水性高分子的疏水作用將阻礙內(nèi)部藥物釋放，因此本研究提出第二個(gè)假設(shè)是，硅酸鈣在復(fù)合材料體系內(nèi)的分布位置不同，如纖維絲內(nèi)部、纖維表面均勻分布、集中分布于支架外表面、“三明治”夾心層等，將會(huì)導(dǎo)致復(fù)合材料中硅酸鈣受到的高分子疏水作用有所不同，從而影響SiO32-的釋放行為。基于以上假設(shè)，本研究考慮可以通過調(diào)控硅酸鈣/高分子復(fù)合組織工程材料的孔徑及硅酸鈣顆粒在復(fù)合材料中的位置來(lái)調(diào)控SiO32-釋放。

　　因此，本研究制備了不同孔徑復(fù)合電紡絲支架，并結(jié)合靜電噴霧技術(shù)，構(gòu)建了多種硅酸鈣復(fù)合形式的電紡絲支架，探討了孔徑及復(fù)合形式對(duì)于材料親疏水性及離子釋放的影響，并在此基礎(chǔ)上考察了復(fù)合支架的不同離子釋放行為對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。

　　1實(shí)驗(yàn)方法

　　1.1實(shí)驗(yàn)試劑

　　本研究采用的藥品四水合硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O)、九水合硅酸鈉(Na2SiO3·9H2O)、明膠購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司;聚乳酸(PLA，分子量6萬(wàn))購(gòu)于濟(jì)南岱罡生物工程有限公司，聚己內(nèi)酯(PCL，分子量8萬(wàn));六氟異丙醇(HFIP)購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。

　　1.2硅酸鈣納米線的制備與表征

　　根據(jù)文獻(xiàn)[27]報(bào)道，采用水熱法合成硅酸鈣納米線(Ca6(Si6O17)(OH)2，CSH)。即，將9.446g的Ca(NO3)2·4H2O和11.368g的Na2SiO3·9H2O分別溶解于100mL的去離子水中，磁力攪拌1h后，將混勻的溶液轉(zhuǎn)移至水熱釜中200℃反應(yīng)24h。待水熱釜自然冷卻后，將制得的CSH用去離子水和乙醇分別沖洗三次，于60℃烘箱中烘干24h備用。采用18kW轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀分析CSH的物相組成;使用場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(JEM-2100F)觀察納米線的結(jié)構(gòu)。

　　1.3不同孔徑電紡絲的制備

　　本研究通過調(diào)節(jié)高分子電紡絲(Electrospun,ES)溶液的濃度調(diào)節(jié)電紡絲孔徑的變化。即，配方將不同質(zhì)量的PLA、PCL、明膠以35/35/30(w/w/w)的比例溶解于HFIP中，將電紡絲溶液置于磁力攪拌器上以120r/min的速度攪拌48h直至澄清，分別得到濃度(w/v)為5%、10%、18%、22%的電紡絲溶液，分別命名為5ES、10ES、18ES、22ES。隨后各溶液分別轉(zhuǎn)移到20mL注射器中進(jìn)行靜電紡絲。

　　由于不同濃度的電紡絲溶液的紡絲液性質(zhì)不同，為能制備到形態(tài)良好的電紡絲纖維，本研究對(duì)電紡絲的電壓、流速、針頭與基板的間距均進(jìn)行了相應(yīng)的調(diào)節(jié)，其中各組溶液的電壓、流速、針基板間距等紡絲參數(shù)進(jìn)行設(shè)置：對(duì)各組電紡絲SEM照片采用ImageJ軟件測(cè)量50根以上的纖維，并統(tǒng)計(jì)分析得到其直徑和孔徑[28]，通過測(cè)量50個(gè)以上由纖維圍成的孔的尺寸，并統(tǒng)計(jì)分析得到其孔徑。

　　1.4硅酸鈣復(fù)合電紡絲支架的制備與表征

　　本研究通過四種不同方式制備硅酸鈣復(fù)合電紡絲支架：(a)混紡CSH;(b)電紡絲的同時(shí)電噴CSH;(c)在電紡膜表面電噴CSH;(d)表面噴有CSH的電紡膜再進(jìn)行電紡絲。四種方法制備的電紡絲支架，分別命名為CSH@ES、CSH&ES、CSH//ES、ES/CSH/ES。具體制備方法如下。(a)CSH@ES：將0.05gCSH加入到10mL5ES或22ES電紡絲溶液中，分別以5ES或22ES的電紡絲參數(shù)進(jìn)行混紡而制得;(b)CSH&ES：在制作10mL5ES或22ES電紡絲的同時(shí)靜電噴霧10mL含0.05g的CSH乙醇溶液而制得，其中電噴參數(shù)設(shè)定為電壓18kV及針基板間距15cm。

　　(c)CSH//ES：在制作10mL5ES或22ES電紡絲后，于纖維膜表面采用前述靜電噴霧條件電噴10mL含0.05g的CSH乙醇溶液而制得;(d)ES/CSH/ES：在制作5mL5ES或22ES溶液電紡絲后，在纖維膜上電噴10mL含0.05g的CSH乙醇溶液，之后再作5mL5ES或22ES溶液電紡絲，形成以CSH為夾心層的“三明治”纖維膜結(jié)構(gòu)。上述制備過程中，通過控制摻入或電噴相同含量的CSH以保證各組的CSH含量一致。硅酸鈣復(fù)合支架的接觸角表征通過水接觸角分析儀(FM40Mk2Easydrop)進(jìn)行測(cè)試;利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)檢測(cè)支架在細(xì)胞培養(yǎng)液中浸泡1、3、5、7d的SiO32-釋放行為。

　　1.5細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

　　本研究中采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC，購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù))研究硅酸鈣復(fù)合電紡絲支架對(duì)細(xì)胞的增殖影響。將HUVEC種于纖維支架表面，并培養(yǎng)于37℃、含5%二氧化碳空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔天更換細(xì)胞培養(yǎng)液。在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)1、3、7d時(shí)采用CellCountingKit-8(CCK8，Japan)試劑盒對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。為了觀察HUVEC在材料上的粘附效果，將培養(yǎng)1、3d后的細(xì)胞樣品培養(yǎng)液吸出，并用4%多聚甲醛固定30min后，采用熒光素異硫氰酸酯(FITC)-鬼筆環(huán)肽浸泡材料上的細(xì)胞30min以染色細(xì)胞骨架，用DAPI浸泡10min以染色細(xì)胞核，之后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

　　2結(jié)果與討論

　　2.1CSH的組成與形貌

　　本研究通過水熱法成功制備了硅酸鈣納米線。通過XRD對(duì)CSH的物相進(jìn)行了表征并與標(biāo)準(zhǔn)卡片PDF#23-0125(Ca6Si6O17(OH)2)比較，結(jié)果顯示CSH的主要峰位均與Ca6Si6O17(OH)2保持一致。水熱法制備的CSH納米線具有一維結(jié)構(gòu)，平均直徑約20nm，長(zhǎng)度3~7μm。

　　2.2不同孔徑的電紡絲形貌

　　在未復(fù)合硅酸鈣納米線的情況下，通過調(diào)節(jié)電紡絲溶液濃度與電紡絲參數(shù)，分別制備了不同結(jié)構(gòu)的電紡絲纖維。隨著電紡絲溶液濃度的增大并相應(yīng)調(diào)節(jié)電壓、流速、針頭與基板等電紡絲參數(shù)后，可看出所制得的纖維直徑和相應(yīng)的孔徑都逐漸增大。 進(jìn)一步對(duì)電紡絲作纖維直徑與孔徑的測(cè)定和統(tǒng)計(jì)分析表明，纖維直徑與孔徑最小的5ES組，其纖維直徑和孔徑分別為0.24和0.68μm;纖維直徑與孔徑最大的22ES組，其纖維直徑和孔徑分別為10.27和50.46μm。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將采用孔徑最小的5ES和孔徑最大的22ES(分別命名為小孔徑組和大孔徑組)探索孔徑對(duì)離子釋放的影響。

　　2.3硅酸鈣復(fù)合電紡絲支架的形貌特征及潤(rùn)濕性能

　　本研究通過將電紡絲溶液與CSH進(jìn)行混紡制備了CSH@ES，在電紡絲纖維的同時(shí)電噴CSH顆粒，制備得到了CSH&ES，在已紡纖維表面電噴CSH顆粒制備了CSH//ES，在表面電噴了CSH的電紡絲表面再紡絲一層構(gòu)建CSH的夾心“三明治”結(jié)構(gòu)得到ES/CSH/ES。混紡的CSH@ES的電紡絲纖維表面光滑，無(wú)肉眼可見的CSH納米線分布于纖維表面，但通過TEM觀察可知，CSH均勻分散于纖維絲內(nèi)部。

　　由于電噴過程中，噴出的液滴中乙醇溶劑不斷揮發(fā)，CSH納米線發(fā)生團(tuán)聚，最終在基底上形成CSH團(tuán)聚體顆粒。同時(shí)電噴-電紡的CSH&ES，顆粒均勻分布于整個(gè)電紡絲支架體系內(nèi)，CSH團(tuán)聚體顆粒不僅分布于支架表面，還大量被電紡纖維纏繞鑲嵌于纖維支架中。而CSH//ES中，大量CSH團(tuán)聚體顆粒因靜電作用均勻吸附于電紡絲纖維表面，展示了CSH//ES支架表面的CSH團(tuán)聚體顆粒的放大照片，可以看到顆粒由大量細(xì)小的納米線團(tuán)聚而成，其直徑在1~2μm。而“三明治”結(jié)構(gòu)的ES/CSH/ES，因CSH位于夾心層位置，表面僅可觀察到光滑的電紡絲，無(wú)明顯的CSH暴露。

　　納米材料評(píng)職知識(shí)：納米化學(xué)論文參考文獻(xiàn)

　　3結(jié)論

　　本研究采用硅酸鈣高分子復(fù)合電紡絲膜材料研究了復(fù)合材料釋放SiO32-規(guī)律及其細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，可以得出如下結(jié)論：1)通過調(diào)節(jié)電紡絲溶液濃度獲得了不同孔徑大小的電紡絲支架;通過靜電紡絲與靜電噴霧技術(shù)的不同組合方式，制備得到了具有不同分布特點(diǎn)的硅酸鈣納米顆粒/高分子復(fù)合電紡絲材料;2)在相同陶瓷顆粒分布的情況下，電紡絲支架孔徑越小，離子釋放越緩慢;3)電紡絲支架在具有相同孔徑的情況下，硅酸鈣納米線分布于纖維絲內(nèi)部或被纖維絲緊密纏繞在支架內(nèi)部的復(fù)合電紡絲材料，由于疏水高分子包裹效應(yīng)導(dǎo)致離子釋放緩慢，具有緩釋特性;4)具有離子緩釋作用的小孔徑混紡及同時(shí)電紡-電噴陶瓷/高分子復(fù)合電紡絲材料可有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。

　　5)本研究通過調(diào)節(jié)孔徑和CSH的復(fù)合方式，發(fā)現(xiàn)小孔徑及混紡或同時(shí)電噴-電紡的復(fù)合形式對(duì)于離子緩釋效果最佳，驗(yàn)證了其在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面的優(yōu)勢(shì)，有望為新型創(chuàng)傷敷料的開發(fā)提供參考。但是，體內(nèi)的液體動(dòng)態(tài)流動(dòng)環(huán)境與體外模擬的液體環(huán)境存在較大差別，復(fù)合支架在體內(nèi)的最佳促修復(fù)離子釋放濃度也與體外存在一定差異，本研究得出的上述組織工程復(fù)合支架材料的規(guī)律還有待動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

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　　作者：包峰1,2，常江1,2