摘要:【目的】研究博落回提取物(Macleayacordataextract，MCE)的體外抗菌活性，為其在動物生產中的使用和添加提供試驗依據�！痉椒ā恳越瘘S色葡萄球菌、豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌為受試菌，采用抑菌圈法測定MCE對4種受試菌的抑制效果;運用微量稀釋法測定MCE對4種受試菌的最小抑制質量濃度(MIC)和最小殺菌質量濃度(MBC);通過時間—殺菌曲線法，測定MCE對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的殺菌效果�！窘Y果】MCE對4種革蘭氏陽性和陰性受試菌均有一定的抑制作用，抑制能力由強到弱依次為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌和銅綠假單胞菌，MIC分別為64、64、128和512μg/mL，MBC分別為128、128、256和>1024μg/mL;MCE對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的體外殺菌速率隨質量濃度升高而增快，其中8、4、2倍于MIC的MCE分別在2、12、24h可將2種受試菌完全清除，而1倍MIC的MCE在24h后仍有少量細菌存活�！窘Y論】MCE對受試菌均有一定的抑制效果，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的體外殺菌速率呈現質量濃度依賴性。

　　關鍵詞:博落回提取物;抗菌活性;最小抑菌質量濃度;最小殺菌質量濃度;時間—殺菌曲線

　　抗生素自問世以來在保護人類和動物健康方面發揮了重要作用。1950年代以來，養殖業開始使用亞治療劑量的抗生素作為促生長的飼料添加劑[1]。然而，自從抗生素促生長劑最初用于家畜生產以來，從家畜中分離出耐抗生素細菌的病例越來越多[2-4]。

　　抗生素的濫用、抗生素殘留以及細菌耐藥性的產生引起了世界范圍內的廣泛關注，很多國家或地區開始限制或完全禁止在飼料中添加抗生素，歐盟于2006年全面禁止抗生素類促生長劑的使用，美國和加拿大也正在逐步限制飼料抗生素的使用，中國于2020年7月1日開始全面禁止在飼料中添加抗生素。禁止在飼料中使用抗生素會導致家畜的感染率上升，從而降低畜產品的供應。為了維持全球養殖業的穩定發展和保證全球的肉類食品供應，研究和開發有效的抗生素替代技術，是飼料行業可持續發展的必經之路[5]。

　　研究人員正在加緊研究在不產生耐藥性的情況下提高動物健康的抗生素替代方案，其中藥用植物因其易降解無殘留、不易產生耐藥性和天然成分對環境污染小等獨特優勢引起了研究人員的關注。藥用植物在許多國家的醫學實踐中發揮著作用，如中國的傳統醫學、印度的阿育吠陀醫學和尤納尼醫學。直至今天，藥用植物的使用仍然很普遍，約有80%的世界人口依賴藥用植物產品和補充劑作為主要的藥物來源[6-7]。博落回(Macleayacordata)作為多年生草本藥用植物，生物堿是其主要活性成分[8]。到目前為止，已從博落回中鑒定和分離出147種生物堿，從化學結構上看，它們大多屬于異喹啉類生物堿[9]，是一種潛在的抗生素生長促進劑替代品[10]。

　　博落回在北美、東亞和歐洲國家均有生長，北美主要分布于密西西比河以東的溫帶北部地區，中國主要分布于山西、貴州、云南、江蘇和浙江等長江中下游地區[11]。幾十年來，在許多國家，博落回提取物已被廣泛用于飼養牲畜。在歐洲，博落回被歐洲食品安全局(EFSA)批準允許在動物生產[6]中作為飼料添加劑成分使用。在中國以血根堿和白屈菜紅堿為主要成分的產品已經開發成國家二類新中獸藥(2011新獸藥證字34號)和藥物飼料添加劑產品博落回散(獸藥添字180415250)[12]。

　　博落回作為重要的中草藥資源，其合理開發利用對于未來養殖減抗、飼料無抗具有重要的研究和使用價值[13]。關于博落回或其有效生物堿的體外抑菌試驗已有文獻報道，試驗菌種有細菌也有真菌，有些是動物生產中常見菌種，也有些是農業生產中的常見菌種，但專門針對養豬生產中常見細菌的報道較少，并且博落回提取物針對這些菌種的時間—殺菌效果尚未見報道。本研究對養豬業常見的4種細菌進行了體外抑菌試驗，并研究博落回提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的時間—殺菌效果，以期為更全面了解博落回的抗菌活性提供試驗數據，同時為其在動物生產中的添加使用提供試驗依據。

　　1材料與方法

　　1.1試驗材料

　　博落回提取物(M.cordataextract，MCE)：由本實驗團隊提取，經高效液相色譜法(HPLC)測定，其中的血根堿與白屈菜紅堿含量分別為45%和19%。受試菌株：大腸桿菌(Escherichiacoli，ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC25923)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis，ATCC13312)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，ATCC9027)均由昆明海關技術中心動物檢疫實驗室提供。

　　1.2試驗方法

　　1.2.1菌株活化和菌懸液制備

　　將含有保存菌種的磁珠凍存管從−80℃冰箱中取出，挑1粒磁珠放到含5mL營養肉湯培養基的細菌瓶中，放入控溫搖床培養箱(S130H，英國Stuart公司)中進行培養(250r/min，37℃)。培養約6~8h后將細菌瓶拿出，采用麥氏比濁管法用無菌生理鹽水將細菌培養物稀釋到0.5麥氏濁度，此時細菌密度約為1.0×108CFU/mL，按1∶100稀釋菌液至含菌量約為1.0×106CFU/mL，作為試驗菌液。

　　1.2.2抗菌活性測定

　　抗菌活性測定采用抑菌圈法，參照LEHRER等[14]和馬衛明[15]的具體方法進行。在無菌培養皿內傾倒15mL經高壓滅菌后冷卻至50℃的瓊脂培養基與100μL菌液，快速混合均勻，待瓊脂冷卻凝固后，在瓊脂板上用無菌打孔器打直徑為6mm的圓孔，孔間距大于2.5cm。在各孔中加入15μL不同質量濃度的MCE或5mg/mL鹽酸金霉素(chlortetracyclinehydrochloride，Solarbio公司)，并設陰性對照孔。

　　將培養皿倒置于37℃恒溫培養箱(ICP110，德國Memmert公司)中培養18h，各設3個重復，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值�？咕�活性用抑菌圈直徑表示，抑菌圈直徑=總直徑−孔直徑。最小抑菌質量濃度(minimalinhibitorymassconcentration，MIC)、最小殺菌質量濃度(minimalbactericidalmassconcentration，MBC)的測定和時間—殺菌曲線的繪制參考韓菲菲[16]、傅瑞春[17]和郭春娜[18]的方法進行。

　　1.2.3MIC和MBC測定

　　取無菌96孔平底微量培養板，每排測定1個菌種，每個菌種做3個重復。于每排的第2~11孔將初始質量濃度為4096μg/mL的MCE溶液進行2倍連續稀釋，于第2~12孔中加入菌懸液，使各細菌終密度約為5.0×105CFU/mL。第1孔只加培養液，作陰性對照，第12孔只加菌液和營養肉湯培養基，作測試組。將培養板置于37℃下保濕靜置培養18~24h;培養后觀察各孔底部是否有細菌沉淀產生，菌液清澈透明的孔為無細菌生長，未出現渾濁的最低質量濃度記為最小抑菌質量濃度，即該樣品的MIC。自沒有細菌生長的孔中取10μL培養液涂布于瓊脂平板上，每孔做3個重復，待完全吸收后，37℃下培養18~24h，仍無菌落形成的平板所對應的MCE質量濃度記為最小殺菌質量濃度(MBC)。

　　1.2.4MCE對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的時間—殺菌曲線繪制

　　本試驗測定0、8、4、2、1×MIC共5個質量濃度下MCE對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的時間—殺菌曲線。每個菌種各取5個1.5mL無菌離心管，各管加500μL菌液。

　　第1管不加MCE，在剩余4個管中將16×MIC的MCE進行2倍稀釋，使1~5號管中MCE的終質量濃度分別為0、8、4、2、1×MIC。將離心管置于37℃下振蕩培養，于0、1、2、3、6、12、24h自各管中分別取10μL菌懸液進行10倍系列稀釋5次，每個稀釋度取3×10μL菌懸液均勻涂布于營養瓊脂平板，待完全吸收后，37℃倒置培養;過夜培養后，取3個重復總菌落數在20~300個的稀釋質量濃度進行菌落計數，求CFU平均值，計算各時間點對應的每個離心管內的菌液質量濃度。原始菌液質量濃度=菌落個數×稀釋度×10CFU/mL。相同試驗重復3次。以作用時間點為橫坐標，每毫升菌懸液中所含細菌數(CFU)的常用對數為縱坐標、用GraphpadPrism8.0軟件繪制時間—殺菌曲線。

　　1.3數據處理與統計分析

　　試驗數據用Excel2007軟件進行初步整理后，結果以“平均值±標準差”表示，采用SPSS19.0軟件的one-wayANOVA進行單因素方差分析，差異顯著時用Duncan法進行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

　　2結果與分析

　　2.1MCE對4種受試菌的體外抗菌效果

　　不同質量濃度的MCE對4種受試菌的抑制能力各不相同，同等質量濃度的MCE對4種受試菌的抑制能力由強到弱依次是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌和銅綠假單胞菌，但本試驗選用的3種質量濃度的MCE對銅綠假單胞菌未表現出抑制能力。對除銅綠假單胞菌外的3種受試菌，隨著MCE質量濃度的升高，抑菌能力也相應增強，呈現出質量濃度依賴性，但3種質量濃度的MCE抑菌能力均低于5mg/mL金霉素。

　　2.2MCE對4種受試菌

　　MIC和MBC的影響MCE對不同受試菌的MIC和MBC有差異(表2)。其中，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC和MBC相同，分別為64和128μg/mL;對豬霍亂沙門氏菌的MIC和MBC分別為128和256μg/mL;對銅綠假單胞菌的MIC最高，為512μg/mL，測定MBC時發現質量濃度為1024μg/mL的MCE與其混合培養24h后仍不能將其殺滅。除銅綠假單胞菌外，其余3種受試菌的MBC均是其MIC的2倍。

　　3討論

　　腸道是營養物質消化、吸收和代謝的主要場所，是動物體最大的營養吸收器官。此外，腸道還具有屏障和免疫功能，能防止病原微生物的入侵，保護機體健康。腸道的健康水平關系動物整體健康和生產性能的發揮。腸道健康時微生物群和腸道處于共生平衡狀態，動物的消化吸收、生長發育和機體免疫不受影響[19]。

　　當這種平衡狀態被打破時，腸道內環境易受大腸桿菌等病原微生物的侵襲，導致仔豬抵御病原微生物能力下降，造成營養物質消化吸收障礙，引起仔豬腹瀉等腸道疾病的發生�？股�素被用于防控仔豬腹瀉�？股�素的濫用加速了耐藥菌株的產生，造成豬肉中抗生素的嚴重殘留，引起生態環境的污染[20]�？股�素的濫用，抗生素殘留、細菌耐藥性和環境污染等問題已經引起全世界的高度重視，“無抗”已經成為未來飼料業發展的趨勢。

　　伴隨著飼料行業“無抗”時代的來臨，新型綠色抗生素替代品已成為當今飼料行業的研究熱點。博落回作為全世界廣泛使用的藥用植物，被認為具有很好的抑菌效果[6-7,9]，在世界藥學實踐中既有使用地域的廣度，又有使用歷史的深度，MCE在仔豬生產中具有“替抗”的潛力�？咕�活性是博落回及其生物堿具有的眾多活性之一，也是在動物生產中備受重視的活性之一。

　　研究其抗菌效力，有助于在動物生產中的使用及添加。抑菌圈試驗、MIC與MBC測定和時間—殺菌曲線常用來檢驗藥物體外抗菌活性。其中，抑菌圈試驗是一種定性或半定量的方法，MIC與MBC是一種定量方法，在抗菌藥物質量濃度低于MIC時易誘導產生耐藥突變菌株，從而導致細菌耐藥發生[21];時間—殺菌曲線用于檢驗藥物隨時間變化對菌株的殺滅效果。本研究采用3種方法測定MCE體外抑菌的效果、質量濃度和速率。

　　MIC和MBC檢測結果與抑菌圈試驗結果總體趨勢一致，即相同質量濃度的MCE對這4種受試菌的抑制能力由強到弱依次是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌和銅綠假單胞菌。但本試驗選用的3種質量濃度MCE的抑菌能力均低于5mg/mL金霉素。MCE除了具有抑菌能力外，還具有炎性調節和免疫力調節等作用，因此，雖然在質量濃度接近的情況下，MCE抑菌能力不如專用抗生素效果好，但并不影響其作為飼料添加使用。KHIN等[6]研究了博落回提取物、血根堿和白屈菜紅堿對野生型、多重耐藥金黃色葡萄球菌的抗菌活性，結果表明：3~10μg/mL的血根堿和白屈菜紅堿對金黃色葡萄球菌均有完全抑制作用，其抗菌活性與氯霉素相同或更強。

　　趙東亮等[22]和王朝元等[23]研究均發現：博落回生物堿對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，趙東亮等[22]還發現：博落回生物堿對大腸桿菌無效果。胡貴麗等[24]研究發現：博落回血根堿對沙門氏菌高度敏感，對金黃色葡萄球菌中度敏感，對大腸桿菌低度敏感，其中，博落回血根堿對沙門氏菌的抑菌效果優于青霉素鈉。這些研究與本試驗的結果均有不同之處，可能是由于采用的試驗材料、添加質量濃度、有效生物堿含量以及藥物對照不同所致。KOSINA等[25]用S.aureusCCM3953、S.aureusCCM4223、P.aeruginosaCCM3955、E.coli(CCM4225和CCM3954)以及S.agalactiae作為受試菌研究了博落回不同部位提取物和其生物堿的抗菌活性，結果表明：對于大多數受試菌，博落回不同部位提取物隨著血根堿(SG)和白屈菜紅堿(CHE)質量濃度的升高，抗菌活性增強，但不同部位提取物的抗菌活性都低于血根堿和白屈菜紅堿本身的抗菌活性。他們在研究中還發現：SG和CHE對P.aeruginosa的抗菌活性較弱。

　　我們的試驗結果與這一發現一致，在抑菌圈試驗中所選的3種質量濃度的MCE均未對P.aeruginosa表現出抑制效果，而5mg/mL金霉素對P.aeruginosa有抑制活性，抑菌圈直徑為9.38mm，這也說明選用的3種質量濃度的MCE對P.aeruginosa的抑菌效果不如5mg/mL金霉素。測定MBC時發現：質量濃度為1024μg/mL的MCE與P.aeruginosa共同培養24h后雖表現出一定的抑制效果，但仍不能將其完全殺滅。

　　農業論文范例： 現代農業水稻病蟲害防治對策

　　4結論

　　MCE對4種革蘭氏陽性和陰性受試菌均有一定的抑制作用，抑制能力由強到弱依次為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌、銅綠假單胞菌，其中MCE對銅綠假單胞菌抑制能力最弱，MBC>1024μg/mL;2、4、6mg/mL的MCE抑菌能力均低于5mg/mL金霉素;MCE體外殺菌速率隨質量濃度升高而增快，呈現濃度依賴性。

　　[參考文獻]

　　張艷.雞腸道微生物的群落結構和功能基因與雞的健康養殖[D].北京:中國農業科學院,2018.

　　[1]ALJUMAAHMR,ALKHULAIFIMM,ABUDABOSAM.Invitroantibacterialefficacyofnon-antibioticgrowthpromotersinpoultryindustry[J].TheJournalofPoultryScience,2020,57(1):45.DOI:10.2141/jpsa.0190042.

　　[2]JOHNSONJR,KUSKOWSKIMA,MENARDM,etal.SimilaritybetweenhumanandchickenEscherichiacoliisolatesinrelationtociprofloxacinresistancestatus[J].TheJournalofInfectiousDiseases,2006,194(1):71.DOI:10.1086/504921.

　　[3]BUTAYEP,DEVRIESELA,HAESEBROUCKF.Antimicrobialgrowthpromotersusedinanimalfeed:effectsoflesswellknownantibioticsongram-positivebacteria[J].ClinicalMicrobiologyReviews,2003,16(2):175.DOI:10.1128/CMR.16.2.175.

　　作者：韓佃剛1,2#，楊宏清3#，信吉閣3，車麗濤4，張春勇1，楊云慶2，董　俊2，郭榮富1**