摘要鳥嘌呤四鏈體(G鄄四鏈體)是一種特殊的核酸二級結構，它可與高鐵血紅素結合，形成具有過氧化物酶活性的核酶;也可增強特殊結構染料的熒光強度。G鄄四鏈體作為功能核酸中的一種，具有性質穩定、特異性好、功能多樣等特點，被廣泛應用于各種生化分析中。本文對近年來G鄄四鏈體在生化分析中的研究和應用進展進行了評述，對其應用前景進行了展望。

　　關鍵詞G鄄四鏈體;功能核酸;核酶;生化分析;評述

　　1引言

　　隨著現代醫學的發展，特定核酸、蛋白、酶等的檢測，已成為某些疾病的直接或間接診斷指標[1~3]。而傳統的檢測方法，如高效液相色譜法、聚合酶鏈式反應(PCR)、免疫印跡法、電泳法[4~6]都涉及專業人員操作以及大型儀器的使用，存在檢測時間長、操作復雜、檢測靈敏度不高等問題。而比色法及熒光法[7，8]作為儀器分析中的經典方法，重復性好、操作簡單，易于試劑盒的開發。比色法或熒光法中如何高效穩定輸出信號的報告分子是分析方法的研究熱點。功能核酸鳥嘌呤四鏈體(G鄄四鏈體)的特殊理化性質，如與高鐵血紅素結合生成具有過氧化物酶活性的核酶、增強特殊結構染料的熒光強度等，可靈活地實現信號的穩定輸出。

　　利用G鄄四鏈體作為報告分子，與各種功能核酸或核酸信號放大方法聯用，可實現多種目標分子高特異性、高靈敏的檢測，為多種生化分析提供快速、簡便的檢測方法。本文首先介紹了G鄄四鏈體的分類和功能，以及利用其與金屬離子作用引起的結構變化而導致性質的變化，結合特定染料或藥物分子的性質，與其它功能核酸聯用等，在小分子、蛋白質、酶、金屬離子、目標DNA或RNA檢測、細胞成像及癌癥治療等方面應用的研究進展進行了評述。

　　2G鄄四鏈體簡介

　　2.1G鄄四鏈體的分類

　　鳥嘌呤平面是由4個鳥嘌呤通過氫鍵構成的方形平面，G鄄四鏈體由幾個鳥嘌呤平面堆疊而成，其結構由處于平面之間的金屬離子形成穩定金字塔結構[9]。中心穩定離子為一價或者二價金屬離子，其中K+是最常見的金屬離子，金屬離子的大小決定G鄄四鏈體結構的穩定性[10，11]。根據形成G鄄四鏈體的DNA或RNA鏈的數目分類，由一條鏈形成四鏈體結構稱為分子內G鄄四鏈體，多條鏈構成的稱為分子間G鄄四鏈體。根據鏈的走向可分為3類:當四條鏈的方向均相同時，為平行結構;當兩條鏈方向相同，另兩條鏈與其方向相反時，為反平行結構;其它情況稱為混合平行結構[12，13]。

　　G鄄四鏈體的結構可通過圓二色譜測定。所有的G鄄四鏈體結構在210nm處都有一個正的特征吸收峰。平行結構的G鄄四鏈體在240nm處有一個負吸收峰，在260nm附近有一個正吸收峰;反平行結構的G鄄四鏈體在260nm處有一個負吸收峰，在290nm處有一個正吸收峰[14]。G鄄四鏈體的結構主要取決于DNA或RNA的序列、核酸鏈的濃度和穩定離子的種類[15]。以穩定離子種類為例，Kong等[16]發現同樣的序列在K+或Na+條件下形成不同的結構，他們系統研究了以T為間隔的堿基序列(5憶鄄G3TiG3TjG3TkG3鄄3憶)。當T的總數目臆5時，在100mmol/L的K+和Na+條件下均形成平行結構;當T的總數目為6~7時，在K+存在下依然形成平行結構G鄄四鏈體;而Na+穩定時折疊成混合平行結構。Li等[17]發現，PW17在K+存在下形成平行結構G鄄四鏈體，而Pb2+條件下為反平行結構。

　　2.2G鄄四鏈體的性質

　　2.2.1G鄄四鏈體構成的模擬酶

　　具有酶催化活性的DNA或RNA稱為核酶(DNAzyme/RNAzyme)[18]。目前已發現具有切割或連接DNA/RNA、模擬過氧化物酶等活性的核酶[19~21]。G鄄四鏈體與輔因子高鐵血紅素(Hemin)結合形成具有過氧化物酶活性的核酶，可催化多種底物的氧化，包括ABTS、TMB、Am鄄plexRed、魯米諾等。這種核酶是Travascio等[22]在篩選可特異結合N鄄甲基化卟啉IX的核酸適配體時發現的，而后進一步優化得到18個堿基的核酸適配體PS2.M。PS2.M形成的G鄄四鏈體與Hemin構成的核酶，其催化活性是Hemin單獨存在時的250倍[23]。此類核酶的催化反應機理與辣根過氧化物酶類似，G鄄四鏈體模擬辣根過氧化物酶中的組氨酸殘基為Hemin中的Fe提供一個軸向配體和一個疏水環境，有利于OO的異裂。

　　G鄄四鏈體為Hemin提供一個平面結構，有利于氫的交換[24~26]。目前，對于此類核酶的活性調控主要有3種方法:(1)是改變G鄄四鏈體本身的序列，從而改變其拓撲結構來影響其性質;(2)是改變穩定中心離子，從而改變G鄄四鏈體的構型而改變Hemin的結合情況;(3)是在G鄄四鏈體的序列末端增加腺嘌呤，可將其活性提高至原有活性的4倍[24]。另外，還可加入ATP來穩定催化過程中產生的自由基，提高催化效率[27]。

　　2.2.2G鄄四鏈體增強熒光的染料

　　G鄄四鏈體可結合一些特定的熒光染料，極大地增強染料自身的熒光強度，例如卟啉衍生物、酞菁染料、結晶紫、三苯甲烷等染料。熒光增強的原理是G鄄四鏈體可為染料分子提供一個疏水環境，防止熒光分子的相互靠近導致的自淬滅現象。結晶紫(Crystalviolet，CV)是一種三苯甲烷染料，堆積在兩個鳥嘌呤平面之間，可區分平行和反平行G鄄四鏈體。反平行G鄄四鏈體的Loop環可結合CV使其不受溶劑的影響，使得熒光大大增強。而平行G鄄四鏈體側鏈的Loop環不能結合CV，使得CV的熒光增強明顯弱于結合反平行G鄄四鏈體的CV[16]。硫磺素T(ThioflavinT，ThT)是一種水溶性染料，可特異性地識別并結合G鄄四鏈體，結合后其熒光強度可增大2500倍[28]。

　　(Z)鄄4鄄(3，5鄄difluoro鄄4鄄hydroxybenzylidene)鄄1，2鄄dimethyl鄄1H鄄imidazol鄄5(4H)鄄one(DFHBI)是一種可與RNAG鄄四鏈體結合并對其進行特異性識別的染料分子，結合后可模擬綠色熒光蛋白的熒光，用于細胞中的RNA成像[29]。在此基礎上，Feng等[30]報道了6種與紅色熒光蛋白生色團類似的染料分子，與G鄄四鏈體結合后發出的熒光光譜范圍幾乎覆蓋紅色熒光蛋白的發射光譜，并且有較高的熒光量子產率，以此可模擬紅色熒光蛋白，實現細胞內成像。

　　2.2.3G鄄四鏈體降低電信號的電化學活性分子

　　亞甲基藍(Methyleneblue，MB)是一種帶正電的芳香結構，是一種常用的電化學信號分子。Zhang等[31]研究發現，由于G平面的末端仔鄄仔堆疊效應，MB可競爭Hemin結合到G鄄四鏈體上，顯著減少擴散到電極表面的MB，從而使得電流下降。

　　3G鄄四鏈體在生化分析中的應用

　　3.1小分子與蛋白質的檢測

　　核酸適配體是經體外篩選，可高特異性和高親和力地識別并結合目標分子的單鏈DNA或RNA。以G鄄四鏈體為信號分子檢測小分子和蛋白質的傳感分析方法大多與核酸適配體單元聯用。如Willner研究組[32]將ATP的核酸適配體連接上一段G鄄四鏈體序列作為識別探針，另一條DNA與之部分雜交形成中間留有環狀結構的雙鏈結構。當ATP存在時，核酸適配體與ATP結合，識別探針從雙鏈上解離下來，釋放出的G鄄四鏈體與Hemin形成DNAzyme，催化底物反應。利用類似的設計，可實現可卡因、溶菌酶、細胞因子[33~35]等的檢測。

　　在此類設計中，要求仔細篩選G鄄四鏈體和核酸適配體中被雙鏈結構封閉的堿基數目，使得在有目標分子條件下G鄄四鏈體可從雙鏈解離產生信號，而無目標分子時，G鄄四鏈體不會自動解離產生較高的背景信號。值得注意的，凝血酶有兩種長度分別為15及29個堿基的核酸適配體，且都可形成G鄄四鏈體結構。Li等[36]利用凝血酶的核酸適配體結合凝血酶后，可促進核酸適配體形成的G鄄四鏈體，并更好地結合Hemin以提高DNAzyme的催化活性，從而實現凝血酶的檢測。

　　3.2酶活性的分析

　　酶是生命過程中不可或缺的一部分，各種疾病的發生都與酶活性的異常相關，因此酶活性的檢測是生化分析中的重要內容。以G鄄四鏈體為信號分子分析酶活性的報道中，檢測對象大多是以核酸為底物的酶。以下介紹幾種在疾病診斷、分子生物學中有重要意義的酶的檢測方法。

　　3.2.1T4多聚核苷酸激酶(T4poly鄄nucleotidekinase，T4PNK)T4PNK是一種雙功能酶，可移除3憶磷酸基團以恢復3憶羥基基團，也可實現5憶磷酸化。Liu等[37]報道了一種基于G鄄四鏈體鄄DNAyzme比色檢測T4PNK的方法。在該體系中，設計了兩條探針，一條是3憶磷酸化的引物，一條是封閉有G鄄四鏈體序列的發夾探針。

　　當T4PNK存在時，引物的3憶磷酸被去磷酸化，生成3憶羥基，此時聚合酶可將引物延伸打開發夾，釋放G鄄四鏈體序列。該方法可檢測低至0.01U/mL的T4PNK。基于T4PNK5憶磷酸化活性，裴仁軍研究組[38]設計了一種裂分的G鄄四鏈體DNAzyme檢測體系，實現最低濃度0.014U/mL的T4PNK的檢測。

　　3.2.2核酸外切酶芋(Exonuclease芋，Exo芋)Exo芋具有從3憶鄄5憶方向切割DNA的活性，在DNA復制等生理過程中有重要意義。Leung等[39]設計了發夾莖部含有G鄄四鏈體結構的探針用于分析Exo芋的活性。核酸內切酶芋從發夾莖部的3憶端切斷，最后剩下的單鏈部分即為G鄄四鏈體，與CV結合后大大增加其熒光，以此來檢測核酸內切酶芋的活性。

　　3.2.3DNA連接酶(DNAligase)DNA連接酶能催化DNA分子內或分子間毗鄰的5憶磷酸基團和3憶羥基基團形成磷酸二酯鍵，將兩段相鄰的DNA拼合成一條完整的DNA鏈。He等[40]利用DNA連接前后對于發夾結構的改變，開發了基于G鄄四鏈體檢測DNA連接酶的方法，最低可檢測0.2U/mL的DNA連接酶。

　　3.3金屬離子的檢測目前，金屬離子污染問題日趨嚴重，開發高效檢測金屬離子的方法，成為研究者關注的熱點。以G鄄四鏈體為信號分子的檢測方法可簡單、高效、便捷地檢測金屬離子，按其檢測原理可分為三類。

　　3.3.1特異性穩定G鄄四鏈體的金屬離子利用中心離子穩定的G鄄四鏈體構型不同而實現檢測。Li等[17]報道了一種基于G鄄四鏈體結構變化檢測Pb2+的方法。PS2.M在K+存在時折疊成平行結構的G鄄四鏈體，與Hemin結合后顯示較高的過氧化物酶活性。在Pb2+存在時，PS2.M折疊成反平行的G鄄四鏈體，不利于與Hemin的結合，過氧化物酶活性下降。根據K+與Pb2+穩定的G鄄四鏈體的催化活性的差異，可實現二者的檢測(圖4A)。利用此原理，還可實現Tb3+[51]、Ba2+[52]等的檢測。此外，還有一類特殊的例子，如利用Cu+能高效催化疊氮基團與炔基的Click反應，使得兩條裂分的DNA連接后能形成G鄄四鏈體結構，加入取代鏈后可將完整的G鄄四鏈體序列置換下來，實現CV的熒光增強，對Cu2+進行檢測，最低檢測濃度可達到65nmol/L[53]。

　　3.3.2與堿基作用的特定金屬離子利用特定金屬離子與堿基的作用實現金屬離子檢測，如T鄄Hg2+鄄T，C鄄Ag+鄄C結構的形成。其中一類是基于金屬離子與堿基作用后抑制G鄄四鏈體的形成(Turn鄄off模式)，另一類是促進G鄄四鏈體的形成(Turn鄄on模式)。Willner研究組報道了一種基于T鄄Hg2+鄄T的分子機器檢測Hg2+。Li等[55]報道了基于C鄄Ag+鄄C作用下，拉近兩條裂分的G鄄四鏈體序列，構成完整G鄄四鏈體檢測Ag+，檢出限為2.5nmol/L。

　　4總結與展望

　　G鄄四鏈體作為一種功能核酸，具有性質穩定、特異性好、功能多樣等特點，被廣泛用于各種生化分析中。目前基于G鄄四鏈體開發的分析檢測方法包括比色法、熒光法、電化學、電化學發光等多種形式。由于G鄄四鏈體結構的特殊性，其被用于細胞成像以及癌癥治療等方面的研究。G鄄四鏈體未來主要的發展趨勢可能有以下方面:(1)提高模擬過氧化物酶的活性。目前的研究結果表明G鄄四鏈體構成的核酶雖然可通過前文方法提高活性，但是對比蛋白酶的活性還是有很大差距。因此，提高核酶活性是重要的研究內容。(2)特異性識別的紅外染料的合成。隨著成像技術的發展，普通熒光成像面臨著高背景、易被光漂白等應用方面的限制。開發組織穿透能力高，結合G鄄四鏈體后能顯著增強熒光的染料，可拓展G鄄四鏈體在細胞成像方面的應用。(3)便攜式傳感器的開發與應用。目前，基于G鄄四鏈體的分析傳感方法多局限于實驗室應用，開發便攜式(如試紙類、數顯類)直讀型便攜式商用傳感器將是未來的研究趨勢。

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