《水解貝殼硬蛋白美白功效的初步研究》論文發表期刊：《藥物生物技術》；發表周期：2021年03期

《水解貝殼硬蛋白美白功效的初步研究》論文作者信息：陸垚嘉，女，浙江湖州人，大學本科，浙江歐詩漫生物股份有限公司技術研發部技術員，主要方向: 珍珠應用基礎研究。王菁，女，浙江蘭溪人，碩士研究生，浙江歐詩漫生物股份有限公司技術研發部副部長，主要方向: 珍珠應用基礎研究。

　　摘 要 研究水解貝殼硬蛋白( Shell protein extract，SPE) 對 B16 細胞內黑色素含量及酪氨酸酶活性的影響。培養 B16 細胞，構建 α-黑素細胞刺激素( α-MSH) 誘導細胞的黑色素高表達量細胞模型。SPE 作用 B16 細胞， CCK8 法測定細胞活力; NaOH 裂解法和 L-DOPA 氧化法測定細胞內黑色素含量和酪氨酸酶活性的變化。結果顯示，SPE 在 1，0. 1 g /L 時，對細胞無毒性作用; 與陽性對照熊果苷相比，SPE 對黑色素含量和酪氨酸酶活性的抑制作用與熊果苷基本一致，表明 SPE 的美白效果與普遍認可的美白添加劑熊果苷的效果一樣。

　　關鍵詞 水解貝殼硬蛋白; B16 細胞; 黑色素; α-黑素細胞刺激素; 酪氨酸酶

　　當前化妝品領域，美白是消費者追求的熱門話題，目前市場上常見的美白活性物質有熊果苷、曲酸、甘草提取物等。其中曲酸的副作用比較強，對細胞有一定的毒性，長期使用可能會致癌"：酪氨酸是一種廣泛存在于人體中的氧化酶2，它能把酪氨酸氧化成為多巴醒，再經過一系列的生化過程，最終生成為黑色素四。黑素細胞中酪氨酸酶在黑色素的生成過程中起到催化作用，是主要的限速酶[，如果添加外界物質在一定程度上抑制酪氨酸酶的活性，就可以減少黑色素的生成，起到美白的效果。熊果苷和甘草提取物的美白效果都是通過抑制酪氨酸酶活性，從而達到減少黑色素含量，最終起到美白效果[5]，這一類美白活性物質比較受消費者的喜歡。

　　a-MSH通過與黑色素細胞表面黑色素1受體(Melano-

　　cortin-l recptor，MC-R)的結合，促進黑色素細胞樹突的形成、酪氨酸酶表達量增加以及活性增強、黑色素細胞的增殖，最終促進黑色素的生成，因此在一些美白活性物質的實驗中，a-MSH通常做為黑色素合成的刺激素。

　　珍珠主要由95%的碳酸鈣和5%的角殼蛋白組成回，通過對珍珠的深加工發現珍珠在美容方面具有美白、抗氧化等功效。如張麗華等[發現珍珠提取物具有很顯著的體外抗氧化能力;楊安全等"1發現珍珠提取物能抑制B16F10細胞的酪氨酸酶活性，且能減少黑色素的生成，說明珍珠提取物有美白的效果。珍珠母和珍珠同源生長，除碳酸鈣晶型有所區別外，其中的有機質例如蛋白質相似度較高，目前珍珠母中蛋白提取物的功效研究還沒有報道過，作者推測珍珠母提取物有和珍珠提取物相似的功效，本文以B16為受試細胞，采用CCK8法研究珍珠母中不同濃度的水解貝殼硬蛋白對細胞的增殖影響，初步研究了水解貝殼硬蛋白對酪氨酸酶活性以及黑色素含量的影響，為新一代美白化妝品原料的開發提供理論依據，也為珍珠母的深加工開發利用提供數據支持。

　　1材料

　　1.1 樣品來源

　　水解貝殼硬蛋白(SPE)：三角帆蚌貝殼于研磨機中研磨成粉，溶解后脫鈣取貝殼硬蛋白，進行水解，過濾取上清液后凍干，蛋白質量分數45%~55%。

　　1.2 藥品與試劑

　　胎牛血清FBS，購自浙江天杭生物科技股份有限公司;PBS緩沖液(pH =7.4)，購自北京索萊寶科技有限公司;

　　0.25%胰蛋白酶(0.02%EDTA)，青鏈霉素溶液，DMEM培養液，均購自杭州科易生物技術有限公司：CCK-8，Triton X-100，均購自美國Sigma公司;多巴溶液(L-DOPA)，熊果苷，均購自阿拉丁;二甲基亞砜(DMSO)，乙醇，乙醚，氫氧化鈉，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

　　1.3儀器

　　酶標儀，美國MD公司：C02培養箱(BB150)，-81 ℃冰箱，賽默飛世爾科技公司; 倒置顯微鏡( CKX41) ，奧林巴斯(中國)有限公司。

　　1.4細胞株

　　B16黑色瘤細胞株購買于上海中科院細胞所。

　　2方法

　　2.1 B16細胞的培養和分組

　　B16細胞置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養液中培養，培養條件為37 ℃.5%C02培養，取對數生長期的細胞用于后續的實驗。實驗分組：空白對照組(Con-

　　trol)，a-MSH模型組(Model)，陽性對照組(a-MSH誘導+

　　熊果苷1.36 g/L)，SPE組(a-MSH誘導+SPE1，0.1 g/L)。

　　2.2 B16細胞活力的測定實驗

　　采用CCK8法測定B16細胞的活力。取B16細胞調節至5 x 10個/mL，配成單細胞懸液，加入96孔板，每孔100 L，置于37 ℃.5%co2培養箱中培養24 h后，按照分組加入不同藥物，每組6個平行，培養24 h后去上清液，用PBS清洗一遍，每孔加入100 uL培養液，再每孔加入10 ul CCK8溶液，放入培養箱作用2h后，在酶標儀上，以雙波長450 nm和650 nm測定各孔的吸光值。B16細胞的細胞存活率計算方法：

　　2.3 B16細胞內黑色素含量的測定實驗[2

　　采用NaOH裂解法測定B16細胞內黑色素的含量。按照5 x 10"個/mlL.的細胞密度進行6孔板接種，每孔加入2 ml，培養液，37 ℃，5%CO2培養箱，培養24 h后，按照分組加入不同藥物，每組3個平行，37 ℃，5%C02培養箱培養24 h后棄上清，使用胰酶消化收集細胞，加入300 L，1 mol/L NaOH(含10%DMSO)，于80℃水浴反應40 min，使黑素顆粒完全溶解，收集到96孔板，每孔200 uL，于酶標儀波長405 nm處測各孔的吸光值。B16細胞內黑色素含量抑制率計算方法：

　　2.4 B16細胞內酪氨酸酶活性的測定實驗[3

　　采用L-DOPA氧化法測定B16細胞內酪氨酸酶的活性。按照5 x 10"個/ml.的細胞密度進行96孔板接種，每孔加入100 山培養液，37 ℃，5%co2培養箱，培養24 h后，按照分組加入不同藥物，每組6個平行，37℃，5%co2培養箱培養24 h后，棄去上清液，用PBS洗滌3次，每孔加質量分數為1%的辛基酚聚氧乙烯醚(Triton X400)溶液50 L，迅速置于-81 ℃凍存30 min，隨后室溫融化使細胞完全破裂，37 ℃預溫5 min后加入質量分數為1%的L-

　　DOPA溶液10 L，37 ℃反應2 h，在酶標儀490 nm處測其吸光值。B16細胞內酪氨酸酶活性抑制率計算方法：

　　2.5 數據分析

　　數據采用Graphpad Prism8軟件進行分析，以標準差

　　(i±s)表示，用1Hest檢驗差異的顯著性，P<0.05表示具有顯著性。

　　3結果

　　3.1 SPE對B16細胞活力的影響由圖1可知，B16細胞經不同濃度的SPE(1，0.1 g/L)

　　作用24 h后，SPE對細胞的生長沒有明顯的影響，與空白對照組相比(Control)，統計學上無顯著性差異(P>0.05)。

　　因此表明，后續實驗可用這兩個濃度進行研究。

　　3.2 SPE對a-MSH誘導的B16細胞黑色素含量的影響

　　由圖2可知，B16細胞經過a-MSH的誘導，細胞內黑色素的含量明顯增加(P<0.05)，表明a-MSH誘導的細胞黑色素高表達量模型建立成功。與a-MSH模型組相比，陽性對照熊果昔作用后，細胞內黑素含量明顯降低，生成抑制率為

　　(15.16 ±2.42)%：而SPE組，當作用質量濃度為1，0.1 g/L時，對黑色素含量的生成抑制率分別為(17.30±4.47)%

　　(11.88 1 10)%，與a-MSH模型組相比，具有顯著性差異

　　(P <0.05，P<0.01)。結果表明，當SPE質量濃度為1g/L時對黑色素生成抑制作用與陽性對照熊果苷基本一致。

　　3.3 SPE對a-MSH誘導的B16細胞酪氨酸酶活性的影響

　　由圖3可知，SPE和陽性對照熊果苷對B16細胞內酪氨酸酶活性都呈現出明顯的抑制作用。a-MSH模型組相比，SPE在1，0.1 g/L時，酪氨酸酶活性的抑制率分別為

　　(15.96 ±6.72)%、(23.90 ±8.45%);而陽性對照熊果苷的抑制率為(23.86±7.04)%。結果顯示，SPE對B16細胞內酪氨酸酶活性的抑制作用與陽性對照熊果苷基本一致。

　　4討論

　　研究以B16細胞為研究對象，構建a-MSH誘導細胞的黑色素高表達量細胞模型。首先研究SPE對細胞活力的影響，結果顯示，SPE在質量濃度為1，0.1 g/L時，對細胞無毒性作用，具有較高的安全性，可用這兩個濃度進行后續的實驗研究。以熊果苷為陽性對照，本研究檢測了SPE對a-

　　MSH的細胞內黑色素含量及酪氨酸酶活性的影響。結果顯示，細胞經a-MSH的誘導，細胞內黑色素含量和酪氨酸酶活性明顯增加，與空白對照組相比，具有顯著性差異，表明a-MSH誘導的細胞黑色素高表達量模型建立成功。SPE對a-MSH誘導細胞內黑色素含量和酪氨酸酶活性均有抑制作用，與陽性對照熊果苷相比，SPE對黑色素含量和酪氨酸酶活性的抑制作用和熊果苷基本一致。研究中SPE主要通過抑制酪氨酸酶的活性來起到降低黑色素的含量，至于SPE的具體成分分析、具體哪種成分在起作用以及具體通過哪種信號途徑起到降低黑色素的含量，這些問題在今后的研究中會繼續挖掘。研究表明，SPE作為一種化妝品原料，在一定濃度范圍內具有一定的生物安全性，其美白效果與普遍認可的美白添加劑熊果苷基本上一致。

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