《鳥分枝桿菌MAV-2052蛋白的生物信息學分析》論文發表期刊：《中國病原生物學雜志》；發表周期：2021年02期

《鳥分枝桿菌MAV-2052蛋白的生物信息學分析》論文作者信息：高婧華(1990-)，女，云南人，在讀碩士研究生。主要研究方向：非結核分枝桿菌的感染與免疫。

　　【摘要】目的 應用生物信息學分析軟件預測鳥分枝桿菌MAV-2052蛋白的結構和功能。方法 利用在線uniprot蛋白數據庫、ProtParam蛋白分析網站、在線Protcale，TMHMM(TMHMM Server V 2.0)和SignalP 5.0，Softberry和PSORTII Server，以及SOPMA和SWISS-MODEL等生物信息學預測軟件對MAV-2052蛋白的理化性質、疏水性分析、信號肽、跨膜區、亞細胞定位及二級結構進行分析預測并對其三級結構進行模型構建;對蛋白磷酸化位點進行預測，運用uniprot蛋白數據庫的Blast工具對氨基酸進行比對，采用MEGA-X軟件構建進化樹。結果 MAV-2052基因全長933 bp，編碼310個氨基酸的蛋白質。該蛋白與鳥分枝桿菌亞型起源于同一物種，與結核分枝桿菌的半胱氨酸合酶k，同源性較高。MAV-2052為穩定的疏水性蛋白，無跨膜區、無信號肽;預測該蛋白亞細胞定位在細胞質中，蛋白序列中存在13個絲氨酸磷酸化位點，二級結構以r螺旋為主且有兩個結構域;三級結構模型顯示該蛋白可形成同源二聚體，但無其他配體結合空間位置。MAV-2052蛋白為半胱氨酸合酶，屬于半胱氨酸合酶/半胱氨酸3合成酶家族，是調控鳥分枝桿菌生長中的重要蛋白之一。結論 生物信息學預測鳥分枝桿菌MAV-2052為半胱氨酸合成酶，是調控細菌生長的重要蛋白，可為鳥分枝桿菌的靶向治療提供新思路

　　【關鍵詞】鳥分枝桿菌;結構;功能;生物信息學分析

　　[ Abstract] Objective To use bioinformatic analysis software to predict the structure and function of the Mycobacteri um avium mav-2052 protein Methods The uniprot database online, the protein analysis website ProtParam, ProtScale online. TMHMM (TMHMM Server V 2.0). Softberrv. SienalP 5.0. PSORT II Server, SOPMA, and SWISS-MOD-El were used to predict biological information such as the physical and chemical properties and hydrophobicity of the mav-2052 protein, to analyze its signal peptides, transmembrane regions, and subcellular localization, to predict its sec ondary structure, and to model its tertiary structure. The website was used to predict the protein's phosphorylation sites, the Blast tool of the uniprot protein database was used to compare amino acids, and the software MEGA-X was used to construct an evolutionary tree. Results mav-2052 is a protein encoding 310 amino acids. It originates from the same species as M. avium subtypes and has is highly similar to cysteine svnthase K1 of M. tuberculosis. mav-2052 is a stable hydrophobic protein with no transmembrane regions and no signal peptides. The protein is predicted to be located in the cytoplasm, and there are 13 serine phosphorylation sites in the protein sequence. The protein's secondary structure is dominated by alpha helices and it has two domains. mav-2052 is a cysteine synthase that belongs to the cysteine synthase/cysteine beta synthase family, and it is an important protein for regulation of the growth of M. avium. Conclusion Bioinformatics predicted that the M. avium mav-2052 protein is a cysteine synthase. This protein plays an important role in regulating the growth of M. avium. These findings may provide new insights in targeted therapy for M. avium

　　[ Key words] Mycobacterium avium; structure; function: bioinformatic analysis

　　鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium，MAV)屬于細胞內寄生菌，是非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)中的一種[1]。研究表明，在健康人中也能建立慢性MAV感染，且多種抗分枝桿菌的藥物治療效果不佳，即使延長18~24個月的療程也無法將其徹底清除[2);另一方面，MAV的感染在免疫系統受損的個體中引起NTM感染事件越來越多，且尚未制定出有效根除MAV感染的藥物治療方案和預防MAV感染的疫苗[2]，因此，研發有效的抗MAV的藥物及疫苗是當務之急.MAV-2052是參與MAV致病的重要蛋白之一，其主要功能是調節宿主細胞氧化與抗氧化的平衡和影響1-半胱氨酸的生成。為進一步了解MAV-2052的結構和功能，本研究從蛋白序列查詢、理化性質、多序列對比、疏水性分析、跨膜結構、信號肽分析和亞細胞定位等對MAV-2052蛋白進行生物信息預測和分析。

　　材料與方法

　　1數據資料的獲取

　　通過美國國家生物技術信息中心NCB數據庫對MAV-2052進行序列分析;登陸Uniprot蛋白數據庫和NCBI網站，獲取MAV菌株MAV-2052蛋白的基因序列和氨基酸序列。鳥型分枝桿菌亞種(M.avium subsp)、海德堡分枝桿菌(M.heidelbergense)、結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、新宿分枝桿菌(M.shinjukuense)、嗜血分枝桿菌(M.haemophilum)核苷酸序列和氨基酸序列也同樣從Uniprot蛋白數據庫和NCB網站獲取。

　　2生物信息學分析

　　運用在線uniprot蛋白數據庫的Blast工具，將MAV-2052基因序列與同源性較高的核苷酸進行比對;比對后的氨基酸運用MEGA-X構建進化樹;登錄在線ProtParam蛋白分析網站對MAV-2052蛋白進行理化性質分析;運用Protcale對蛋白進行疏水性分析;運用TMHMM(TMHMM Server V 2.0)和Sig-

　　nalP 5.0對MAV-2052進行跨膜和信號肽預測;運用Softberry和PSORT Il Sserver對MAV-2052細胞定位分析;利用SOPMA和SWISS-MODEL對MAV-2052蛋白進行二、三級結構預測;對蛋白磷酸化位點進行預測。

　　結果

　　1 MAV-2052基因的特征

　　GenBank 中MAV-2052基因的登錄號為ABK67788.1，基因又名：Cysk，基因序列全長933 bp，編碼310個氨基酸的蛋白質。

　　2 MAV-2052蛋白的同源性預測和進化樹構建

　　經氨基酸序列比對，鳥型分枝桿菌亞種(Mycobacterium avium subsp)、海德堡分枝桿菌、結核分枝桿菌、新宿分枝桿菌、嗜血分枝桿菌與MAV 104菌株MAV-2052蛋白的序列覆蓋區域分別是：100%、91%，88.4%，86.5%和84.8%。多重序列比對分析顯示，以上物種氨基酸之間的序列相似度較高(圖1)用MEGA-X軟件構建系統進化樹，結果見圖2。鳥型分枝桿菌亞種與MAV起源于同一物種，同源性較高。

　　鳥分枝桿菌MAV-2052蛋白的生物信息學分析

　　高婧華(1990-)，女，云南人，在讀碩士研究生。主要研究方向：非結核分枝桿菌的感染與免疫。

　　【摘要】目的 應用生物信息學分析軟件預測鳥分枝桿菌MAV-2052蛋白的結構和功能。方法 利用在線uniprot蛋白數據庫、ProtParam蛋白分析網站、在線Protcale，TMHMM(TMHMM Server V 2.0)和SignalP 5.0，Softberry和PSORTII Server，以及SOPMA和SWISS-MODEL等生物信息學預測軟件對MAV-2052蛋白的理化性質、疏水性分析、信號肽、跨膜區、亞細胞定位及二級結構進行分析預測并對其三級結構進行模型構建;對蛋白磷酸化位點進行預測，運用uniprot蛋白數據庫的Blast工具對氨基酸進行比對，采用MEGA-X軟件構建進化樹。結果 MAV-2052基因全長933 bp，編碼310個氨基酸的蛋白質。該蛋白與鳥分枝桿菌亞型起源于同一物種，與結核分枝桿菌的半胱氨酸合酶k，同源性較高。MAV-2052為穩定的疏水性蛋白，無跨膜區、無信號肽;預測該蛋白亞細胞定位在細胞質中，蛋白序列中存在13個絲氨酸磷酸化位點，二級結構以r螺旋為主且有兩個結構域;三級結構模型顯示該蛋白可形成同源二聚體，但無其他配體結合空間位置。MAV-2052蛋白為半胱氨酸合酶，屬于半胱氨酸合酶/半胱氨酸3合成酶家族，是調控鳥分枝桿菌生長中的重要蛋白之一。結論 生物信息學預測鳥分枝桿菌MAV-2052為半胱氨酸合成酶，是調控細菌生長的重要蛋白，可為鳥分枝桿菌的靶向治療提供新思路

　　【關鍵詞】鳥分枝桿菌;結構;功能;生物信息學分析

　　[ Abstract] Objective To use bioinformatic analysis software to predict the structure and function of the Mycobacteri um avium mav-2052 protein Methods The uniprot database online, the protein analysis website ProtParam, ProtScale online. TMHMM (TMHMM Server V 2.0). Softberrv. SienalP 5.0. PSORT II Server, SOPMA, and SWISS-MOD-El were used to predict biological information such as the physical and chemical properties and hydrophobicity of the mav-2052 protein, to analyze its signal peptides, transmembrane regions, and subcellular localization, to predict its sec ondary structure, and to model its tertiary structure. The website was used to predict the protein's phosphorylation sites, the Blast tool of the uniprot protein database was used to compare amino acids, and the software MEGA-X was used to construct an evolutionary tree. Results mav-2052 is a protein encoding 310 amino acids. It originates from the same species as M. avium subtypes and has is highly similar to cysteine svnthase K1 of M. tuberculosis. mav-2052 is a stable hydrophobic protein with no transmembrane regions and no signal peptides. The protein is predicted to be located in the cytoplasm, and there are 13 serine phosphorylation sites in the protein sequence. The protein's secondary structure is dominated by alpha helices and it has two domains. mav-2052 is a cysteine synthase that belongs to the cysteine synthase/cysteine beta synthase family, and it is an important protein for regulation of the growth of M. avium. Conclusion Bioinformatics predicted that the M. avium mav-2052 protein is a cysteine synthase. This protein plays an important role in regulating the growth of M. avium. These findings may provide new insights in targeted therapy for M. avium

　　[ Key words] Mycobacterium avium; structure; function: bioinformatic analysis

　　鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium，MAV)屬于細胞內寄生菌，是非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)中的一種[1]。研究表明，在健康人中也能建立慢性MAV感染，且多種抗分枝桿菌的藥物治療效果不佳，即使延長18~24個月的療程也無法將其徹底清除[2);另一方面，MAV的感染在免疫系統受損的個體中引起NTM感染事件越來越多，且尚未制定出有效根除MAV感染的藥物治療方案和預防MAV感染的疫苗[2]，因此，研發有效的抗MAV的藥物及疫苗是當務之急.MAV-2052是參與MAV致病的重要蛋白之一，其主要功能是調節宿主細胞氧化與抗氧化的平衡和影響1-半胱氨酸的生成。為進一步了解MAV-2052的結構和功能，本研究從蛋白序列查詢、理化性質、多序列對比、疏水性分析、跨膜結構、信號肽分析和亞細胞定位等對MAV-2052蛋白進行生物信息預測和分析。

　　材料與方法

　　1數據資料的獲取

　　通過美國國家生物技術信息中心NCB數據庫對MAV-2052進行序列分析;登陸Uniprot蛋白數據庫和NCBI網站，獲取MAV菌株MAV-2052蛋白的基因序列和氨基酸序列。鳥型分枝桿菌亞種(M.avium subsp)、海德堡分枝桿菌(M.heidelbergense)、結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、新宿分枝桿菌(M.shinjukuense)、嗜血分枝桿菌(M.haemophilum)核苷酸序列和氨基酸序列也同樣從Uniprot蛋白數據庫和NCB網站獲取。

　　2生物信息學分析

　　運用在線uniprot蛋白數據庫的Blast工具，將MAV-2052基因序列與同源性較高的核苷酸進行比對;比對后的氨基酸運用MEGA-X構建進化樹;登錄在線ProtParam蛋白分析網站對MAV-2052蛋白進行理化性質分析;運用Protcale對蛋白進行疏水性分析;運用TMHMM(TMHMM Server V 2.0)和Sig-

　　nalP 5.0對MAV-2052進行跨膜和信號肽預測;運用Softberry和PSORT Il Sserver對MAV-2052細胞定位分析;利用SOPMA和SWISS-MODEL對MAV-2052蛋白進行二、三級結構預測;對蛋白磷酸化位點進行預測。

　　結果

　　1 MAV-2052基因的特征

　　GenBank 中MAV-2052基因的登錄號為ABK67788.1，基因又名：Cysk，基因序列全長933 bp，編碼310個氨基酸的蛋白質。

　　2 MAV-2052蛋白的同源性預測和進化樹構建

　　經氨基酸序列比對，鳥型分枝桿菌亞種(Mycobacterium avium subsp)、海德堡分枝桿菌、結核分枝桿菌、新宿分枝桿菌、嗜血分枝桿菌與MAV 104菌株MAV-2052蛋白的序列覆蓋區域分別是：100%、91%，88.4%，86.5%和84.8%。多重序列比對分析顯示，以上物種氨基酸之間的序列相似度較高(圖1)用MEGA-X軟件構建系統進化樹，結果見圖2。鳥型分枝桿菌亞種與MAV起源于同一物種，同源性較高。

　　3 MAV-2052蛋白序列信息及理化性質MAV104菌株MAV-2052蛋白相對分子質量為32.346 21 × 10"，理論等電點為4.86，其中丙氨酸(Ala)、緬氨酸(Val)、甘氨酸(Gly)的含量較高，分別占氨基酸總量的14.2%、10.6%和9.7%。帶負電荷的氨基酸殘基數目(天冬氨酸+谷氨酸)為37個，帶正電荷氨基酸殘基(精氨酸+賴氨酸)為27個。不穩定系數為27.74，為穩定蛋白。脂肪系數為105.45，親水性平均系數為0.214，為疏水性蛋白。

　　4 MAV-2052蛋白疏水性

　　MAV-2052蛋白282位谷氨酸(E)處疏水性得分較低(-2.033)，親水性較強;81位亮氨酸(L)處的疏水性得分較高(2.811)，疏水性較強。疏水性分析顯示，MAV-2052含有多個親水性區域和疏水性區域，其分布聚集不明顯(圖3)。

　　5 MAV-2052的跨膜區、信號肽及亞細胞定位運用TMHMM Server V 2.0預測MAV-2052無跨膜區(圖4)，運用signalP 5.0可以區分3種信號肽：1)Sec/SPI:“標準”分泌信號肽，由Sec轉運蛋白轉運并被信號肽酶1(Lep)切割;2)Sec/SPIl：由Sec轉運蛋白轉運并被信號肽酶11(Lsp)切割的脂蛋白信號肽;3)Tat/SPI：由Tat轉運蛋白轉運并被信號肽酶1(Lep)切割的Tat信號肽。預測結果顯示該蛋白無信號肽，可推斷不是分泌蛋白(圖5)，Softberry預測該蛋白亞細胞定位在細胞質中并通過PSORT II Server驗證。

　　6 MAV-2052蛋白二級結構及結構域的預測和分析MAV-2052氨基酸序列中，-螺旋(Alpha helix)

　　結構有114個氨基酸，占二級結構總數的36.77%;p-折疊(extended strand)結構有61個氨基酸，占總數的19.68%;p-轉角結構有35個氨基酸，占總數的11.29%;無規則卷曲(random coil respectively)結構有100個氨基酸，占總數的32.26%(圖6)，預測MAV-2052蛋白質有兩個結構域，分別是位于7-293氨基酸保守蛋白家族的PLPdep和位于7-293氨基酸的PALP家族(圖7)。

　　7 MAV-2052三級結構預測

　　MAV-2052三級結構的模型構建見圖8，可形成同源二聚體，但沒有和其他配體結合的空間位置，與Cysteine synthase A(2q3d.1.B)的相似度為88.39%。

　　8 MAV-2052蛋白磷酸化位點

　　預測MAV-2052蛋白有13個絲氨酸(Ser)磷酸化位點：7個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點，分別在93，97116，157，158，166，302位氨基酸處：139，299兩處有酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(圖9)

　　討論

　　近年來MAV感染率呈不斷上升趨勢，研發有效

　　的抗MAV的藥物對于抗MAV感染至關重要，尋找新藥靶點是當務之急。本研究采用生物信息學方法預測分析MAV-2052是存在于細胞質中的一種半胱氨酸合酶，屬于半胱氨酸合酶/半胱氨酸B合成酶家族，是MAV重要的蛋白之一。該蛋白為疏水性蛋白，無信號肽，無跨膜區，且預測定位于細胞質中，是一種非分泌性蛋白，主要功能是調節宿主細胞氧化應激反應和影響1-半胱氨酸的生成。多重序列分析顯示其與鳥分枝桿菌亞型氨基酸序列完全相同，與結核分枝桿菌的半胱氨酸合酶k，(cysteine synthase.Cysk，)的同源性較高。

　　MAV-2052蛋白具有催化活性：硫化物與0-乙酰基-1-絲氨酸在此酶的作用下生成醋酸鹽和1-半胱氨酸。而同一條或不同多肽鏈的兩個L-半胱氨酸殘基間以二硫鍵(-s-s)連接，在人體內主要是保持蛋白質的穩定性[。同樣也為發揮細胞正常的功能，抵御宿主細胞施加的氧化應激提供理論依據[5

　　在氧化應激中，一方面在半胱氨酸水平上序列比對結果顯示，MAV-2052是與結核分枝桿菌有88.4%相似性的半胱氨酸合酶A蛋白]。在與MAV-2052蛋白同源性較高的結核分枝桿菌中已被證實氧化平衡與L-半胱氨酸的可用性有關[。在結核分枝桿菌感染宿主過程中，1-半胱氨酸不僅是抵抗宿主巨噬細胞吞噬后釋放活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的第一道防線[1]，它還能修復被ROS破壞分枝桿菌蛋白的鐵硫中心[2]，而且還是合成病原菌對抗氧化應激和在宿主中長期生存的關鍵[，有研究表明，致病菌能利用高活性的酶幫助其躲避宿主的防御機制，從而促進細菌感染的成功建立。此外，細胞宿主的防御機制還包括ROS的爆發，這可能導致過度氧化，然而這些高活性酶通過使用包括催化和非催化1-半胱氨酸的機制，設法避免不可逆轉的失活t，當宿主中產生ROS時，結核分枝桿菌能夠通過硫氧還蛋白和放線硫醇中關鍵的L-半胱氨酸的硫醇基團來抵消宿主來源的活性氧中間體(reactive oxygen intermediate.ROT)[1]，放線硫醇可增強細胞內ROS的清除作用，使細胞活力提高[2)，其1-半胱氨酸殘基的疏基又可被親電基團烷基化，并被ROS氧化[10]，在氧化還原機制中證實增加1-半胱氨酸的供應可防御ROS的產生對病原菌的破壞[]，另一方面證實用抑制劑與結核分枝桿菌的Cysk，結合可減少L-半胱氨酸的生物合成從而破壞病原菌[1]。以上機制在結核分枝桿菌中已被證實，由于MAV-2052蛋白與結核分枝桿菌具有較高同源性，且與CysK，的底物和生成的L-半胱氨酸產物也完全相同，因此預測可通過從頭抑制L-半胱氨酸的生成來增加氧化應激中產生的ROS對MAV的破壞，從而作為新的抗菌藥的目標。另一方面，活性氧的產生破壞了抗氧化的平衡引起細胞凋亡(。細胞凋亡是宿主對病原菌防御機制的一個重要反應，涉及多種成分和高度協調的信號轉導[5]。許多細胞內細菌利用的是宿主的細胞器，在使細胞凋亡時主要通過調節宿主的細胞器來實現[1).Lee等[報道重組的MAV-2052蛋白在ROS的生成中以Caspase的方式誘導了巨噬細胞的凋亡。已被證實的凋亡途徑是使線粒體跨膜點位喪失，BAX線粒體轉位，細胞色素c釋放從而誘導細胞的凋亡。細胞色素c的釋放使Caspase活化[17，當Caspase一旦被活化，從而啟動相關蛋白酶的級聯反應[13]，當上游的Caspase-9活化通過一些途徑使宿主細胞核的核孔損傷并使下游的Caspase-3也進入細胞核，使DNA降解，從而加速宿主細胞的凋亡[2-13]，本研究預測MAV-2052有多個磷酸化位點，說明該蛋白在對宿主細胞的信號轉導也存在調控作用，其中ASK-JNK通路是MAV-2052在ROS介導的湖亡途徑中的主要通路)。而線粒體是細胞內源性凋亡發生多種關鍵事件的中心細胞器，可改變促凋亡和抗凋亡分子的活性[13]。高濃度的ROS還會促進內源性中內質網應激反應(endoplasmic re-

　　ticulum stress，ERS)的凋亡信號通路。當ERS激活時，線粒體內的ROS也會增加，導致線粒體的膜電位穩態被破壞，通透性增加、線粒體中的促凋亡因子改變并釋放，從而引起細胞凋亡[])。增加活性氧的產生可引起宿主抗氧化系統失衡導致細胞損傷和細胞器功能的喪失，從而促進MAV-2052蛋白的損傷加快細胞凋亡來殺傷MAViu本研究采用生物信息學方法預測分析MAV-2052為半胱胺酸合成酶，在MAV感染中調控1-半胱氨酸的生成和宿主細胞的氧化應激反應能控制其生長可為MAV感染的靶向治療提供新思路。

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