《天然植物人參中糖醛酸含量測(cè)定方法的建立》論文發(fā)表期刊：《今日畜牧獸醫(yī)》；發(fā)表周期：2021年01期

《天然植物人參中糖醛酸含量測(cè)定方法的建立》論文作者信息：朱明月，女，本科，研究方向：可飼用天然植物飼料添 加劑的研發(fā)

　　摘要：目的建立天然植物人參中糖醛酸的含量測(cè)定方法。方法以間羥聯(lián)苯法測(cè)定人參飲片中糖醛酸的含量，并對(duì)該方法的測(cè)定條件及供試品溶液制備方法進(jìn)行優(yōu)選，對(duì)方法學(xué)進(jìn)行考察。結(jié)果供試液在3h內(nèi)顯色穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，平均回收率為100.49%，RSD為2.63%。糖醛酸含量為3.99%，RSD為1.23%。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確�？蔀槿藚�飲片中糖醛酸的質(zhì)量控制提供參考。

　　關(guān)鍵詞：人參;糖醛酸;問羥基聯(lián)苯法

　　作為“東北三寶”之一的人參，在中國藥用歷史悠久。人參中含有多種有效成分，但對(duì)人參的研究，多集中于人參皂苷。近年來，關(guān)于人參多糖的報(bào)道越來越多，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力1和通過提高免疫力輔助抗腫瘤的作用10，顯示多糖對(duì)人參藥用價(jià)值的發(fā)揮亦起著重要作用。研究表明，人參多糖中的酸性多糖，即含有糖醛酸結(jié)構(gòu)單元的多糖生物活性較高"0。目前，藥典“人參"飲片項(xiàng)下只有人參皂苷含量的測(cè)定方法，但未見人參中糖醛酸含量測(cè)定方法研究的報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬建立一種準(zhǔn)確可靠的人參中糖醛酸含量測(cè)定方法，為人參飲片中人參多糖的質(zhì)量控制提供可借鑒的分析方法。

　　1儀器與材料

　　1.1儀器

　　UV2550型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津)

　　AUW120D型電子天平(日本SHIMADZU公司)

　　1.2藥物與試劑

　　D-半乳糖醛酸對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：

　　111646-200301，供含量測(cè)定用)，四硼酸鈉(美國Sigma公司)，間羥聯(lián)苯(美國Sigma公司)，咔唑(北京化學(xué)試劑公司)，其他試劑均為分析純。

　　1.3藥材

　　人參藥材購于安國藥材市場(chǎng)，經(jīng)本公司質(zhì)控部鑒別符合

　　《中華人民共和國藥典》2015版(1部)有關(guān)項(xiàng)下規(guī)定122方法與結(jié)果

　　2.1供試品溶液的制備

　　取人參細(xì)粉0.25g，置圓底燒瓶中，加80%乙醇150ml，加熱回流1h，趁熱濾過，殘?jiān)��?0%熱乙醇洗滌3次，每次10ml，洗滌液棄去。將殘?jiān)�及濾紙置燒瓶中，加水100ml，加熱回流1h，濾過。殘?jiān)�再加�?00ml，加熱回流1h，趁熱濾過。殘?jiān)�及燒瓶用熱水洗�?次，每次10ml，合并濾液及洗滌液，放冷，轉(zhuǎn)移至250ml.量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾紙過濾，取續(xù)濾液，即可。

　　2.2對(duì)照品溶液的制備

　　稱取D-半乳糖醛酸對(duì)照品10.08mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

　　2.3顯色劑的配制

　　2.3.1四硼酸鈉-硫酸溶液的制備

　　稱取四硼酸鈉4.78g，置1000ml，量瓶中，加硫酸超聲(功率250W，頻率40kH2)使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得(0.0125

　　mol/L.四硼酸鈉-硫酸溶液)。

　　2.3.2間羥聯(lián)苯溶液的制備

　　稱取間羥聯(lián)苯0.15g，置100mL.量瓶中，加0.5%的氫氧化鈉溶液超聲(功率250W，頻率40kH2)使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得(0.15%間羥聯(lián)苯溶液)。

　　2.4顯色條件考察

　　2.4.1最大吸收波長的選擇

　　精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6mL，置具塞試管中，于冰水浴中分別加入0.4mL.純化水，搖勻，于冰水浴中，加入D-半乳糖醛酸對(duì)照品溶液0.6ml，搖勻，置沸水浴中加熱12min，取出，置冰水浴中放冷至室溫，加人間羥聯(lián)苯溶液80uL，搖勻，室溫放置40 min，以1mlL.純化水同上操作制得空白溶液調(diào)零，以紫外可見分光光度計(jì)，在400-700 nm進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示，525mm波長處吸光度值最大，因此，確定檢測(cè)波長為525mm。

　　2.4.2四硼酸鈉-硫酸溶液用量考察精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液3ml、4mlL，5ml.、6mL、7mL

　　8mL，分別置具塞試管中，于冰水浴中分別加入0.4mL.純化水，搖勻，各加入D-半乳糖醛酸對(duì)照品溶液0.6ml，搖勻，其余操作同

　　2.4.1項(xiàng)，測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示：隨著四硼酸鈉-硫酸溶液用量的增加，D-半乳糖醛酸對(duì)照品溶液吸光度值先升高然后降低，其中以四硼酸鈉-硫酸溶液用量為6ml.的吸光度值最大。因此，確定四硼酸鈉-硫酸溶液最佳用量為6ml

　　2.4.3沸水浴時(shí)間考察

　　精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6mL，平行七份，分別置具塞試管中，于冰水浴中分別加入0.4mL.純化水，搖勻，各加入D-半乳糖醛酸對(duì)照品溶液0.6ml，搖勻，置沸水浴中分別加熱4min、6min、8min、10min，12min、14min，16min，其余操作同2.4.1項(xiàng)，測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示：沸水浴時(shí)間不同時(shí)，對(duì)照品溶液吸光度基本沒有差異，說明沸水浴時(shí)間為4min時(shí)，已反應(yīng)完全。

　　2.4.4間羥聯(lián)苯用量考察

　　精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6mL，平行十份，分別置具塞試管中，于冰水浴中分別加入0.4ml.純化水，播勻，各加入D-半乳糖醛酸對(duì)照品溶液0.6ml，搖勻，置沸水浴中加熱4min，取出，置冰水浴中放冷至室溫，再分別加入間羥聯(lián)苯溶液30uL.40ul.

　　50 L.，60L70uL.80ul90uL 100uL，，其余操作同2.4.11項(xiàng)，測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示：隨著間羥聯(lián)苯用量的增加，對(duì)照品溶液吸光度值先增大后減小，其中以間羥聯(lián)苯用量為80uL的吸光度值最大，因此，確定間羥聯(lián)舉最佳用量為804L

　　2.4.5顯色時(shí)間(室溫放置時(shí)間)考察

　　精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6ml，置具塞試管中，于冰水浴中加入0.5mL.純化水，搖勻，加入D-半乳糖醛酸對(duì)照品溶液

　　0.5mlL，搖勻，置濡水浴中加熱4min，取出，置冰水浴中放冷至室溫，加入間羥聯(lián)苯溶液80uL，搖勻，同法制備相應(yīng)空白溶液，以紫外可見分光光度計(jì)，每隔5min測(cè)定一次525mm波長處的吸光度，連續(xù)測(cè)定60min，結(jié)果顯示：顯色時(shí)間不同時(shí)，對(duì)照品溶液吸光度的RSD值為0.30%，吸光度基本沒有差異，說明顯色5min即可。

　　2.5供試品溶液制備方法考察

　　2.5.1供試品溶液制備方法比較

　　為了考察人參皂苷對(duì)糖醛酸含量測(cè)定是否存在干擾，對(duì)80%乙醇醇提皂昔后再水提糖醛酸和直接水提糖醛酸的方法進(jìn)行比較，光譜掃描圖見圖1。

　　顯色后顏色比較：醇提皂昔后再水提糖醛酸，供試品溶液顯色后為磚紅色;直接水提糖醛酸，供試品溶液顏色為咖啡色，兩種供試品溶液制備方法顯色后顏色不一致。最大吸收波長比較：醇提皂背后再水提糖醛酸，最大吸收波長為525mm，與對(duì)照品最大吸收波長一致，直接水提糖醒酸，最大吸收波長為508nm，與對(duì)照品最大吸收波長525mm不一致。綜上所述，若直接水提進(jìn)行顯色，則藥材中人參皂苷對(duì)糖醛酸含量測(cè)定存在干擾。因此，需醇提皂昔排除干擾后再水提糖醛酸進(jìn)行檢測(cè)，

　　2.5.2醇提次數(shù)比較

　　對(duì)80%乙醇醇提皂昔的次數(shù)(1次、2次、3次)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示：醇提次數(shù)不同時(shí)，供試品溶液顯色后顏色一致，均為磚紅色，且最大吸收波長均在525nm附近，且糖醛酸含量差異較小，說明提取1次，人參皂昔已提取完全，因此確定80%乙醇醇提次數(shù)為1次。

　　2.5.3溶劑用量考察

　　對(duì)糖醛酸提取溶劑(水)用量-50mlL、100mL、150mL.

　　200ml進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示：隨著溶劑用量的增加，糖醛酸含量增高，但溶劑用量為100mL，、150mL和200mL時(shí)，糖醛酸含量差異較小，因此，確定溶劑用量為100mL。

　　2.5.4水提次數(shù)考察

　　對(duì)糖醛酸水提次數(shù)進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示：隨著水提次數(shù)的增加，糖醛酸含量增高，但水提2次和3次，糖醛酸含量差異較小，說明提取2次，糖醛酸已提取完完全。因此，確定水提次數(shù)為2次。

　　2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

　　精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6ml，置具塞試管中，平行六份，于冰水浴中分別加入D-半乳糖醛酸對(duì)照品溶液0.1mL.

　　0.2mlL.0.3mL 0.4mL.0.5ml、0.6mL，以純化水補(bǔ)足1.0ml，搖勻，置沸水浴中加熱4min，取出，置冰水浴中放冷至室溫，再分別加人間羥聯(lián)苯溶液80uL，搖勻，室溫放置5min，同法制備空白溶液，以紫外可見分光光度計(jì)，分別測(cè)定525nm處的吸光度，并制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2

　　上述結(jié)果顯示：以D-半乳糖醛酸濃度為橫坐標(biāo)()，吸光度為縱坐標(biāo)(y)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=0.0132x-0.0168(=0.9997)，說明D-半乳糖醛酸溶液對(duì)照品溶液在10.08ug/mL-60.484g/

　　ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

　　2.7方法學(xué)考察

　　2.7.1重復(fù)性考察

　　按取樣量0.8：1.01.2的比例分別稱取樣品，各平行三份，精密稱定，按已確定的方法制備供試品溶液，并吸光度，計(jì)算糖醛酸含量。九份樣品測(cè)定結(jié)果RSD值為2.26%，該方法重復(fù)性良好。

　　取對(duì)照品溶液及重復(fù)性考察項(xiàng)下的供試品溶液，以間羥聯(lián)苯法顯色，對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液連續(xù)測(cè)定6次525mm處吸光度，計(jì)算RSD值。對(duì)照品和供試品溶液RSD值分別為

　　0.08%和0.00%，該方法精密度良好。

　　2.7.3穩(wěn)定性考察

　　取對(duì)照品溶液及重復(fù)性考察項(xiàng)下的供試品溶液，以間羥聯(lián)苯法顯色，每隔30min測(cè)定一次525mm處的吸光度，連續(xù)測(cè)定3h，計(jì)算RSD值。對(duì)照品和供試品溶液RSD值分別為0.77%和

　　2.15%，表明供試品溶液在3h內(nèi)顯色穩(wěn)定。

　　2.7.4回收率考察

　　按取樣量0.25g的1/2即0.125g稱取本品，精密稱定，平行9份，取已知濃度的的D-半乳糖醛酸對(duì)照品溶液，按照0.8：1.0：

　　1.2的比例分別加入樣品溶液中，各平行三份，按確定的樣品處理方法制備供試品溶液，以間羥聯(lián)苯法測(cè)定糖醛酸含量，計(jì)算回收率及回收率的RSD值。結(jié)果見表1上述結(jié)果顯示：九份供試品溶液中，D-半乳糖醛酸回收率介于95%105%之間，回收率均值為100.49%，RSD值為2.63%，該方法回收率良好。

　　2.8人參多糖中糖醛酸的含量測(cè)定

　　精密稱取人參細(xì)粉0.25 g，按照"2.1"項(xiàng)下供試品溶液制備方法和"2.4"項(xiàng)下顯色條件顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算供試品溶液中糖醛酸含量。結(jié)果人參中糖醛酸含量為3.99%，RSD為1.23%(n=3)。

　　3討論

　　文獻(xiàn)顯示，糖醛酸含量測(cè)定方法分為“咔唑法”和間羥聯(lián)苯法"兩種，味唑法收載于《國家中成藥匯編》中"人參多糖注射液項(xiàng)下;間羥聯(lián)苯法見于文獻(xiàn)，該文獻(xiàn)報(bào)道咔唑法在測(cè)定人參酸性多糖中糖醛酸含量時(shí)，因中性糖與硫酸咔唑絡(luò)合形成棕色衍生物，從而對(duì)糖醛酸含量測(cè)定存在干擾。筆者對(duì)啡唑法和間羥聯(lián)苯法進(jìn)行了比較，試驗(yàn)結(jié)果顯示：采用間羥聯(lián)苯法測(cè)定時(shí)，對(duì)照品溶液和供試品溶液最大吸收波長均為525nm，且供試品溶液和對(duì)照品溶液均為紫紅色;采用咔唑法測(cè)定時(shí)，對(duì)照品溶液最大吸收波長在525mm，而供試品溶液最大吸收波長在539mm，兩者最大吸收波長不一致，對(duì)照品溶液為紫紅色，而供試品溶液為咖啡色;且咔唑法和間羥聯(lián)苯法相比，供試品溶液的吸光度咔唑法比間羥聯(lián)苯法高0.286，說明咔唑法測(cè)定糖醛酸含量時(shí)，確實(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，同時(shí)驗(yàn)證間羥聯(lián)苯法的可行性。因此，確定人參伙片中糖醛酸含量測(cè)定方法為間羥聯(lián)苯法。

　　供試品溶液制備方法考察過程中，考慮到人參中含有皂苷和多糖兩類成分，因此，筆者對(duì)皂昔是否對(duì)糖醛酸含量測(cè)定存在干擾進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皂昔類成分存在時(shí)，間羥聯(lián)苯法顯色后，供試品溶液的顏色和最大吸收波長均存在差異，說明皂昔類成分的存在，對(duì)糖醛酸含量測(cè)定確實(shí)存在干擾。因此，供試品溶液制備方法中確定先醇提除去人參皂昔，然后再水提多糖，以保證含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度。

　　經(jīng)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，間羥聯(lián)苯法測(cè)定人參飲片中糖醛酸含量，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，適用于人參飲片中糖醛酸含量的測(cè)定。該方法可為藥典“人參”飲片項(xiàng)下人參酸性多糖質(zhì)量控制提供參考，以便更好地控制人參伙片質(zhì)量。

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