《不同來源沙門菌的分子分型及耐藥性研究》論文發表期刊：《中國病原生物學雜志》；發表周期：2020年10期

《不同來源沙門菌的分子分型及耐藥性研究》論文作者信息：【通訊作者】巢國祥祥 【作者簡介】徐紅紅（1995-），女，山東煙臺人，碩士研究生在讀，主要從事分子流行病學研究.

　　【摘要】目的 對272株不同來源的沙門氏菌進行血清型、MLST和藥敏試驗，分析沙門菌的流行和耐藥情況，為疾病的預防和臨床用藥提供科學依據。方法對不同來源沙門菌進行血清型鑒定和MIST分型，用MEGA5進行溯源分析，對15種常見抗生素進行藥物敏感試驗。結果 272株沙門菌分為19種血清型、26種ST型和4個同源復合體(CC11.CC64.CC19.CC68)，ST11(腸炎沙門菌)、ST17(印第安納沙門菌)、ST40(德爾卑沙門菌)、ST19(鼠傷寒沙門菌)

　　和ST34(鼠傷寒沙門菌)為主要克隆。腸炎、鼠傷寒和德爾卑沙門菌是人和動物中常見血清型，印第安納沙門菌在雞中的攜帶率為33.64%，每個同源復合體都有其獨特的地區分布。人源與動物源沙門菌耐藥情況相關。多重耐藥菌主要包括腸炎、印第安納、德爾卑、鼠傷寒和湯卜遜沙門菌，并對氨芐西林表現出較高的耐藥。印第安納沙門菌對9種及以上抗生素耐藥。結論 沙門菌血清型和ST型有高度的相關性。人源和動物源沙門菌的耐藥性存在明顯的相關性。耐藥表型在血清型上存在差異，由雞攜帶的印第安納沙門菌是一種泛耐藥克隆。

　　【關鍵詞】沙門菌;血清型;多位點序列分型;多重耐藥

　　【Abstract】 Obiective In order to provide a scientific basis for the prevention and clinical treatment of salmonellosis.

　　the prevalence and antimicrobial resistance of 272 Salmonella isolates from different sources with serotypes were analvzed and subjected to, MLST and resistance testings. Methods The serotypes and MLST types of Salmonella from different sources were identified, MEGA5 was used for traceability analysis, and their resistance to 15 antibiotics was determined.

　　Results The 272 isolates of Salmonella included 19 serotypes. 26 ST types. and 4 homologous complexes (CC11.CC64. CC19, and CC68), ST11 (S. enteritidis), ST17 (S. indiana), ST40 (S. derby), ST19 (S. typhimurium).

　　and ST34 (S. typhimurium) were the predominant clones. S. enteritidis, S. typhimurium, and S. derby were the predominant serotypes in humans and animals, S, indiana was carried by 33.64% of chickens. Each clonal complex had its own unique regional distribution. There was a correlation between resistance characteristics of human and animal-derived isolates. The multi-drug resistant bacteria mainly included S. enteritidis. S. indiana. S. derby. S. typhimurium, and S. thompson, which were highly resistant to am picillin, S. indiana isolates were resistant to 9 or more antibiotics.

　　Conclusion There was a high correlation between the serotype and ST type. There was a clear correlation between resist-

　　ance characteristics of human and anima-derived isolates. Obvious differences in resistance profiles were evident between the serotypes. Carried by chickens. S. indiana isolates were highly drug-resistant, producing a highly resistant clone.

　　【Key words】 Salmonella; serotype; multilocus sequence typing; multi-drug resistance

　　**沙門菌(Salmonella)是自然界中普遍存在的人畜共患致病微生物，不僅引起家禽的各種疾病，還能通過污染的肉類、禽蛋類、蔬菜等食物經糞口途徑傳播給人類[1]。其血清型種類眾多，不同血清型對人和動物的致病性不同[2]，全球每年有9380萬人因感染沙門菌引起腹瀉[3]。不同地區和宿主的優勢血清型不同，在不同宿主之間進行水平傳播，并且在人類沙門菌的感染和家禽消費之間已經建立了聯系。多位點序列分型(MLST)具有高分辨、可追溯和闡述細菌之間的進化關系等優點，以選定的等位基因序列分析為基礎，從分子流行病學的角度發現、追溯和評價新出現的病原菌]。抗生素在臨床和畜牧業上的廣泛使用和溢用，促進了沙門菌耐藥性的產生，尤其是多重耐藥(MDR)

　　沙門菌的出現[。印第安納沙門菌成為我國沙門菌主要血清型之一，對幾種常見的抗生素產生耐藥.-，引起廣泛關注。

　　本研究對不同來源沙門菌進行血清分型及MLST分型，并檢測其對9類15種常見抗生素的耐藥性，以期了解江蘇省不同地區和不同宿主沙門菌的血清型、ST型分布及耐藥狀況，并進行沙門菌的溯源分析，為沙門菌流行病學及其防控措施研究提供數據支持。

　　材料與方法

　　1材料

　　1.1 菌株 沙門菌272株，包括來自于江蘇省(鹽城、揚州、徐州、鎮江、南通、無錫、蘇州、常州、宿遷和南京)

　　的人源沙門菌83株(分離自食品相關從業人員、食源性疾病患者和腹瀉病患者)，食源沙門菌21株(分離自市場所售肉類和餐館食品)，雞源沙門菌110株(分離自養殖場中肉雞、蛋雞、宰殺前活體和腿毛和整禽等)，豬源沙門菌51株(分離自豬胴體、鼻拭子和肛拭子等)和外環境沙門菌7株(分離自養殖場的糞便和土壤)

　　以上菌株均于2015-2018年間收集，并通過生化試驗確認為沙門菌。大腸埃希菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC29213質控菌株為本室保存。

　　2方法

　　2.1 血清型鑒定 參照GB47894-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門菌檢驗方法，用玻片

　　凝集法進行血清型鑒定。

　　2.2 MLST分型 用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，用針對7個管家基因areC，thrA，purEdnaN，sucA.hisD和hemD設計的引物進行PCR擴增，擴增程序和引物參見MLST數據庫詳細說明.對擴增產物測序，測序結果采用DNAStar軟件根據PubMLST的相關要求修正，與MLST數據庫中序列進行比對分析，獲取7個管家基因位點的等位基因數值和ST型。

　　2.3 系統發育分析 每個基因位點和每個ST對應

　　的7個基因位點的連鎖序列最小進化樹(ME)由MEGA5軟件生成，每個位點核苷酸的變異及其各自

　　的標準誤差均由MEGA5確定。

　　2.4 藥敏試驗 抗生素藥物敏感性試驗采用紙片擴散法(Kirby-Bauer)，選用以下15種抗生素進行試驗：

　　1)青霉素類，包括氨芐西林(AMP，10 1g)、阿莫西林(AMC.30 pg);2)11代頭孢菌素類的頭孢西丁(FOX.30 pg);3)11代頭孢菌素類，包括頭孢噻肟(CTX，30pug)、頭孢派酮(CFP，35 1g)、頭孢曲松(CRO，30 ug);

　　4)IV代頭孢菌素類的頭孢呲肟(FEP，30 pg);5)氨基糖苷類，包括慶大霉素(GM，10 1g、卡那霉素(K，301ug)、阿米卡星(AK.30 ug);6)喹諾酮、氟喹諾酮類包括萘啶酸(NA.30 pg)和環丙沙星(CIP.5 4g);7)磺胺類的磺胺甲惡唑(SXT.25 ug);8)氯霉素(C.30 1g);

　　9)四環素(TE，30 1g)，結果判定參照CLSI的藥物敏感試驗指南。耐3類及以上抗生素的為多重耐藥菌(MDR)，耐9種及以上抗生素的菌株為泛耐藥菌(XDR)[72.5 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計數資料的比較采用x2檢驗，并進行Pearson相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

　　結果

　　1沙門菌的血清型

　　272株不同來源沙門菌經鑒定分為19種血清型，常見的是腸炎沙門菌(92株)、印第安納沙門菌(45株)、德爾卑沙門菌(34株)和鼠傷寒沙門菌(32株).

　　人源分離株主要為腸炎沙門菌(23株)、鼠傷寒沙門菌(20株)和德爾卑沙門菌(7株);雞源分離株主要為腸炎沙門菌(59株)和印第安納沙門菌(37株);豬源分離株主要為德爾卑沙門菌(23株)、鼠傷寒沙門菌(10株)

　　和豬霍亂沙門菌(10株).

　　2 MLST分型

　　272株沙門菌鑒定出26種ST型，主要包括ST11(95株)、ST17(45株)，ST40(30株)、ST19(20株)、ST34(10株)和ST68(8株)，合計占總分離株的76.47%(208/272)，ST11包括腸炎沙門菌(92株)和都柏林沙門菌(3株)，ST17為印第安納沙門菌(45株)，ST40包括德爾卑沙門菌(28株)、鼠傷寒沙門菌(1株)和阿貢納沙門菌(1株)，ST19為鼠傷寒沙門菌(20株)，ST34包括鼠傷寒沙門菌(9株)和傷寒沙門菌(1株)，ST68全部為豬霍亂沙門菌(8株)，ST319為湯卜遜沙門菌(7株)，采用MEGA5軟件繪制最小進化樹(圖1)，得到4個同源復合體C11.CC64，CC19和CC68，其中，CC11主要來自于徐州，CC19主要來自于鎮江，CC68主要來自于揚州。CC11(100株)包括ST11(95株)和ST92(5株)，CC19(31株)包括ST19(20株)，ST34(10株)和ST1544(1株)，CC64(10株)包括ST64(5株)和ST2441(5株)，CC68(10株)包括ST68(8株)，ST139(1株)和ST145(1株)。

　　3沙門菌抗生素耐藥表型81.62%(222/272)的沙門菌對至少1種抗生素耐藥，以對萘啶酸71.32%)、氨芐西林(56.99%)、四環素(53.68%)和頭孢派酮(40.44%)的耐藥率最高;其次是氯霉素(33.46%)、磺胺甲惡唑(33.09%)、卡那霉素(29.41%)、頭孢噻肪(21.32%)、慶大霉素

　　(20.96%)、環丙沙星(20.22%)、頭孢曲松(19.85%)阿莫西林(17.65%)、頭孢吡肟(14.71%)、阿米卡星(14.71%)和頭孢西丁(2.57%)。雞源沙門菌對頭孢派酮、頭孢噻肟、環丙沙星、頭孢曲松和頭孢吡肟的耐藥率分別為68.18%，41.82%，34.55%、42.73%和29.09%，豬源沙門菌對上述抗生素的耐藥率分別為15.69%.9.80%.9.80%.3.92%和3.92%，人源沙門菌對上述抗生素的耐藥率分別為18.07%，4.82%、7.23%.3.61%和3.61%，對雞源與人源沙門菌耐藥情況進行相關性分析，Pearson相關性系數為0.850(P<0.05)，豬源與人源沙門菌Pearson相關性系數為0.857(P<0.05).

　　63.30%(173/272)的菌株是MDR克隆，包括腸炎、印第安納、德爾卑、鼠傷寒和湯卜遜沙門菌(表1).腸炎沙門菌對氨芐西林和頭孢派酮的耐藥率分別為72.36%和49.47%(表2).11株分離于雞的耐藥模式與人源分離株相同，60.00%(50/92)菌株對3或4類抗生素耐藥，耐藥譜為AMP-NA-TE(16株)、AMP-

　　CFP-NA(11 株)和 AMPCFP-NA-TE(21株)，3.26%

　　(3/92)的菌株對9到14種抗生素耐藥(表1)。印第安納沙門菌對阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢派酮、頭孢曲松、頭孢吡肟、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、環丙沙星和氯霉素的耐藥率與其它克隆(腸炎、德爾卑和鼠傷寒沙門菌)相比差異有統計學意義(P<0.05)且耐藥率均高于其它克隆，除頭孢西丁外，對其它抗生素的耐藥率均>60.00%，并且對氨芐西林、氟喹諾酮和第三代頭孢菌素耐藥率均> 80.00%(表2)，97.78%(44/45)的菌株為MDR.86.67%(39/45)的菌株為XDR.湯卜遜沙門菌中有1株菌對15種抗生素全部敏感，其它菌株對氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢派酮、頭孢曲松、卡那霉素、阿米卡星、萘啶酸和氯霉素都產生耐藥性，85.71%(6/7)的菌株為MDR，42.86%(3/7)為XDR(表1)。鼠傷寒沙門菌對氨芐西林的耐藥率為54.54%，9.39%(13/33)為MDR，12.12%(4/33)為XDR(表1)，德爾卑沙門菌對四環素和氨芐西林的耐藥率分別為85.29%和32.35%(表2)，并且豬源和人源沙門菌對四環素的耐藥率分別為95.65%(22/23)和57.14%(4/7)，耐藥譜種類分散，70.59%(24/34)的菌株為MDR，2.94%(1/34)的菌株為XDR(表1).

　　討論

　　沙門菌血清型呈多態性，腸炎、印第安、鼠傷寒和德爾卑沙門菌為優勢血清型。人感染沙門菌可由家禽傳播引起。腸炎、鼠傷寒和德爾卑沙門菌是人和家禽

　　(包括雞或豬)感染的常見血清型[10，這些血清型經常與人類疾病暴發和零星病例有關[1-1，德爾卑沙門菌也是中國從嬰幼兒中分離出最常見的血清型之一。印第安納沙門菌在雞中攜帶率高，并且雞肉產業供應鏈的每一個環節都能檢測到，在這種動物和它的生產環境建立起聯系，因此推測該血清型的宿主為雞。近年來這種血清型從人群中分離出的菌株逐漸增加，特別是家禽從業者[，但是沒有確鑿的證據表明該血清型在食用動物中流行率的增加與人類感染這種沙門菌的增加之間存在聯系。

　　沙門菌的基因克隆具有多樣性，ST11，ST17

　　ST40，ST19，ST34和ST68是常見的克隆，CC11和CC19是兩個主要的同源復合體，每種主要的ST克隆都有各自緊密對應的血清型，反映了某些用于MLST分型的基因與細菌血清學分型相關的表型特征有關[5]，且每個同源復合體都有獨特的地區分布[1]，表明在傳播過程中沙門菌也在進行著進化和變異，這與沙門菌在適應動物內環境和外環境的過程中管家基因的點突變有關，因此親緣關系較近的ST型血清型也相似，如CC19中的ST19和ST34因管家基因的改變產生不同的ST型，但血清型都為鼠傷寒沙門菌。

　　STI7的印第安納沙門菌主要分離于雞，再次證實該克隆的主要宿主為雞.ST19和ST34的鼠傷寒沙門菌、ST11的腸炎沙門菌以及ST40的德爾卑沙門菌都主要分離于人和家禽(雞和豬)，這種人和動物分離株的遺傳克隆相似性表明它們具有共同的祖先，并揭示了沙門菌的主要來源于動物。

　　沙門菌普通對常用抗生素耐藥，本研究檢測結果顯示其對氨節西林、萘啶酸、四環素和頭孢派酮這些治療人類常用藥物的耐藥率與其它研究[1-13]相比偏高，抗廣譜頭孢菌素和氟喹諾酮類藥物的病原菌在我國出現和傳播[-.10，Pearson相關性系數表明人源與動物源(包括雞源和豬源)沙門菌在耐藥性之間存在顯著的相關性，并且雞源沙門菌對頭孢菌素類和氟喹諾酮類的耐藥率高于人源沙門菌，表明這種耐藥菌在這類家禽群中建立起來，但隨著抗生素的大規模使用，沙門菌對這類藥物的耐藥在中國許多不同流行地區的患者中也能檢測到，因此動物中抗生素的使用，使得沙門菌表現出抗藥性，通過生產鏈傳播給人類，導致人類的耐藥。

　　沙門菌抗生素的耐藥性在不同血清型上存在差異。氨芐西林的抗性主要表現在腸炎、印第安納、鼠傷寒、德爾卑和湯卜遜沙門菌，這與氨芐西林是中國家畜中使用最早和最廣泛的抗生素有關。耐藥性的發展可以通過廣泛使用抗生素來選擇[0]，并且這些血清型具有MDR表型，腸炎沙門菌主導耐藥譜型為：AMP-

　　NA-TE，AMP-CFP-NA和AMP-CFP-NA-

　　TE與申永秀等[1])的研究結果一致。分離于雞的耐藥模式和分離于人的相同，證實沙門菌在人和動物之間傳播。德爾卑沙門菌對四環素也具有較高的耐藥率，與四環素已在中國大陸的養豬業中廣泛使用這一事實有關。耐藥菌株通過豬肉或豬肉衍生產品傳染給人類，引起人類對四環素高耐藥[2-2])。對氟喹諾酮類和頭孢菌素類耐藥率較高的是印第安納沙門菌，并對多種抗生素的耐藥率高于其它血清型，相比其它血清型更易形成XDR，這種耐藥現象與鼠傷寒沙門菌DT104和其變體相似，盡管一些研究表明出現這種泛耐藥的現象可能與1類整合子和耐藥基因組成的基因簇有關。但關于抗性機制的數據相對較少，這種血清型的耐藥狀況與國內報道一致[a.2-3)，但其它國家的耐藥情況較我國輕7，反映這種血清型對抗生素的耐藥性可能存在地域性差異。另外，這種血清型在雞中的高攜帶率，顯示出動物源沙門菌的耐藥性較人源更為復雜，且一定程度反映了動物源沙門菌在耐藥方面扮演著重要的角色。湯卜遜沙門菌對氟喹諾酮類和頭孢菌素類藥物也有較高的耐藥率，因此這種血清型可能代表一個XDR克隆，泛耐藥趨勢也會在其它血清型中發展[]。雖然國家對抗生素的使用具有明確的規定，但在畜牧業中抗生素被廣泛用于促進生長、預防和治療。在農場上，特別是在廣大農村地區的家庭農場，抗生素被廣泛濫用和過度使用，意味著這些動物成為了耐藥細菌的主要儲存庫，因此減少抗生素在動物中的濫用是控制沙門菌耐藥的關鍵。

　　本研究表明沙門菌血清型和ST型有高度相關性，動物是沙門菌的主要儲存庫，人感染沙門菌可由動物傳播引起。同源復合體有其獨特的地區分布。沙門菌耐藥水平較高，多重耐藥性情況嚴重，人源與動物源

　　(雞源和豬源)沙門菌在耐藥性之間存在顯著的相關性。沙門菌耐藥表型與血清型相關，對氨芐西林抗性的腸炎、印第安納、鼠傷寒、德爾卑和湯卜遜沙門菌具有MDR表型，對氟喹諾酮類和頭孢菌素類耐藥的印第安納沙門菌是XDR克隆，而湯卜遜沙門菌有形成一種超級耐藥的趨勢。

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