《番茄不同生態位內生菌的菌群結構組成和差異性分析》論文發表期刊：《基因組學與應用生物學》；發表周期：2020年12期

《番茄不同生態位內生菌的菌群結構組成和差異性分析》論文作者信息：張婷負責實驗實施和論文撰寫；田寶玉、許小紅、藍燦華負責實驗設計指導和論文修改：張婷負責數據處理分析；黎燁和熊娟負責文獻查閱及實驗輔助。全體作者都閱讀并同意最終的文本。

　　摘要 植物內生菌與其宿主在長期進化過程中形成一種共生或互生的關系，對植物的生長發育、病蟲害防治、植物抗性、生物修復等方面都具有積極的作用。為了解植物不同生態位內生菌菌群組成和形成機制，本研究以番茄為材料，通過高通量測序解析番茄植株根、莖和葉3個不同生態位內生菌菌群組成與結構差異。收集番茄根、莖、葉組織樣品分別消毒，并分別進行研磨破碎提取基因組DNA，檢驗合格后送交公司進行16S rDNA序列V5-V7可變區的Illumina Miseq測序和微生物多樣性分析。結果表明，植物植株內不同生態位內生細菌菌群結構組成和多樣性有一定的差異。其中，根內生菌優勢菌群主要由Proteobacteria，Actinobacteria，Firmicutes等組成;莖的優勢菌群包括Proteobacteria和Firmicutes等;而葉的優勢菌群主要由Proteobacteria等組成。Proteobacteria是番茄根、莖、葉中共有的主要優勢內生菌群，但其在3個不同生態位中所占比例大小明顯不同。根內生菌具有更高的種群多樣性，且與莖和葉相比具有明顯的差異性�？傮w來講，根和莖內生菌組成和多樣性相似度更高，Venn圖分析表明根和莖有更多的共有OTU，而根和葉都有較多的特有OTU，表明莖的菌群受根的影響較大，而根和葉的菌群組成有較高的獨立性。

　　關鍵詞 生態位，植物內生菌，菌群多樣性，細菌定殖，高通量測序

　　Abstract Plant endophyte, which plays a positive role in plant growth and development, pest control, plant resistance, bioremediation and other aspects, has formed a symbiotic or symbiotic relationship with their host in the long-term evolution process, In this paper, to understand movement of endophyts in plant tissues and their assembly mechanism of endophytic flora, the composition and structure of bacterial endophytic flora of tomato in different parts, roots, stems and leaves were analyzed by using the high-throughput sequencing method. The samples for tomato root, stem and leaf were separately collected and disinfected. The processed samples were ground and broken to extract their genomic DNA. The extracted genomic DNA samples were sent to the company for amplifying the V5-V7 region of bacterial 16S rDNA and Illumina Miseq sequencing. The results showed that the plant tissues hadcertain effects on community structure and bacterial diversity of plant endophytic microbiome. Among them, Proteobacteria was the predominant microflora of endophytes of tomato, and it is the main dominant microflora shared by roots, stems and leaves. However, the proportions of Proteobacteria were obviously different in three different ecological niches. In addition, Actinobacteria and Firmicutes in tomato root, and Firmicutes in stem, were also among the dominant microflora. Root endophytes had higher population diversity and were obviously different from stem and leaf microbiome. In general, the composition and diversity of endophytic bacteria of roots and stems were more similar. Venn diagram analysis showed that roots and stems share more OTU, while roots and leaves have more unique OUT, suggesting the stem flora was greatly influenced by root, while the composition of root and leaf flora was relatively independent

　　Keywords Endophytic bacteria, Ecological niche, Community diversity, High throughput sequencing

　　內生菌(Endophytes)一詞最早起源自希臘語"endon"，指在生命周期的一定階段或整個生命周期都定殖在植物組織或器官的細菌或真菌，與宿主形成微生物共生體且對宿主植物幾乎不存在有害影響(Kandel et al，2017)。在地球上存在的近30萬種植物物種中，幾乎所有的植物都有一種或多種內生菌(Ryan et al，2008)，植物內生菌在植物組織中定殖，并且能夠與入侵者(如病原體)相互作用，對植物的生長發育、病蟲害防治、植物抗性、生物修復等方面都具有積極的作用(吳彩蘭，2016)，例如具有內生菌的共生植物不僅能夠緩解壓力，而且還能顯著提高植物的產量和高度

　　(Rojas-Tapias et al.，2012;Ali et al.，2014;Naveed et al.，2014;Qin et al.，2014;Yaish et al.，2015)。一些土壤細菌與非豆科植物發生內生關聯(Lupwayi et al，2004)，可能對宿主植物產生營養供給，如在許多不同的植物中發現了Azoarc us，Burkholderia.Gluconobacter.Her--baspirillum、Klebsiella，Pantoea，Rahnella等幾個屬的細菌內生菌，能夠促進宿主植物在營養不良條件下穩定的生長(Reinhold et al.，1987;Riggs et al.，2001;RosenbluethMartinez-Romero，2006;Doty et al，2009)。許多植物內生菌可以通過合成生長素，如吲哚乙酸(IAA)生產活性，1-氨基環丙烷-1-羧酸鹽(ACC)脫氨酶活性等促進植物生長。

　　內生菌在植物內的定殖與發展受到多種因素的影響，如溫度，濕度，土壤微生物菌，植物生長周期等這些都會影響內生菌在植物體內的分布與豐度。研究表明內生菌在植物中的定殖主要依靠于滲透作用(Compant et al.，2010)，隨著hh的出E植物生長 t開始，根系和土壤微生物群落之間開始相互作用，土壤內的微生物首先附著在根周圍形成根際細菌，根際細菌再依靠分泌細胞壁溶解酶或脂多糖、誘導根瘤菌形成結瘤基因、依靠鞭毛或菌毛運動等一個或多個條件，從根部的裂縫處滲透進入，進而通過一系列生命活動定殖在根的內部形成內生菌。例如許多細胞內植物-微生物相互作用的情況就始于微生物通過細胞內接近根毛的定殖。豆科植物-根瘤菌共生體中就是這種情況，根毛為這些內生菌提供了合理的入口點。研究也表明在內生菌定殖的早期階段，首先在根毛中觀察到內生菌，然后在根皮層中觀察到內生菌(Prieto et al.，2011;Castanheira et al.，2017;Rangjaroen et al.，2017)。

　　內生菌并不單單只存在于植物根部，伴隨著纖維素分解酶合成，以及細菌細胞的移動性，都有助于內生菌擴散到包括葉和莖的其他植物部分(Santi et al.，2013)，而對植物不同部位微生物組成和多樣性的研究也表明內生菌廣泛存在于植物組織和細胞間隙，包括根、莖、葉、花和種子(Iniguez et al.，2004;Compant et al.，2005;Kandel et al.，2015)。使用綠色熒光蛋白

　　(GFP)標記和GUS染色，在葡萄藤植物的接種葉的木質部和亞氣室中觀察到伯克霍爾德菌菌株PSN，在葡萄葉中也觀察到通過氣孔孔徑離開的細菌細胞(Compant et al.，2005)。通過熒光原位雜交(FISH)和共聚焦激光掃描顯微鏡觀察了葡萄葉片不同部分中的細菌內生菌的生態位。在葉脈，毛狀體和葉片的切片中觀察到細菌菌落(Piccolo et al.，2010)。在研究擬南芥葉和根源微生物群中發現，在葉和根微生物群之間具有廣泛的分類學重疊，其基因組編碼的功能基因大量重疊，在各個功能類別的水平上幾乎沒有顯著差異，說明根際與植物其它植物組織的微生物群體結構組成及其功能是相互影響的(Baiet al，2015)。

　　早前關于人體微生物組的研究表明，身體不同部位微生物的結構組成和多樣性明顯不同，認為人體微生物組的結構和組成主要由其所處的生態位所決定

　　(Ottesen et all，2013)。從整體上來說，生態位的不同決定了菌群的結構組成。不同生態位的微生物群體與植物組織在長期進化過程中互惠互利，在植物抗逆性，對干旱、炎熱和鹽脅迫的耐受性以及對病原菌的抗性中發揮巨大作用。但是目前關于內生菌定植過程中在空間維度上的移動的機制還不是很成熟，所以需要在知道其不同生態位的菌群構成的基礎上利用FISH技術再加以探索。同時，這些結果也表明，我們的微生物群雖然是個性化的，但在不同的身體棲息地和時間內系統地變化著，這樣的趨勢可能最終揭示微生物群的變化是如何導致或預防疾病的。

　　本研究以番茄為對象，分別收集并提取植物根、莖、葉3個不同部分基因組，擴增細菌16S rRNA基因的V5-V7可變區，再通過Ilumina Miseq高通量測序平臺對細菌菌群的結構組成和多樣性進行測序和分析，以期解析植物不同生態位微生物群落結構組成的差異和共性，理解植物內生菌群落結構的形成機制及細菌在植物組織內的遷移規律，為維持健康植物微生物組，以及通過引入和干預益生微生物在植物體內的建成促進植物健康提供科學依據。

　　1結果與分析

　　1.1數據的處理和統計

　　通過高通量測序，番茄的根、莖、葉3個樣品分別測到61 905，63 784.48039條原始序列。再經過去除引物接頭序列、質控過濾、去除嵌合體及非特異性擴增序列、去除線粒體葉綠體等操作后根莖葉最終分別得到57 925、62 471、40451條有效的高質量序列。

　　為了保證結果的均一性，進而對這些有效序列按最少序列數目進行抽平處理。

　　1.2番茄根莖葉細菌群落結構組成分析通過將樣品的OTU代表序列與SILVA數據庫進行比對，繪制出樣本的柱狀豐度圖，能夠更加直觀的分析出樣本間物種構成及比例，以門的水平為例

　　(圖1)，根的內生菌菌群主要由放線菌門Actinobacteria(44.76%)、變形桿菌門Proteobacteria(42.38%)、厚壁菌門Firmicutes(11.39%)組成，其次是少量的擬桿菌Bacteroidetes(1.08%)等。莖的內生菌菌群主要由變形桿菌門Proteobacteria(93.24%)、厚壁菌門Firmi cutes(6.42%)組成。葉的內生菌菌群主要由變形桿菌門Proteobacteria(99.19%)組成。結果表明，在門的水平上根莖葉的的內生菌菌群的組成成分與豐度具有明顯的差異，不僅是在門的水平上具有明顯差異，在較低水平例如目水平的優勢菌群也存在較大差異。在目的水平上(圖2)，根的內生菌優勢菌群主要包括放線菌目Actinomycetales(43.32%)、根瘤菌目Rhizobiales

　　(23.47%)、腸桿菌目Enterobacteriales(14.42%)、芽孢桿菌目Bacillales(10.25%)以及少量的伯克氏菌目Burkholderiales(1.34%)、鞘脂單胞菌目Sphingomonadales(1.27%)。莖的內生菌優勢菌群主要包括腸桿菌目Enterobacteriales(69.92%)、黃色單胞菌目Xanthomonadales(14.91%)、以及少量的芽孢桿菌目Bacillales(6.38%)、伯克氏菌目Burkholderiales(3.82%)、假單胞菌目Pseudomonadales(3.12%)，葉的內生菌優勢菌群主要包括海洋螺菌Oceanospirillales(53.83%)、腸桿菌目Enterobacteriales(32.42%)以及少量的立克次體目Rickettsiales(9.91%)、伯克氏菌目Burkholderiales(1.59%)。結果證明不同生態位的菌群結構組成與菌群多樣性具有明顯的差異性。

　　Heatmap可以用顏色變化來反映物種分布的豐度信息，圖中每一列代表一個樣本，每一行代表不同的物種組成，顏色塊代表物種的相對豐度值，顏色越紅表示相對豐度越高，顏色越藍則代表相對豐度越低。如圖所示(圖3)，在屬的水平上，取相對豐度較高的前50個屬繪制物種Heatmap圖旨在能夠清晰展示各物種組成與豐度之間的差異。結果如圖所示，根的優勢菌屬主要由蒼白桿菌屬Ochrobactrum(17.51%)腸桿菌屬Enterobacter(13.39%)、倫茨氏菌屬Lentzea(10.09%)、北里孢菌屬Kitasatospora(9.3%)、糖霉菌屬Glycomyces(7.11%)、芽孢桿菌屬Bacillus(6.17%)以及少量的申氏桿菌屬Shinella(1.71%)、游動放線菌屬Actinoplanes(1.45%)、韓國生工屬Kribbella(1.34%)和類諾卡氏屬Nocardioides(1.24%)組成。莖的優勢菌屬主要由腸桿菌屬Enterobacter(65.58%)、寡養單胞菌Stenotrophomonas(14.73%)以及少量的芽孢桿菌屬Bacillus(5.57%)、勞爾氏菌屬Ralstonia(3.75%)假單胞菌屬Pseudomonas(1.82%)和不動桿菌屬Acinetobacter(1.21%)構成。葉的優勢菌屬主要由Nitrincola

　　(53.13%)、立克次體屬Rickettsia(9.71%)、殺雄菌屬Arsenophonus(2.05%)和勞爾氏菌屬Ralstonia組成(1.38%)。其中蒼白桿菌屬、倫茨氏菌屬、北里孢菌屬、糖霉菌屬僅大量存在于根中。寡養單胞菌、假單胞菌屬、不動桿菌屬僅存在于莖中。Nitrincola、立克次體屬、殺雄菌屬僅存在于葉中。腸桿菌屬和勞爾氏菌屬在根莖葉中都存在，但是所占的比例有較大的區別。因此可以推斷出不同生態位對菌群的組成和豐度具有明顯的影響，且根的菌群多樣性明顯較莖和葉高。從樣本聚類樹圖葉也可以看出其中根和莖的親緣關系較葉相比相對接近。

　　從OTU分布的韋恩圖顯示相同的結果(圖4)(不同顏色代表不同樣品，圖中數字代表特異或共有的

　　OTU數)。為了保證差異的明顯性和準確性，選用根莖葉中OTU總數大于5的序列繪制Veen圖，旨在說明不同生態位的組成差異性和親緣關系的差異。經統計，這些OTU隸屬于5個門，174個屬，其中根和莖的共有OTU數為94，根和葉的共有OTU數為72，莖和葉的共有OTU數為40，結果表明，根與莖的親緣關系較葉相比相對較近，莖的菌群受根的影響較大，而葉的菌群可能受外界影響較大，例如菌群可能從葉片進入。除此之外，根的特有OTU數為367，莖的特有OTU數為51，葉的特有OTU數為44，因此可推斷出根的菌群可能受外界影響較大，例如土壤內環境。且多樣性與豐富度較莖和葉相比較高。

　　1.3番茄根莖葉樣品內生菌Alpha多樣性分析Alpha多樣性指數主要包括Chaol指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數、Coverage(測序深度指數)等，能夠反映菌群微生物的物種豐富度和多樣性。其中Chao1指數和ACE指數評估群落微生物的物種豐富度，指數越高則豐富度越高。Shannon指數和Simpson指數評估菌群微生物的物種多樣性，其中Simpson指數越高則群落多樣性越低，Shannon指數越高則群落多樣性越高。根莖葉的菌群多樣性分析結果(表1)。

　　結果顯示，根莖葉的Coverage指數均達到90%以上，達到測序深度，說明結果具有良好的置信水平。根的OTU指數高達4533，而莖和葉的OTU分別為2996和1925，并且植株根的Simpson指數明顯低于莖和葉，Shannon指數明顯高于莖和葉，因此可推斷出根的菌群多樣性較高且與莖和葉相比具有明顯的差異性。此外植株葉的Chao1指數和ACE指數也明顯低于根和莖，說明葉的菌群豐富度明顯低于根和莖。

　　1.4番茄根莖葉樣品內生菌Beta多樣性分析

　　根據主坐標分析圖來評估番茄根莖葉的細菌菌群結構的Beta多樣性，可以直觀的顯示出番茄根莖

　　葉3個位置的菌群差異性(圖6)，圖中代表根莖葉的3個點分布相互間隔很遠，說明根莖葉的菌群組成具有較大的差異性。在R的vegan package的分析下基于OTU的樣本所做的聚類樹圖顯示同樣的結果，如圖(圖5)所示，將根莖葉3個部位的序列進行比對分析，結果表明根和莖聚為一枝，相對距離較近，葉單獨為一枝，即根和莖的親緣關系相對較近且與葉的親緣關系相對較遠，進一步驗證莖的菌群受根的影響較大。

　　2討論

　　內生細菌存在于植物的特定組織中，通過營養物質、酶(脂肪酶，過氧化氫酶，氧化酶等)、功能因子(鐵團，生物表面活性劑等)的交換以及信號的傳遞(Parsek and Greenberg，2000;Hardoim et al.，2015)，與植物之間相互作用。它們長期定殖于植物組織中，基本不會產生類似病原體的負面影響，如破壞呼吸作用、光合作用，營養物質的轉移、蒸騰等。相反，宿主植物中這些內生細菌的存在對其健康和生長的具有有益影響。

　　目前，在己研究植物的各個部位和器官如根、莖、葉、果實、種子、胚中均能分離到內生細菌，在番茄根內注釋到放線菌、變形桿菌、擬桿菌門、TM7、酸桿菌和Gemmatimonadetes的存在(Tian et al，2015)。

　　并且內生細菌的結構組成及豐度會隨著不同的植物品種、部位、不同的發育時期的變化而發生相應的改變。例如，王美琴等(2010)對番茄內生細菌結構組成研究時發現不同生長地的番茄內生菌的結構組成與豐度存在差異;不同組織中也有差異，其中根是細菌的主要來源數量最多，生態位越高數量相對減少，因此莖、葉次之;不同發育期如撥苗期到開花期內生菌種類和豐度增多，而近鄰成熟期時其優勢菌群的比例會發生變化。除此之外，吳彩蘭(2016)對加工番茄的研究也顯示同樣的結果，例如在根莖葉及其果實中分離得到的菌的種類數量有一定差距，其在根中分離得到97株菌，莖分離得到79株菌，葉分離得到65株菌以及果實分離得到44株菌，經分子生物學鑒定主要包括芽孢桿菌屬、假單孢菌屬、黃單孢菌屬、土壤桿菌屬、歐氏桿菌屬、腸桿菌屬。其中芽孢桿菌和假單胞桿菌是分離頻率最高，數量相對最多，屬于優勢菌群，且可以通過間接方式促進植物生長，抑制病原微生物的生長而促進植物健康，減輕作物的干旱，熱和鹽脅迫等。

　　最近有研究強調了微生物和宿主相互作用對食用和藥用植物生長、質量和健康的重要性，番茄植株作為一個重要的農產品之一其細菌群落組成對植株健康的影響也是一個可研究的課題(Abbamondi et al，，2016)，本試驗以番茄為例，利用高通量測序速度快，通量高，準確率高等特點，在Ilumina Miseq高通量測序平臺，對各部位細菌16S rDNA的Vs-V7區進行擴增測序，進而通過序列合并，質控過濾，聚類分析，多樣性分析等過程對番茄不同生態位的內生細菌的菌群結構組成與多樣性進行分析。通過結構組成Heatmap圖分析可得根主要由蒼白桿菌屬、腸桿菌屬、倫茨氏菌屬、北里孢菌屬、糖霉菌屬、芽孢桿菌屬組成。莖主要由腸桿菌屬、寡養單胞菌、芽孢桿菌屬構成。葉的優勢菌屬主要由Nitrincola、立克次體屬、殺雄菌屬和勞爾氏菌屬組成。其中腸桿菌屬，芽孢桿菌屬在根和莖中同時存在且占比例相對較大，因此可推測其發生遷移。再通過Alpha多樣性分析的各個指數可更加明確判斷菌群的差異性。其中根的Shannon指數4.25.Simp-

　　sons指數0.06，莖的Shannon指數1.81，Simpsons指數

　　0.45，葉的Shannon指數1.81，Simpsons指數0.35，根的菌群多樣性明顯高于莖和葉。除此之外根的菌群豐富度(Chao 1指數23 975，ACE指數55 132)與莖的菌群豐富度(Chao 1指數29 786，ACE指數82 907)差異不明顯，但與葉的菌群豐富度(Chao 1指數12 858，ACE指數44 206)差異較大。因此可明顯推斷出不同的植物生態位對植物細菌結構組成多樣性和豐富度有一定程度的影響。除此之外，經過對其中OTU組成進行分析發現根和莖的共有OTU數為94，根和葉的共有OTU數為72，莖和葉的共有OTU數為40，結果表明，根與莖的親緣關系較葉相比相對較近，莖的菌群受根的影響較大，而葉的菌群可能受外界影響較大，例如菌群可能從葉片進入。而且根的特有OTU數為367，莖的特有OTU數為51，葉的特有OTU數為44，因此可推斷出根的菌群可能受外界影響較大，例如土壤內環境。且多樣性與豐富度較莖和葉相比較高我們通過對不同生態位菌群的研究，發現不同生態位菌群的組成和豐富度具有很大的差異性，可進行進一步推測驗證是生態位決定了菌群的組成。除此之外利用各自的優勢菌群與共同的菌群，推測可能菌群的遷移，后期再利用定位技術加以輔助即可對其在植物內的移動機制有更深層次的探索。為維持健康植物微生物組，以及對引入有益微生物在植物體內的建成和促進植物健康提供理論基礎。

　　3材料與方法

　　3.1試驗材料

　　實驗番茄種植于福建師范大學旗山校區試驗田。選取生長狀況良好，苗期為3個月的健康番茄植株，小心將番茄根部，莖部和葉的浮土用無菌水沖洗干凈，并且將處理后的番茄樣品放入4℃冰箱保存并及時處理。

　　3.2番茄根、莖、葉等部位消毒及其基因組總DNA的提取

　　先對番茄植株進行消毒：取其根，莖，葉等部位的樣品，先采用無菌水充分沖洗浸漬以后，使用5%次氯酸鈉溶液將其浸漬1 min，浸漬過后用無菌水進行清潔，第二步使用75%乙醇浸漬3 min以后，用無菌將其水沖刷清潔。再對消毒情況進行檢測：預先取出少量植物根、莖、葉3部分的組織樣品分別放置于無菌的LB平板，于恒溫箱37℃無菌過夜培養，若無雜菌生長，說明組織樣品消毒徹底(Cao et al，2015;雷少楠等，2017)。后進行基因組DNA的提�。悍謩e選取3種組織樣品用無菌的剪刀剪碎后放入無菌離心管中，同時加入滅菌的石英砂用組織研磨棒進行研磨，研磨完成后使用土壤基因組DNA提取試劑盒對番茄根，莖，葉等組織的總基因組DNA提取。提取所得DNA樣品用超微量分光光度計進行純度檢測，合格后置于-20℃冰箱存儲。

　　3.3細菌16S rDNA PCR擴增及高通量測序以提取的DNA為模板，27F和1492R這兩個細菌16S rDNA通用引物來聚合酶鏈式反應擴增。PCR擴增反應的基本條件：94℃變性30 s，60℃退火30s，72℃延伸90 s，設定30個循環。反應體系為50LL，每個反應添加2 L的DNA模板，PCR反應后用電泳檢測濃度，瓊脂糖濃度采用1%。電泳后對結果進行觀察發現約1500 bp明亮條帶，證明擴增出細菌16S rRNA基因，將獲得的總基因組DNA進行Illumina Miseq高通量測序(雷少楠等，2017)。

　　模板選用上述基因組DNA，細菌16S rDNA的V5-V7區引物F:AACMGGATTAGATACCCKG和R：ACGTCATCCCCACCTTCC及融合barcode(Bai et al.，2015)、測序引物、接頭序列的引物對各樣本的V5-V7區進行聚合酶鏈式反應擴增后等量混合，用于進行高通量測序。測序采用Ilumnia MiSeq測序平臺，選取PE 2x250 bp測序策略。兩輪測序，一輪測序初步去除葉綠體的所有序列，第二輪補測細菌序列少于4000 reads的樣品，擔保有充足數目的細菌DNA后續分析。

　　3.4數據處理

　　高通量測序獲得原始數據首先采用FLASH軟件對成對的短讀取序列(reads)進行拼接(Compant et al.，2005;Piccolo et al，2010;Chen et al.，2013)，拼接后利用Cutadapt軟件去除Barcode和引物序列。接下來使用Usearch軟件刪除低質量的序列(模糊識別堿基，引物錯配，讀長異常的序列)(Edgar，2010)。初步質控過濾之后的序列采用de novo方法進行嵌合體序列檢查和去除(Edgar et al，2011;Haas et al.，2011;Quince et al.，2011)，最終得到用于聚類和分類分析的高質量有效序列。

　　利用Usearch平臺對得到的高質量有效序列進行聚類分析，將序列相似度>97%的序列命名為一個操作分類單元(OTU)，選取每類中最長的序列作為OTU代表序列，使用RDP Classifier的方法與SILVA數據庫進行比對注釋，進而得到每個OTU的物種分類學信息(王少果等，2015)，根據獲得的OTU分類信息，刪除樣品中植物葉綠體(Chloroplast)和線粒體(Mitochondria)的OTU，由于不同樣本對應的序列數量差距較大，為了保證結果的均一性，需要對每個樣品按最小的序列數進行隨機抽平處理。抽平后，從新進行OTU聚類和分類分析，生成OTU表，以備后續數據分析。

　　3.5數據分析

　　利用得到的OTU的分類信息，運用R語言gplots(version 2.17.0)軟件包繪制各個樣品結構組成柱狀圖以及可視化的熱點圖(Heatmap)，QIME腳本用于計算分類序列的百分比，以及在OTU的相似度在97%以上的標識上繪制Rank abundance曲線來反映物種組成的均勻度與豐富度。利用QIME做rar-

　　efaction分析，利用R制作曲線圖，用Chaol多樣性、ACE指數、Shannon和Simpson指數來分析樣本的Alpha多樣性。采用QIME進行主成分分析(principal component analysis，PCoA)和層次聚類分析來評估樣本的B多樣性以及不同樣本群落組成相似性和差異性。

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