摘要我國(guó)黃瓜品種繁多，但黃瓜的抗逆性不強(qiáng)，容易產(chǎn)生病蟲害。因此，分析和驗(yàn)證抗病相關(guān)的基因，探究黃瓜抗病的分子機(jī)理，可為培育黃瓜抗性品種奠定基礎(chǔ)。本研究以黃瓜為試驗(yàn)材料，采用RT-PCR技術(shù)克隆了黃瓜銅伴侶蛋白基因CsATX1的cDNA序列全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;采用熒光定量PCR的方法分析CsATX1基因在細(xì)菌性角斑病侵染0~96h下的表達(dá)情況，以期探究其與黃瓜抗病性的關(guān)系。結(jié)果表明：CsATX1基因序列全長(zhǎng)為768bp，含有一個(gè)288bp的ORF閱讀框，可編碼95個(gè)氨基酸，該基因編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為9.95kD，理論等電點(diǎn)是5.07，為親水性蛋白，不具有跨膜結(jié)構(gòu)，不含信號(hào)肽序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明CsATX1與葫蘆科同源蛋白的親緣關(guān)系最近。qRT-PCR分析表明，CsATX1在黃瓜葉中有表達(dá)，在黃瓜細(xì)菌性角斑病菌侵染下，該基因在黃瓜葉中表達(dá)顯著增高，受黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的誘導(dǎo)。該研究結(jié)果為深入探究CsATX1基因功能提供科學(xué)依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞黃瓜;銅伴侶蛋白;基因克隆;細(xì)菌性角斑病;熒光定量PCR

　　銅(Cu)是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素，在正常生理?xiàng)l件下，主要以兩種離子形式存在：Cu+和Cu2+，且這兩種Cu的狀態(tài)可以相互轉(zhuǎn)換，這一特點(diǎn)使得Cu能夠作為細(xì)胞內(nèi)的輔助因子來參與植物體內(nèi)一些重要的氧化還原反應(yīng)(袁金紅等,2016)，如在光合作用、呼吸作用、氧化脅迫防御等生理活動(dòng)中發(fā)揮重要功能(Yruela,2009)，植物中銅含量為2~50μg/gDW(dryweight)，當(dāng)植物中銅水平低于正常值時(shí)，植物開始表現(xiàn)缺銅癥狀，如生長(zhǎng)緩慢、幼葉失綠、葉緣卷曲、果實(shí)形成減少等;而銅離子含量過高則會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害(Laliotietal.,2009)，主要表現(xiàn)為：根系生長(zhǎng)受阻，新葉失綠、老葉壞死，葉柄和葉背變?yōu)樽仙���。維持細(xì)胞內(nèi)銅離子穩(wěn)態(tài)是通過一系列的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和金屬結(jié)合蛋白來完成的(Lengetal.,2015)。

　　農(nóng)業(yè)論文投稿刊物：《湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)》創(chuàng)刊于1955年，以學(xué)術(shù)性、科學(xué)性和實(shí)用性為特色，主要報(bào)道國(guó)內(nèi)外農(nóng)業(yè)最新科技成果和科研動(dòng)態(tài)，傳播科技信息。主要欄目有：綜述、硒谷論壇、育種·栽培、資源·環(huán)境、植物保護(hù)、園藝·特產(chǎn)、畜牧·獸醫(yī)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、貯藏·加工、檢測(cè)分析、農(nóng)業(yè)工程、信息工程、生物工程、經(jīng)濟(jì)·管理、鄉(xiāng)村振興等。本刊為半月刊，上下半月分別于每月10日、25日出版。歡迎廣大作者針對(duì)各欄目特色踴躍投稿。見刊后，我們給每文作者提供2本樣書和10份獨(dú)立文章的單行本，以快遞形式送達(dá)。

　　銅伴侶蛋白可與銅離子進(jìn)行結(jié)合，其含有銅離子結(jié)合區(qū)，是一類低分子量的金屬傳遞蛋白，通過將銅離子向靶位點(diǎn)轉(zhuǎn)移和運(yùn)輸，以達(dá)到平衡細(xì)胞內(nèi)銅離子的量進(jìn)而避免其產(chǎn)生毒害的目的(衛(wèi)浩等,2019)。銅伴侶蛋白首先在釀酒酵母中被發(fā)現(xiàn)(LinandCulotta,1995)，對(duì)ATX1基因功能的研究表明它參與轉(zhuǎn)運(yùn)銅離子，并證明這一過程可以有效阻止氧自由基進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞的破壞作用。植物中有ATX1-type和CCH-type兩種ATX-like銅伴侶蛋白。研究表明銅離子可以調(diào)控銅伴侶蛋白的表達(dá)量(PuigandThiele,2002)，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過表達(dá)ATXlike基因后可起到降低銅離子脅迫的作用。

　　此外，研究其他植物ATX-like銅伴侶蛋白發(fā)現(xiàn)該蛋白可能具有不同的功能，如水稻ATX基因不僅受水楊酸、脫落酸、茉莉酸等激素誘導(dǎo)，而且也可以響應(yīng)Cu+和病原菌(Magnaporthegrisea)的誘導(dǎo)，該結(jié)果表明銅伴侶蛋白可能在植物抵御不良環(huán)境或病原菌的侵害過程中發(fā)揮作用(Agrawaletal.,2002)。黃瓜(CucumissativusL.)隸屬于葫蘆科甜瓜屬，是世界上最重要的蔬菜作物之一，我國(guó)很早就開始選擇和培育黃瓜品種并在各地廣泛種植(張文爍等,2020)。黃瓜生長(zhǎng)過程中會(huì)受到不同病原菌的侵染，嚴(yán)重影響了黃瓜的品質(zhì)及產(chǎn)量。在上世紀(jì)70年代，我國(guó)黃瓜種植業(yè)大面積爆發(fā)細(xì)菌性角斑病，到目前為止仍是影響黃瓜優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的最重要的病害之一(孫福在和何禮遠(yuǎn),1988)。

　　然而至今我們?nèi)圆涣私恻S瓜及其病原菌——細(xì)菌性角斑病它們之間互作的分子機(jī)制。本研究根據(jù)前期構(gòu)建的黃瓜葉cDNA文庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選比對(duì)，獲得了編碼CsATX1基因的全長(zhǎng)序列，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)該基因的功能。此外，進(jìn)一步采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了CsATX1基因在黃瓜細(xì)菌性角斑病菌誘導(dǎo)下的表達(dá)水平，為探求黃瓜銅伴侶蛋白基因的功能奠定基礎(chǔ)。

　　1結(jié)果與分析

　　1.1黃瓜葉片總RNA檢測(cè)采用試劑盒提取總RNA后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示rRNA條帶清晰，無彌散條帶，表明黃瓜葉片總RNA提取的完整性較好;進(jìn)一步通過核酸蛋白儀分析總RNA的純度，結(jié)果顯示OD260/OD280為1.88，在1.8~2.1范圍內(nèi)，說明所提取的黃瓜葉片總RNA純度較高，可進(jìn)行后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

　　1.2黃瓜CsATX1基因cDNA全長(zhǎng)的獲得以上述提取的黃瓜葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的特異性引物(AF1、AR1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，在Marker的750bp附近出現(xiàn)1個(gè)CsATX1基因的特異條帶，與預(yù)測(cè)片段大小吻合。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化，送公司測(cè)序后獲得一段768bp長(zhǎng)度的電子序列。

　　1.3CsATX1全長(zhǎng)序列生物信息學(xué)分析通過NCBI網(wǎng)站上的ORFFinder對(duì)黃瓜CsATX1基因全長(zhǎng)(768bp)的開放閱讀框即編碼區(qū)進(jìn)行查找，結(jié)果表明CsATX1基因包含一個(gè)288bp的開放閱讀框(啟動(dòng)子為ATG，終止子為TAA)，編碼95個(gè)氨基酸，此外，在編碼區(qū)的上游和下游分別含有一段145bp的5′非翻譯區(qū)和一段335bp的3′非翻譯區(qū)，HMA重金屬結(jié)合相關(guān)區(qū)域位于氨基酸序列的11-63位。

　　1.5CsATX1基因響應(yīng)細(xì)菌性角斑病菌誘導(dǎo)的表達(dá)情況分析采用細(xì)菌性角斑病菌處理黃瓜葉片0~96h，通過熒光定量PCR技術(shù)分析不同時(shí)間處理下的CsATX1基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，在0~96h內(nèi)，CsATX1基因的表達(dá)水平呈先升高，再降低，然后再升高的變化趨勢(shì)。從總體上看，經(jīng)細(xì)菌性角斑病菌處理后，CsATX1基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(未處理)，最高表達(dá)量出現(xiàn)在誘導(dǎo)96h，為對(duì)照的190.5倍。以上結(jié)果可以看出，黃瓜銅伴侶蛋白CsATX1基因受細(xì)菌性角斑病菌的顯著誘導(dǎo)，由此可推測(cè)CsATX1基因可能具有抵御外來生物脅迫的功能，尤其在防御黃瓜細(xì)菌性病害中發(fā)揮作用。

　　2討論

　　近年來，雖然有關(guān)植物銅伴侶蛋白的研究已取得了一定進(jìn)展，但仍然遠(yuǎn)滯后于對(duì)酵母銅伴侶蛋白的研究。就植物比較而言，其中模式植物擬南芥銅伴侶蛋白的研究處于領(lǐng)先地位(杜亞琳,2016)，主要存在兩種類型的ATX1-like銅伴侶蛋白基因，ATX1-type和CCH-type;其中ATX1-type蛋白在無銅鋅超氧化物歧化酶SOD參與時(shí)，可以通過其自身具有的抗氧化能力對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用(Puigetal.,2007)，即ATX1是一個(gè)獨(dú)立于SOD途徑的氧自由基消除劑(Itohetal.,2009)。近年來，黃瓜中雖然有關(guān)銅吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)基因(CCH)被發(fā)現(xiàn)(井鑫,2006)，但我們對(duì)該類蛋白了解得十分有限，尤其在抗病防御方面的生理功能仍不清楚。本研究中，我們克隆了黃瓜銅伴侶蛋白ATX1基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)CsATX1進(jìn)行序列分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

　　研究發(fā)現(xiàn)CsATX1無跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，這與擬南芥AtATX1蛋白預(yù)測(cè)的結(jié)果一致，推測(cè)CsATX1并非膜結(jié)合蛋白，且沒有翻譯后的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，預(yù)測(cè)其在細(xì)胞質(zhì)中行使功能。CsATX1的氨基酸序列進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)分析，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白有10個(gè)磷酸化位點(diǎn)，通常來說，蛋白質(zhì)中磷酸化位點(diǎn)的數(shù)目與其發(fā)揮的生物學(xué)功能呈正比，即位點(diǎn)越多，該蛋白發(fā)揮的生物學(xué)功能越多。此外，系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)CsATX1的結(jié)構(gòu)非常保守，與擬南芥AtATX1的相似度達(dá)70%左右，推測(cè)黃瓜CsATX1銅伴侶蛋白的功能可能與擬南芥銅伴侶蛋白AtATX1功能類似，側(cè)重于參與細(xì)胞內(nèi)銅運(yùn)輸和活性氧的清除。在黃瓜侵染性病害中，細(xì)菌性角斑病是其中最為重要的病害之一。近年來，該病害幾乎為害全國(guó)各大黃瓜種植區(qū)，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率可高達(dá)100%，致使整個(gè)溫室大棚的黃瓜全部染病而死，給瓜農(nóng)們?cè)斐闪司薮蠼?jīng)濟(jì)損失(彭月等,2021)。

　　目前該細(xì)菌性病害的防治仍以化學(xué)防治為主，眾所周知，化學(xué)防治不僅會(huì)帶來農(nóng)藥殘留，污染環(huán)境，而且長(zhǎng)期使用還會(huì)導(dǎo)致病害產(chǎn)生抗藥性，提高對(duì)其防治的難度系數(shù)。因此十分有必要進(jìn)一步深入研究寄主植物與病原物之間互作的分子機(jī)制，為今后有效防治黃瓜細(xì)菌性角斑病奠定基礎(chǔ)。

　　3材料與方法

　　3.1試驗(yàn)材料本研究所用到的黃瓜品種(D0462)和細(xì)菌性角斑病菌均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院惠贈(zèng)。(1)開展時(shí)間：在黃瓜處于3片真葉期時(shí)進(jìn)行;(2)處理方法：制備1×108cfu/mL菌懸液，用噴霧器向黃瓜葉面均勻噴灑，噴至葉面布滿水珠但不滴下即可，對(duì)照組噴灑等量的無菌水;(3)誘導(dǎo)時(shí)間：分別誘導(dǎo)0、8、24、48、72、96h;(4)誘導(dǎo)后收集葉片，用無菌水沖洗葉面3~4遍，并用濾紙吸干水分，液氮中速凍后，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　3.2黃瓜葉片總RNA的提取將黃瓜葉片在液氮中快速研磨至粉末狀，采用植物RNA試劑盒提取總RNA，具體方法按照說明書進(jìn)行。提取黃瓜葉片總RNA后，分別采用瓊脂糖凝膠電泳和核酸分析儀對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。

　　3.3CsATX1全長(zhǎng)基因克隆根據(jù)課題組前期獲得的黃瓜cDNA文庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析(劉關(guān)君等,2009)，獲得了一個(gè)銅伴侶蛋白CsATX1基因全長(zhǎng)序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異性引物AF1、AR1，以提取的黃瓜總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增該序列，具體反應(yīng)體系如下(50μL)：cDNA模板2.5μL，引物AF1、AR1(濃度為10μmol/L)各2μL，2×PCRMix25μL，其余用ddH2O補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增條件如下：首先，95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s、58℃退火40s、72℃延伸40s，40個(gè)循環(huán);最后再72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后送哈爾濱生物公司測(cè)序。

　　3.4序列分析CsATX1基因所包含的編碼區(qū)序列采用NCBI中的ORF(Openreadingframe)程序查找。氨基酸的理化性質(zhì)采用ProtParamtool軟件進(jìn)行分析。CsATX1蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)采用TMHMM在線軟件;CsATX1蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用Signalp5.0軟件。CsATX1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域通過NCBI中CDD程序進(jìn)行分析。CsATX1蛋白的潛在磷酸化位點(diǎn)用Netphos3.1server進(jìn)行分析。CsATX1亞細(xì)胞定位分析分別采用Plant-mPloc和psortprediction在線程序進(jìn)行。CsATX1氨基酸序列的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，分別利用SOPMA和SWISS-model進(jìn)行預(yù)測(cè)。最后，下載與CsATX1比對(duì)相似性較高的氨基酸序列，采用軟件ClustalX和MEGA10.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

　　3.5qRTPCR分析CsATX1基因的表達(dá)情況采用細(xì)菌性角斑病菌對(duì)黃瓜葉片進(jìn)行不同時(shí)間的誘導(dǎo)處理，侵染時(shí)間分別為0、8、24、48、72和96h，侵染后分別提取不同時(shí)間處理的黃瓜葉總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用熒光定量PCR方法，對(duì)細(xì)菌性角斑病菌處理下的黃瓜CsATX1基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。在PCR管中加入cDNA為模板1μL，10μmol/L引物(AF-q,AR-q)及內(nèi)參引物(18S-F1,18S-R1)(表1)各0.8μL，2×SYBRPremixExTaq混合液10μL，體系為20μL，不足用ddH2O補(bǔ)足。采用核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)儀(AgilentMx3000P)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s;95℃15s，58℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量(LivakandSchmittgen,2001)。

　　參考文獻(xiàn)

　　AgrawalG.K.,RakwalR.,JwaN.S.,andAgrawalV.P.,2002,CharacterizationofanovelricegeneOsATXandmodulationofitsexpressionbycomponentsofthestresssignallingpathways,PhysiolgiaPlantarum,116(1):87-95.

　　DuY.L.,2016,IdentificationandanalysisofCopperdeficiencysensitivemutantinArabidopsis,GuizhouNongyeKexue(GuizhouAgriculturalScience),44(8):80-83.

　　(杜亞琳,2016,擬南芥缺銅敏感突變體的鑒定分析,貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),44(8):80-83.)ItohS.,OzumiK.,KimH.W.,NakagawaO.,McKinneyR.D.,FolzR.J.,ZelkoI.N.,Ushio-FukaiM.,andFukaiT.,2009,NovelmechanismforregulationofextracellularSODtranscriptionandactivitybycopper:roleofantioxidant-1,FreeRadicalBiologyandMedicine,46(1):95-104.

　　作者：孫婷婷1孟令波2李淑敏