摘要:【目的】研究博落回提取物(Macleayacordataextract，MCE)的體外抗菌活性，為其在動(dòng)物生產(chǎn)中的使用和添加提供試驗(yàn)依據(jù)。【方法】以金黃色葡萄球菌、豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌為受試菌，采用抑菌圈法測定MCE對4種受試菌的抑制效果;運(yùn)用微量稀釋法測定MCE對4種受試菌的最小抑制質(zhì)量濃度(MIC)和最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC);通過時(shí)間—殺菌曲線法，測定MCE對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的殺菌效果。【結(jié)果】MCE對4種革蘭氏陽性和陰性受試菌均有一定的抑制作用，抑制能力由強(qiáng)到弱依次為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌和銅綠假單胞菌，MIC分別為64、64、128和512μg/mL，MBC分別為128、128、256和>1024μg/mL;MCE對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的體外殺菌速率隨質(zhì)量濃度升高而增快，其中8、4、2倍于MIC的MCE分別在2、12、24h可將2種受試菌完全清除，而1倍MIC的MCE在24h后仍有少量細(xì)菌存活。【結(jié)論】MCE對受試菌均有一定的抑制效果，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的體外殺菌速率呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。

　　關(guān)鍵詞:博落回提取物;抗菌活性;最小抑菌質(zhì)量濃度;最小殺菌質(zhì)量濃度;時(shí)間—殺菌曲線

　　抗生素自問世以來在保護(hù)人類和動(dòng)物健康方面發(fā)揮了重要作用。1950年代以來，養(yǎng)殖業(yè)開始使用亞治療劑量的抗生素作為促生長的飼料添加劑[1]。然而，自從抗生素促生長劑最初用于家畜生產(chǎn)以來，從家畜中分離出耐抗生素細(xì)菌的病例越來越多[2-4]。

　　抗生素的濫用、抗生素殘留以及細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生引起了世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注，很多國家或地區(qū)開始限制或完全禁止在飼料中添加抗生素，歐盟于2006年全面禁止抗生素類促生長劑的使用，美國和加拿大也正在逐步限制飼料抗生素的使用，中國于2020年7月1日開始全面禁止在飼料中添加抗生素。禁止在飼料中使用抗生素會(huì)導(dǎo)致家畜的感染率上升，從而降低畜產(chǎn)品的供應(yīng)。為了維持全球養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展和保證全球的肉類食品供應(yīng)，研究和開發(fā)有效的抗生素替代技術(shù)，是飼料行業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必經(jīng)之路[5]。

　　研究人員正在加緊研究在不產(chǎn)生耐藥性的情況下提高動(dòng)物健康的抗生素替代方案，其中藥用植物因其易降解無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性和天然成分對環(huán)境污染小等獨(dú)特優(yōu)勢引起了研究人員的關(guān)注。藥用植物在許多國家的醫(yī)學(xué)實(shí)踐中發(fā)揮著作用，如中國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)、印度的阿育吠陀醫(yī)學(xué)和尤納尼醫(yī)學(xué)。直至今天，藥用植物的使用仍然很普遍，約有80%的世界人口依賴藥用植物產(chǎn)品和補(bǔ)充劑作為主要的藥物來源[6-7]。博落回(Macleayacordata)作為多年生草本藥用植物，生物堿是其主要活性成分[8]。到目前為止，已從博落回中鑒定和分離出147種生物堿，從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，它們大多屬于異喹啉類生物堿[9]，是一種潛在的抗生素生長促進(jìn)劑替代品[10]。

　　博落回在北美、東亞和歐洲國家均有生長，北美主要分布于密西西比河以東的溫帶北部地區(qū)，中國主要分布于山西、貴州、云南、江蘇和浙江等長江中下游地區(qū)[11]。幾十年來，在許多國家，博落回提取物已被廣泛用于飼養(yǎng)牲畜。在歐洲，博落回被歐洲食品安全局(EFSA)批準(zhǔn)允許在動(dòng)物生產(chǎn)[6]中作為飼料添加劑成分使用。在中國以血根堿和白屈菜紅堿為主要成分的產(chǎn)品已經(jīng)開發(fā)成國家二類新中獸藥(2011新獸藥證字34號)和藥物飼料添加劑產(chǎn)品博落回散(獸藥添字180415250)[12]。

　　博落回作為重要的中草藥資源，其合理開發(fā)利用對于未來養(yǎng)殖減抗、飼料無抗具有重要的研究和使用價(jià)值[13]。關(guān)于博落回或其有效生物堿的體外抑菌試驗(yàn)已有文獻(xiàn)報(bào)道，試驗(yàn)菌種有細(xì)菌也有真菌，有些是動(dòng)物生產(chǎn)中常見菌種，也有些是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的常見菌種，但專門針對養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見細(xì)菌的報(bào)道較少，并且博落回提取物針對這些菌種的時(shí)間—殺菌效果尚未見報(bào)道。本研究對養(yǎng)豬業(yè)常見的4種細(xì)菌進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)，并研究博落回提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的時(shí)間—殺菌效果，以期為更全面了解博落回的抗菌活性提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)為其在動(dòng)物生產(chǎn)中的添加使用提供試驗(yàn)依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1試驗(yàn)材料

　　博落回提取物(M.cordataextract，MCE)：由本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)提取，經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)測定，其中的血根堿與白屈菜紅堿含量分別為45%和19%。受試菌株：大腸桿菌(Escherichiacoli，ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC25923)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis，ATCC13312)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，ATCC9027)均由昆明海關(guān)技術(shù)中心動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室提供。

　　1.2試驗(yàn)方法

　　1.2.1菌株活化和菌懸液制備

　　將含有保存菌種的磁珠凍存管從−80℃冰箱中取出，挑1粒磁珠放到含5mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的細(xì)菌瓶中，放入控溫?fù)u床培養(yǎng)箱(S130H，英國Stuart公司)中進(jìn)行培養(yǎng)(250r/min，37℃)。培養(yǎng)約6~8h后將細(xì)菌瓶拿出，采用麥?zhǔn)媳葷峁芊ㄓ脽o菌生理鹽水將細(xì)菌培養(yǎng)物稀釋到0.5麥?zhǔn)蠞岫龋�此時(shí)細(xì)菌密度約為1.0×108CFU/mL，按1∶100稀釋菌液至含菌量約為1.0×106CFU/mL，作為試驗(yàn)菌液。

　　1.2.2抗菌活性測定

　　抗菌活性測定采用抑菌圈法，參照LEHRER等[14]和馬衛(wèi)明[15]的具體方法進(jìn)行。在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)傾倒15mL經(jīng)高壓滅菌后冷卻至50℃的瓊脂培養(yǎng)基與100μL菌液，快速混合均勻，待瓊脂冷卻凝固后，在瓊脂板上用無菌打孔器打直徑為6mm的圓孔，孔間距大于2.5cm。在各孔中加入15μL不同質(zhì)量濃度的MCE或5mg/mL鹽酸金霉素(chlortetracyclinehydrochloride，Solarbio公司)，并設(shè)陰性對照孔。

　　將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱(ICP110，德國Memmert公司)中培養(yǎng)18h，各設(shè)3個(gè)重復(fù)，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值。抗菌活性用抑菌圈直徑表示，抑菌圈直徑=總直徑−孔直徑。最小抑菌質(zhì)量濃度(minimalinhibitorymassconcentration，MIC)、最小殺菌質(zhì)量濃度(minimalbactericidalmassconcentration，MBC)的測定和時(shí)間—殺菌曲線的繪制參考韓菲菲[16]、傅瑞春[17]和郭春娜[18]的方法進(jìn)行。

　　1.2.3MIC和MBC測定

　　取無菌96孔平底微量培養(yǎng)板，每排測定1個(gè)菌種，每個(gè)菌種做3個(gè)重復(fù)。于每排的第2~11孔將初始質(zhì)量濃度為4096μg/mL的MCE溶液進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋，于第2~12孔中加入菌懸液，使各細(xì)菌終密度約為5.0×105CFU/mL。第1孔只加培養(yǎng)液，作陰性對照，第12孔只加菌液和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，作測試組。將培養(yǎng)板置于37℃下保濕靜置培養(yǎng)18~24h;培養(yǎng)后觀察各孔底部是否有細(xì)菌沉淀產(chǎn)生，菌液清澈透明的孔為無細(xì)菌生長，未出現(xiàn)渾濁的最低質(zhì)量濃度記為最小抑菌質(zhì)量濃度，即該樣品的MIC。自沒有細(xì)菌生長的孔中取10μL培養(yǎng)液涂布于瓊脂平板上，每孔做3個(gè)重復(fù)，待完全吸收后，37℃下培養(yǎng)18~24h，仍無菌落形成的平板所對應(yīng)的MCE質(zhì)量濃度記為最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC)。

　　1.2.4MCE對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的時(shí)間—殺菌曲線繪制

　　本試驗(yàn)測定0、8、4、2、1×MIC共5個(gè)質(zhì)量濃度下MCE對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的時(shí)間—殺菌曲線。每個(gè)菌種各取5個(gè)1.5mL無菌離心管，各管加500μL菌液。

　　第1管不加MCE，在剩余4個(gè)管中將16×MIC的MCE進(jìn)行2倍稀釋，使1~5號管中MCE的終質(zhì)量濃度分別為0、8、4、2、1×MIC。將離心管置于37℃下振蕩培養(yǎng)，于0、1、2、3、6、12、24h自各管中分別取10μL菌懸液進(jìn)行10倍系列稀釋5次，每個(gè)稀釋度取3×10μL菌懸液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，待完全吸收后，37℃倒置培養(yǎng);過夜培養(yǎng)后，取3個(gè)重復(fù)總菌落數(shù)在20~300個(gè)的稀釋質(zhì)量濃度進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，求CFU平均值，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)對應(yīng)的每個(gè)離心管內(nèi)的菌液質(zhì)量濃度。原始菌液質(zhì)量濃度=菌落個(gè)數(shù)×稀釋度×10CFU/mL。相同試驗(yàn)重復(fù)3次。以作用時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，每毫升菌懸液中所含細(xì)菌數(shù)(CFU)的常用對數(shù)為縱坐標(biāo)、用GraphpadPrism8.0軟件繪制時(shí)間—殺菌曲線。

　　1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

　　試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel2007軟件進(jìn)行初步整理后，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS19.0軟件的one-wayANOVA進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著時(shí)用Duncan法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1MCE對4種受試菌的體外抗菌效果

　　不同質(zhì)量濃度的MCE對4種受試菌的抑制能力各不相同，同等質(zhì)量濃度的MCE對4種受試菌的抑制能力由強(qiáng)到弱依次是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌和銅綠假單胞菌，但本試驗(yàn)選用的3種質(zhì)量濃度的MCE對銅綠假單胞菌未表現(xiàn)出抑制能力。對除銅綠假單胞菌外的3種受試菌，隨著MCE質(zhì)量濃度的升高，抑菌能力也相應(yīng)增強(qiáng)，呈現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性，但3種質(zhì)量濃度的MCE抑菌能力均低于5mg/mL金霉素。

　　2.2MCE對4種受試菌

　　MIC和MBC的影響MCE對不同受試菌的MIC和MBC有差異(表2)。其中，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC和MBC相同，分別為64和128μg/mL;對豬霍亂沙門氏菌的MIC和MBC分別為128和256μg/mL;對銅綠假單胞菌的MIC最高，為512μg/mL，測定MBC時(shí)發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為1024μg/mL的MCE與其混合培養(yǎng)24h后仍不能將其殺滅。除銅綠假單胞菌外，其余3種受試菌的MBC均是其MIC的2倍。

　　3討論

　　腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收和代謝的主要場所，是動(dòng)物體最大的營養(yǎng)吸收器官。此外，腸道還具有屏障和免疫功能，能防止病原微生物的入侵，保護(hù)機(jī)體健康。腸道的健康水平關(guān)系動(dòng)物整體健康和生產(chǎn)性能的發(fā)揮。腸道健康時(shí)微生物群和腸道處于共生平衡狀態(tài)，動(dòng)物的消化吸收、生長發(fā)育和機(jī)體免疫不受影響[19]。

　　當(dāng)這種平衡狀態(tài)被打破時(shí)，腸道內(nèi)環(huán)境易受大腸桿菌等病原微生物的侵襲，導(dǎo)致仔豬抵御病原微生物能力下降，造成營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收障礙，引起仔豬腹瀉等腸道疾病的發(fā)生。抗生素被用于防控仔豬腹瀉。抗生素的濫用加速了耐藥菌株的產(chǎn)生，造成豬肉中抗生素的嚴(yán)重殘留，引起生態(tài)環(huán)境的污染[20]。抗生素的濫用，抗生素殘留、細(xì)菌耐藥性和環(huán)境污染等問題已經(jīng)引起全世界的高度重視，“無抗”已經(jīng)成為未來飼料業(yè)發(fā)展的趨勢。

　　伴隨著飼料行業(yè)“無抗”時(shí)代的來臨，新型綠色抗生素替代品已成為當(dāng)今飼料行業(yè)的研究熱點(diǎn)。博落回作為全世界廣泛使用的藥用植物，被認(rèn)為具有很好的抑菌效果[6-7,9]，在世界藥學(xué)實(shí)踐中既有使用地域的廣度，又有使用歷史的深度，MCE在仔豬生產(chǎn)中具有“替抗”的潛力。抗菌活性是博落回及其生物堿具有的眾多活性之一，也是在動(dòng)物生產(chǎn)中備受重視的活性之一。

　　研究其抗菌效力，有助于在動(dòng)物生產(chǎn)中的使用及添加。抑菌圈試驗(yàn)、MIC與MBC測定和時(shí)間—殺菌曲線常用來檢驗(yàn)藥物體外抗菌活性。其中，抑菌圈試驗(yàn)是一種定性或半定量的方法，MIC與MBC是一種定量方法，在抗菌藥物質(zhì)量濃度低于MIC時(shí)易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥突變菌株，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥發(fā)生[21];時(shí)間—殺菌曲線用于檢驗(yàn)藥物隨時(shí)間變化對菌株的殺滅效果。本研究采用3種方法測定MCE體外抑菌的效果、質(zhì)量濃度和速率。

　　MIC和MBC檢測結(jié)果與抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果總體趨勢一致，即相同質(zhì)量濃度的MCE對這4種受試菌的抑制能力由強(qiáng)到弱依次是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌和銅綠假單胞菌。但本試驗(yàn)選用的3種質(zhì)量濃度MCE的抑菌能力均低于5mg/mL金霉素。MCE除了具有抑菌能力外，還具有炎性調(diào)節(jié)和免疫力調(diào)節(jié)等作用，因此，雖然在質(zhì)量濃度接近的情況下，MCE抑菌能力不如專用抗生素效果好，但并不影響其作為飼料添加使用。KHIN等[6]研究了博落回提取物、血根堿和白屈菜紅堿對野生型、多重耐藥金黃色葡萄球菌的抗菌活性，結(jié)果表明：3~10μg/mL的血根堿和白屈菜紅堿對金黃色葡萄球菌均有完全抑制作用，其抗菌活性與氯霉素相同或更強(qiáng)。

　　趙東亮等[22]和王朝元等[23]研究均發(fā)現(xiàn)：博落回生物堿對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，趙東亮等[22]還發(fā)現(xiàn)：博落回生物堿對大腸桿菌無效果。胡貴麗等[24]研究發(fā)現(xiàn)：博落回血根堿對沙門氏菌高度敏感，對金黃色葡萄球菌中度敏感，對大腸桿菌低度敏感，其中，博落回血根堿對沙門氏菌的抑菌效果優(yōu)于青霉素鈉。這些研究與本試驗(yàn)的結(jié)果均有不同之處，可能是由于采用的試驗(yàn)材料、添加質(zhì)量濃度、有效生物堿含量以及藥物對照不同所致。KOSINA等[25]用S.aureusCCM3953、S.aureusCCM4223、P.aeruginosaCCM3955、E.coli(CCM4225和CCM3954)以及S.agalactiae作為受試菌研究了博落回不同部位提取物和其生物堿的抗菌活性，結(jié)果表明：對于大多數(shù)受試菌，博落回不同部位提取物隨著血根堿(SG)和白屈菜紅堿(CHE)質(zhì)量濃度的升高，抗菌活性增強(qiáng)，但不同部位提取物的抗菌活性都低于血根堿和白屈菜紅堿本身的抗菌活性。他們在研究中還發(fā)現(xiàn)：SG和CHE對P.aeruginosa的抗菌活性較弱。

　　我們的試驗(yàn)結(jié)果與這一發(fā)現(xiàn)一致，在抑菌圈試驗(yàn)中所選的3種質(zhì)量濃度的MCE均未對P.aeruginosa表現(xiàn)出抑制效果，而5mg/mL金霉素對P.aeruginosa有抑制活性，抑菌圈直徑為9.38mm，這也說明選用的3種質(zhì)量濃度的MCE對P.aeruginosa的抑菌效果不如5mg/mL金霉素。測定MBC時(shí)發(fā)現(xiàn)：質(zhì)量濃度為1024μg/mL的MCE與P.aeruginosa共同培養(yǎng)24h后雖表現(xiàn)出一定的抑制效果，但仍不能將其完全殺滅。

　　農(nóng)業(yè)論文范例： 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)水稻病蟲害防治對策

　　4結(jié)論

　　MCE對4種革蘭氏陽性和陰性受試菌均有一定的抑制作用，抑制能力由強(qiáng)到弱依次為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌、銅綠假單胞菌，其中MCE對銅綠假單胞菌抑制能力最弱，MBC>1024μg/mL;2、4、6mg/mL的MCE抑菌能力均低于5mg/mL金霉素;MCE體外殺菌速率隨質(zhì)量濃度升高而增快，呈現(xiàn)濃度依賴性。

　　[參考文獻(xiàn)]

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　　作者：韓佃剛1,2#，楊宏清3#，信吉閣3，車麗濤4，張春勇1，楊云慶2，董　俊2，郭榮富1**