摘要分子生藥學是在分子水平上研究生藥的分類與鑒定、栽培與保護及有效成分生產的一門科學，分子生藥學的提出讓生藥的研究從微觀向基因水平邁進。葛根作為藥食兩用植物，具有很高的應用價值和經濟價值，品種眾多容易造成混亂且根據傳統的鑒定方法不易區分鑒別、且葛根在基因水平上的研究尚淺，因此分子生藥學對葛根的研究得到學者的廣泛關注。該文綜述了近年來分子生藥學在葛根分子鑒定、轉錄組測序研究、葛根功能基因的克隆和合成等方面的研究，以期為進一步推動葛根及其有效成分的開發和利用提供參考。

　　關鍵詞葛根;分子生藥學;基因;分子標記

　　葛根為豆科葛屬植物葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi(習稱野葛)的干燥根，具有解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽止瀉，通經活絡，解酒毒等功效[1]。在現行《中國藥典》中收錄了2個葛屬植物品種：葛根和粉葛，但是在2005年版藥典之前未將兩者分開，均作為葛根使用。葛根是中國衛生部首批批準的藥食兩用植物，素有“北參南葛”、“亞洲人參”之美譽，具有很高的應用價值和經濟價值。葛根在化學成分、藥理藥效機制和配伍臨床應用等方面的研究已較為深入，隨著后基因組時代的來臨，分子技術的不斷進步，葛根在分子層面上的相關研究逐步被報道。本文綜述了近年來分子生藥學在葛根分子鑒定、轉錄組測序、葛根功能基因的克隆和合成研究等方面的研究，以期為進一步推動葛根及其有效成分的開發和利用提供參考。

　　1分子鑒定研究

　　分子鑒定是根據植物的親緣關系來鑒別，親緣關系越近，基因遺傳相似度越高。葛屬植物因其品種多，性狀表達多樣化，研究者根據傳統的性狀、顯微和簡單的理化鑒別不易區分，因此，隨著分子技術的發展，已有多種分子鑒定方法被報道在葛屬植物中使用。

　　1.1分子標記技術

　　DNA分子標記技術是以生物個體間遺傳信息的核苷酸差異為基礎的標記技術，是在DNA水平遺傳多態性的直接反應，進而揭示生物內在基因的排布規律及其表型性狀的表現規律。DNA分子標記的優勢在于：不受外界環境、發育階段的影響;在生物生長發育各個階段、各個組織均能檢測到;標記位點分布廣泛，數量眾多;④表現為顯性或共顯性，有利于對隱性基因的選擇;⑤許多分子標記技術能提供較為完整的遺傳信息，可區分植物個體的純合子和雜合子基因型[2-4]。分子標記以其獨特的優勢，并且操作簡便，結果準確性高，特異性強等優點，已經被廣泛的用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構建、種質資源鑒定與分類，分子輔助育種[5]等領域。

　　常用的分子標記技術有：RFLP(限制性內切酶片段長度多態性)、AFLP(擴增限制性內切酶片段長度多態性)、RAPD(隨機擴增多態性)、ISSR(簡單序列重復區間擴增多態性)、SSR(簡單重復序列)、SRAP(相關序列擴增多態性)、SNP(單核苷酸多態性)、SCoT(目標起始密碼子多態性)、DNA條形碼分析技術等[6-8]。

　　1.1.1RAPD分子標記

　　隨機擴增多態性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)標記技術是1990年美國學者Williams和Welsh2個研究團隊同時發展起來的。RAPD標記的分離情況符合孟德爾遺傳規律，可作為一種有效的分子標記技術。因其操作簡單、實驗成本低、所需DNA量極少、檢測效率高等優點，已被廣泛用于親緣關系與種質資源多樣性研究、構建DNA指紋和種子純度的鑒定、構建分子標記連鎖圖、基因定位和數量性狀的選擇、分子雜交育種等[9,10]。

　　曾明等[11]為探討葛屬植物間的親緣關系，利用RAPD技術對葛屬6種植物進行分析，以確定它們之間的分類位置，聚類分析表明，葛麻姆P.montana(Lour.)Merr.和粉葛P.thomsoniiBenth不應作為葛P.lobata(Willd.)Ohwi.的變種，應獨立成種;峨眉葛P.omeiensisWangetTang不能作為一個獨立的種，應歸屬于葛。唐俊[12]通過RAPD分子標記技術對13份葛屬植物進行遺傳多樣性分析，從72個隨機引物中篩選出18個RAPD引物，共擴增出171個標記，多態性標記達80%，聚類分析表明，當遺傳距離為0.53時，可將13份葛種質分為5類，且分類之間與地理分布上呈一定的相關性。

　　BettinaHeider等[13]通過RAPD標記分析了5個葛P.lobata(Willd.)Ohwi.和16個三裂葉野葛P.phaseoloides種質的種群間遺傳變異，發現大多數變異是在種群之間或無性繁殖下的種質之間發現的，而不是在內部發生的;同時篩選出12個引物對葛進行擴增，共擴增出46個條帶，多態性標記占54.3%;聚類表明，將5份材料聚為3類。聚類方式反映了采集的地理位置，并證實了在山谷內的遺傳相似系數在0.71~0.87;并篩選出3個引物對16份三裂葉野葛進行擴增，共擴增出11個條帶，多態性條帶占45.55%，聚類分析表明，當遺傳相似系數在0.31時，分為2個類群，它們進一步分為6個亞類，三裂葉野葛的取樣地點的地理分布偏離了材料的聚類，與葛的研究結果形成了對比。

　　景戌等[14]利用RAPD分子標記對12份重慶不同來源的葛根種植資源遺傳多樣性分析，并根據葛根素含量進行聚類分析，12個RAPD引物共擴增出109個條帶，多態性條帶占64.41%，葛根材料的遺傳距離在0.00~0.36之間，平均距離為0.19;RAPD分析的聚類分析表明，當遺傳相似系數為0.2時，將12個葛根材料分為3類，依據葛根素含量進行聚類分析表明，當遺傳相似系數為2.5時，將12個葛根材料分為3類;兩者聚類分析都將12份葛根聚類為3類，但分類情況有所不同，應將兩者結合并增大樣本量分析才能準確的進行劃分。

　　周精華等[15]人通過RAPD分子標記對葛種質資源遺傳多樣性和親緣關系分析，篩選出10個引物對8份葛材料進行擴增，共擴增出99個條帶，多態性比率為65.65%，遺傳相似系數0.626~0.939，聚類分析表明，當遺傳系數為0.740時，將8份葛材料分為4類，且聚類分類與地理來源有關。紀寶玉等[16]利用RAPD分子標記技術與葛根素的測定相結合的方法對11個不同產地的葛進行遺傳多樣性分析，11個地區葛的葛根素為3.26%~7.10%，篩選出8個RAPD引物，共擴增出45個條帶，多態性比率為82.22%;聚類分析表明11個不同產地葛被分為3大類，且聚類的親緣關系與地理分布距離相關，且與葛根素含量相結合的RAPD分析表明不同地區葛根藥材中葛根素含量與樣品間的遺傳相似性無顯著關系。

　　魏文愷[17]采用RAPD標記對山西6個主要產地的葛資源進行遺傳多樣性和親緣關系分析，將6個不同產地的晉產葛分為3類。有研究表明，RAPD標記的可靠性低于RFLP，SSR，AFLP3種分子標記，并且RAPD為顯性標記，在遺傳多樣性分析中很容易將非同源的擴增片段誤認為同一位點，因此而產生數據統計錯誤[18]。RAPD反應容易受到外界因素影響，重復性和穩定性較差，限制了其進一步的發展。

　　1.1.2SSR分子標記

　　簡單重復序列(SSR)，也被稱為微衛星DNA[19]，是由1~6個單核苷酸為重復單元串聯的重復序列。因其操作簡單方便、通用性強、分辨率高、重復性好且僅需少量DNA樣品，已被廣泛應用于遺傳多樣性分析、種質鑒定、構建遺傳連鎖圖譜、基因定位與克隆、數量性狀基因位點分析、構建DNA指紋圖譜等研究。周榮榮等[20]人利用SSR分子標記對江西不同種質的粉葛進行遺傳多樣性分析，用生物信息學的方法去尋找葛和甘葛藤基因組SSR序列，并尋找其差異基因，根據其差異基因設計了20對SSR引物，篩選出5對多態性強、擴增帶型穩定、重復性較好的引物對江西9個粉葛品種進行遺傳多樣性分析，共檢測到32個等位基因，16個多態性位點。

　　聚類分析表明，遺傳相似系數變異范圍為0.5433~1.000，平均遺傳相似系數為0.7359，將9個江西粉葛分為3大支，5對核心引物可將其準確區分為6類粉葛種質，說明可能存在“同物異名”或親緣關系非常接近的情況。微衛星的分辨能力比以前可用的標記更高，可以檢測源自特定親本的等位基因的種群行為[21]。但是SSR標記的分析可能會帶來假陽性結果，導致DNA復制過程中聚合酶滑移、空等位基因或重疊的SSR，并且開發和合成引物投入高、難度大、相對費時[22]。高昂的成本價格和開發的困難是制約SSR分子標記發展的主要原因。

　　1.2DNA條形碼

　　DNA條形碼技術是分子鑒定的最新發展方向，它是利用一段短而標準的DNA序列作為標記來實現快速、準確和自動化物種鑒定的方法。2003年由加拿大科學家Herbert提出DNA條形碼的概念[38]，2015年正式被收錄進《中國藥典》并構建中藥材DNA條形碼數據庫。適用于植物的條形碼主要包括psbA-trmH，rbcL，rpoC1，rpoB，matK，ITS，ITS2等。

　　DNA條形碼技術不受生長發育階段、生態環境及個體形態的限制，樣本用量少，鑒定結果準確、可重復性好且對操作人員要求不高，可以準確地對中藥進行分析鑒定。曾明等[39]人利用DNA條形碼技術對葛屬植物葛、粉葛和葛麻姆等進行親緣關系分析，表明粉葛應作為葛的變種，葛麻姆應獨立成種，且ITS序列分析的結果與從化學成分分類的結果相吻合，但分析結果與使用RAPD分子標記技術分析的結果不同，RAPD標記結果支持山葛和粉葛不應作為葛的變種，應獨立成種[11]。

　　RAPD分子標記因其技術本身的局限性，導致結果不完全可靠，ITS序列分析結果更準確，是鑒定葛屬植物的有效分子標記技術。為了從基因層面上為葛根進行選育優良品種，余智奎[40]利用DNA條形碼技術對葛根種質資源的基因型進行研究并結合藥效成分進行評價，結果表明，葛根ITS序列變異較大，基因型較多，共分為13個基因型;利用藥效成分含量進行評價，發現基因型不同是導致葛根中葛根素含量差異的原因之一，但是不同基因型總黃酮含量無明顯變化;葉綠體基因trnL內含子序列無變異，僅一個基因型，葉綠體基因psbK-psbI和trnH-psbA序列變異結果都將24個樣品分為2個基因型，且堿基位點變異與產地相關。每個物種DNA中G+C的含量是特定的，能夠反映屬種之間的親緣關系。

　　蔣向輝等[41]人基于ITS序列對11份葛屬種質資源進行親緣關系研究，結果表明，11份葛屬種質的ITS序列G+C含量差異大，G+C含量在52.98%~59.89%之間，最大相差6.91個百分點;遺傳距離為0.002~0.792;同時采用MP，NJ和UPGMA3種不同系統發育樹構建方法進行分析，均將11份種質分為2大支，但各自分析結果有所不同，應該綜合3種聚類方法獲得更可靠的結果。同時蔣向輝等[42]人通過形態學和rDNAITS序列方法對葛屬植物分類進行一致性比較，兩種方法的分類結果雖有一定的相似性，但仍存在較大的差異。形態學特征容易受到生長條件、性狀選取等多方面因素影響，因此，基于ITS序列的分類結果更為可靠。

　　2葛根轉錄組測序技術研究進展

　　轉錄組是后基因組時代最活躍的學科之一，轉錄組測序技術是研究葛根轉錄組學的重要手段，第2代高通量測序技術是當前轉錄組測序中最主要的分析技術。

　　Han等[48]人利用轉錄組測序技術，從葛根5種不同組織中獲得了9300萬個fastq格式讀數，隨后通過CLC從頭組裝方法，最終總共產生了83401個重疊群，有26245個重疊群產生了相應的GO術語，獲得了對應于16380個重疊群的1348個獨特的酶，并隨后使用KEGG檢索到了途徑;根據功能注釋結果，預測了45個重疊群，它們代表了大豆苷元生物合成的7個關鍵酶;通過檢索注釋數據，檢索到了41個表達的ABC轉運蛋白;在數據集中有49個重疊群被標注為葡萄糖基轉移酶。

　　Wang等[49]人利用轉錄組測序技術對葛進行轉錄組分析，獲得了13.3G的有效數據，并從頭組裝出163625個單基因，其中70593個單基因(占組裝單基因的43.1%)在Nr蛋白數據庫中被成功注釋，有22684個單基因被歸類為25個KOG類別，有46467個單基因被分配給GO術語，有23949個單基因在KEGG數據庫中被注釋，并分配到308條不同的途徑;在葛轉錄數據庫中，鑒定出54個異黃酮生物合成相關的結構基因序列，預測了117個單基因編碼PIUGTs，確定了51個編碼異黃酮O-甲基轉移酶的假定單基因，并且有327個單基因被鑒定為假定的MYB轉錄因子。

　　Nithiwat等[50]人利用高通量測序技術，對泰國葛根(Puerariacandolleivar.mirifica)的幼葉、成熟葉、塊莖皮層和去皮塊莖的聯合組織進行轉錄組分析，總共產生了約8.2G的堿基對，重新組裝產生了166923個重疊群和104283個單基因;166923個重疊群，用于使用蛋白質數據庫進行功能注釋，并作為識別可能參與異黃酮和葛雌激素生物合成的基因庫;在轉錄庫中，鑒定了21個可能參與異黃酮生物合成的基因，鑒定了85個可能編碼MYB轉錄因子的基因;經qRT-PCR驗證，這些單基因的DEG值在塊莖皮質的表達水平高于其他三種組織。

　　3葛根功能基因的克隆及合成途徑研究

　　傳統中藥材的有效成分絕大多數是次生代謝產物，其合成途徑復雜，反應過程往往需要十幾個甚至幾十個酶的催化，因此，找到形成特定產物的關鍵酶就成為對藥材進行合成的分子機理與調控研究的關鍵步驟，從而進一步利用基因工程技術生產藥用植物的有效成分。葛根中含有異黃酮類、葛酚苷、香豆素類、三萜類、淀粉、多糖等成分[54]。葛根的藥用成分主要是異黃酮類化合物，其主要有效成分包括葛根素、大豆苷和大豆苷元等次生代謝物，具有保護心腦血管系統、降血糖和血脂、抗腫瘤、抗氧化、解酒等生物活性[55]，分別按照相應生物合成途徑而產生。

　　4展望

　　分子生藥學是指在分子水平上研究生藥的分類與鑒定、栽培與保護及有效成分生產的一門科學[69]。分子生藥學是生藥學和分子生物學兩學學科交叉融合的產物，1995年由黃璐琦等[70]首次提出，分子生藥學的提出讓生藥的研究從宏觀表型性狀和微觀的顯微、化學成分等研究向基因水平邁進，強化了對生藥細胞、組織、器官、有機體、種群等層次的重新認識和思考。

　　隨著生物技術手段的飛快發展，分子生藥學已經在生藥分子鑒定、藥用動植物的系統進化和種質資源評價及保存、藥用動植物瀕危機制及保護、藥用植物活性成分的生物合成及調控、藥用動植物的道地性及分子機理等方面已有了廣泛的應用[71]。DNA分子鑒定技術具有特異性強、靈敏度高等明顯優勢，可作為葛屬植物的生藥鑒定手段，實現葛屬植物品種鑒定，區分葛根及其混偽品。

　　一些新型的分子標記技術例如SCoT分子標記技術、SRAP分子標記技術和DNA條形碼技術等，對葛屬植物的分類、混偽品及亞種之間的鑒定結果更為準確，但在葛屬植物中運用較少，應結合這些分子鑒定方法使鑒定更為準確。利用分子生藥學技術對葛根有效成分的生物合成及相關基因的研究尚處于起步階段，雖然已有學者對部分葛根有效成分合成相關基因進行了克隆和分析，但大部分調控代謝產物合成的基因還未有研究報道。

　　中藥論文投稿期刊：《中國現代中藥》原名《中藥研究與信息》，1999年3月創刊，是國家中醫藥管理局主管，中國中藥協會、中國醫藥集團總公司、中國藥材公司主辦的國內外公開發行的中藥行業綜合性科技期刊，月刊，2006年更名為《中國現代中藥》。

　　在今后的研究中，可充分利用多組學技術聯合分析，充分挖掘次生代謝產物生物合成的相關基因、基因酶、轉錄因子、調控蛋白以及次生代謝途徑等，建立次生代謝產物生物合成的相關模型，從而更好的理解葛根有效生物合成的相關分子機制。隨著后基因組時代的到來，對葛根基因組學大數據更容易獲得，從而從分子機制和基因組學的研究上解決葛屬植物在分類中的疑惑以及將野葛和粉葛臨床用藥實現本質區分，葛根分子生藥學研究具有廣闊的發展前景。

　　參考文獻

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　　[7]陳士林，吳問廣，王彩霞，等.藥用植物分子遺傳學研究[J].中國中藥雜志，2019，44(12)：2421.

　　作者：楊碧穗1，黃秋連1，謝璐欣1，吳波1，鄧可眾1，吳志瑰1，朱衛豐1，何紹浪2，黃琦3，朱玉野4，葛菲