《刺五加多糖對糖尿病大鼠代謝功能的影響及作用機制》論文發表期刊：《北華大學學報(自然科學版)》；發表周期：2021年03期

《刺五加多糖對糖尿病大鼠代謝功能的影響及作用機制》論文作者信息：張海燕( 1993—) ，女，碩士，醫師，主要從事內分泌疾病基礎及臨床研究; 通信作者: 熊莉華 ( 1973—) ，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事內分泌疾病基礎及臨床研究．

　　摘要：目的 探討刺五加多糖對糖尿病大鼠代謝功能的影響及作用機制方法 尾靜脈注射鏈脲佐菌素聯合高脂飲食制備2型糖尿病大鼠模型，隨機分為模型組、刺五加多糖低劑量組(60 mg/kg)、中劑量組(120 mg/kg)、高劑量組(240mg/kg);另設置普通飼料喂養的大鼠為對照組·連續給藥6周后觀察大鼠的一般狀況，腹主動脈取血，檢測空腹血糖、糖化血紅蛋白、血脂指標、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛水平，取血后迅速分離肝臟組織，進行HE染色：采用Western blot檢測葡萄糖轉運蛋白4Glucose transporter 4，GLUT-4)、胰島素受體底物2(Insulin receptor substrate 2.1RS-2)、過氧化物酶體增殖物激活受體y(Peroxisome proliferator-activated receptor-y，PPAR-y)、磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3kinase，P13K)、磷酸化Akt蛋白表達水平結果 與模型組大鼠比較，刺五加多糖中、高劑量組大鼠體質量明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05);刺五加多糖各劑量組大鼠12h飲水量、尿量、進食量均明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05).與模型組大鼠比較，刺五加多糖中、高劑量組大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白水平明顯降低，高密度脂蛋白水平明顯升高;刺五加多糖低、中、高劑量組大鼠SOD、過氧化氫酶、谷胱甘腳過氧化物酶水平明顯升高，丙二醛水平明顯降低上述差異均具有統計學意義(P<0.05)，與模型組大鼠比較，刺五加多糖中、高劑量組GLUT-4.IRS-2.PPAR-y、PI3K、磷酸化Akt蛋白表達水平明顯升高，刺五加多糖低劑量組GLUT-4、PPAR-y蛋白表達水平明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.0).結論 刺五加多糖在改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝中療效確切，激活IRS-2/P13K/磷酸化Akt信號通路和上調GLUT-4和PPAR-y表達是其作用機制之一.

　　關鍵詞：糖尿病大鼠;刺五加多糖：代謝功能;肝臟;作用機制

　　Abstract: Obiective To investigate the effect of Acanthopanax senticosus polysaccharides on metabolic function and its mechanism in diabetic rats. Method The rat model of tvpe 2 diabetes mellitus was established by tail injection of streptozotocin combined with high-fat diet. The rats were randomly divided into model group. low-lose Acanthopanax senticosus polysaccharide group (60 mg/kg) , medium-dose Acanthopanax senticosus polysaccharide group (120 mg/kg) and high-dose Acanthopanax senticosus polysaccharide group (240 mg/kg) . The rats fed with nommal diet were set as control group. After 6 weeks of continuous administration, the general condition of rats wasobserved. Blood samples were taken from abdominal aorta to detect the levels of fasting blood glucose , glycosylated hemoglobin, fasting insulin , blood lipid index , superoxide dismutase (SOD) , catalase , glutathione peroxidase and malondialdehyde. Westem blot was used to detect the expression of glucose transporter 4 (GLUT-4) , insulin receptor substrate 2 (IRS-2) . peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPAR-y) , phosph-atidylinositol 3-kinase (PI3K) and phosphorylated Akt protein. Results Compared with the model group. the body weight of rats in medium and high dose groups of Acanthopanax senticosus polysaccharide increased significantly (P<0.05): The amount of drinking water, urine and food intake of rats in low, medium and high dose groups of Acanthopanax senticosus polysaccharide decreased significantly (P<0.05) . Compared with the model group, the levels of fasting blood glucose, glycosylated hemoglobin, triglyceride, total cholesterol and lowdensity lipoprotein significantly decreased, while the levels of high-dlensity lipoprotein significantly increased in the medium and highdose Acanthopanax senticosus polysacchar groups (P<0.05) . The levels of SOD, catalase and glutathione peroxidase in low, medium and high dose Acanthopanax senticosus polysacchar groups significantly increased, while the level of malondialdehvde significantly decreased (P<0.05) . Compared with the model group, the protein expression levels of GLUT-4. IRS-2. PPAR-y, PI3K and phosphorylated Akt in the medium and high dose groups of Acanthopanax senticosus polysacchar significantly increased, and the protein expression levels of GLUT4 and PPAR-y in the low dose group of Acanthopanax senticosus polysacchar significantly increased (P <0. 05 ).Conclusion Acanthopanax senticosus polysacchar has a definite effect on improving glucose and lipid metabolism in type 2 diabetic rats. One of its mechanisms is to activate IRS-2/PI3K/phosphorylated Akt signaling pathway and uptregulate the expression of GLUT-4 and PPAR-y.

　　Key words: diabetic rats: Acanthopanax senticosus polysacchar: metabolic function: liver: mechanism of action

　　2型糖尿病的發生與發展是多種因素共同作用的結果，隨著病程的進展，會出現視網膜病變、腎損傷等一系列并發癥[1.2型糖尿病臨床主要通過注射胰島素和口服降糖藥來控制血糖，為進一步提升血糖控制效果，近年來中藥制劑受到了廣泛關注2刺五加主要分布于我國吉林、黑龍江、遼寧、河北等省區，具有“補中益精”的作用[3]對于刺五加全藥降糖作用已有研究報道，但仍未明確其中具體起效的成分，這不利于刺五加相關降糖藥物的開發與應用[1.目前，從天然藥物中發現的降糖成分包括生物堿、多糖、皂苷、黃酮等[].本研究通過動物學實驗來探討刺五加多糖對糖尿病大鼠代謝功能的影響及作用機制，旨在為降糖中藥制劑的研發提供參考.

　　1材料與方法

　　1.1 動物與主要試劑

　　清潔級雄性Wistar大鼠(中國科學院上海實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK(滬)20140004)100只，6周齡，體質量130-170 g.刺五加多糖(寧波金艾農生物科技有限公司，總收率為原刺五加質量的0.61%，HPLC純度>90%);鏈脈佐菌素(上海撫生生物有限公司);血m糖、糖化血紅蛋白、血脂指標檢測試劑盒(北京九強生物股份有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒(武漢明德生物股份有限公司);葡萄糖轉運蛋白4(Glucose transporter 4，GLUT4)、胰島素受體底物2(Insulin receptor substrate 2，1RS-2)、過氧化物酶體增殖物激活受體y(Peroxisome proliferatoractivated receptor-y，PPAR-y)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosph-atidylinositol 3kinase，PI3K)、磷酸化Akt一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗(北京博奧森生物有限公司).

　　1.2方法

　　1.2.1 2型糖尿病大鼠模型制備

　　100只Wistar大鼠適應性喂養7d，室溫24℃，濕度60%，燈光模擬晝夜交替，自由飲水和進食隨機分為對照組15只，實驗組85只對照組僅給予普通飼料;實驗組給予高脂飼料，具體配方：1.5%膽固醇，0.25%膽酸鈉，10%豬油，5%蔗糖，83.25%基礎飼料喂養4周后禁食12 h，按30 mg/kg劑量尾靜脈注射鏈脲佐菌素制備2型糖尿病模型，注射鏈脲佐菌素72h后尾靜脈取血，檢測血糖水平，選擇其中60只血糖超過11.1 mnol/L的大鼠進行后續實驗.

　　1.2.2 分組與給藥

　　將60只造模成功的大鼠隨機分為模型組、刺五加多糖低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組15只對照組和模型組大鼠按10 ml./kg每日給予蒸餾水灌胃;刺五加多糖低劑量組、中劑量組、高劑量組根據刺五加人體臨床用藥上限的2倍、4倍、8倍劑量折算，即刺五加多糖給藥劑量分別為60，120.240 mg/kg，制成10 ml./kg藥液灌胃，連續給藥6周.

　　1.2.3 一般狀況觀察及生化指標檢測給藥6周結束后測定大鼠的體質量，使用代謝籠測定大鼠12h的飲水量、尿量、進食量禁食8h，腹主動脈取血，3000 r/min離心10 min，收集血清，

　　-20℃保存待測·檢測大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白、血脂指標、SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛水平.

　　1.2.4 肝臟組織病理學檢測

　　取血后迅速分離大鼠肝臟組織，放于冰上切取部分組織-80℃保存，用于Western blot檢測.其余肝組織石蠟包埋、切片后行HE染色，光學倒置顯微鏡下拍照，分析組織病理學改變.

　　1.2.5 胰島素信號通路相關蛋白表達情況Wetern blot檢測大鼠肝組織中GLVT-4、IRS-2 PPAR-y、PI3K、磷酸化Akt蛋白表達水平.取標本組織放于培養皿中，剪成組織碎塊放入離心管中，加入磷酸緩沖液進行組織勻漿，冰上靜置20 min，4℃ 12000/min離心10 min，收集上清液放入新離心管中，BCA試劑盒測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，濕法轉至PVDF膜上，按說明書比例將稀釋后的一抗加至PVDF膜，將膜完全覆蓋，搖床上4℃過夜，次日加稀釋后的二抗，2h后顯影，ImageJ讀取條帶上的灰度值.

　　1.3 統計學分析

　　應用SPSS 21.0對數據進行處理與統計學分析，實驗數據以均數土標準差(s)表示，進行方差分析和1檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義.

　　2果

　　2.1 各組大鼠體質量、飲水量、尿量及進食量模型組大鼠體質量明顯高于對照組大鼠，12 h飲水量、尿量、進食量明顯高于對照組大鼠，差異均具有統計學意義(P<0.01).與模型組大鼠比較，刺五加多糖中、高劑量組大鼠體質量明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05);刺五加多糖各劑量組大鼠12h飲水量、尿量、進食量均明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05).見表1.

　　2.2 各組大鼠糖脂代謝指標模型組大鼠各糖脂代謝指標與對照組之間比較差異均具有統計學意義(P<0.01);與模型組大鼠比較，刺五加多糖中、高劑量組大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白水平明顯降低，高密度脂蛋白水平明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05).見表2.

　　2.3各組大鼠氧化應激指標

　　模型組大鼠SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平均明顯低于對照組，丙二醛水平明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.01);與模型組大鼠比較，刺五加多糖低、中、高劑量組大鼠SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平明顯升高，丙二醛水平明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05).見表3.

　　2.4 刺五加多糖對大鼠肝臟病理學改變的影響

　　對照組大鼠肝組織結構清晰，細胞排列整齊且 形態完整.模型組大鼠肝組織出現明顯的病理學改 變，表現為肝細胞大泡性的脂肪樣變、肝索排列紊 亂、肝靜脈擴張、細胞腫脹.刺五加多糖低劑量組大 鼠肝組織肝索排列欠整齊，部分肝細胞腫脹; 中劑 量組大鼠肝組織肝索排列較整齊，少量肝細胞腫脹 和淡染; 高劑量組大鼠肝組織肝索排列較整齊，很 少見腫脹肝細胞.見圖 1.

　　2.5 刺五加多糖對大鼠胰島素信號通路相關蛋白 表達的影響

　　模型組胰島素信號通路相關蛋白 GLUT-4、 IRS-2、PPAR-γ、PI3K、磷酸化 Akt 的表達水平均明顯高于對照組，差異具有統計學意義( P<0.05) ; 與模型組大鼠比較，刺五加多糖中、高劑量組 GLUT- 4、IRS-2、PPAR-γ、PI3K、磷酸化 Akt 蛋白表達水平明顯升高，刺五加多糖低劑量組 GLUT-4、PPAR-γ蛋白表達水平明顯升高，差異具有統計學意義( P< 0.05) .見圖 2、表 4.

　　3 討 論

　　本研究通過脲佐菌素聯合高脂飲食誘導糖尿病大鼠模型，結果顯示: 模型組大鼠體質量明顯低 于對照組大鼠，且出現多飲水、多進食、多尿量的典 型 2 型糖尿病癥狀，提示造模成功.刺五加多糖能夠明顯改善大鼠多飲水、多進食、多尿量的癥狀，提 示刺五加多糖具有抗 2 型糖尿病的藥理活性.2 型糖尿病患者多伴有不同程度的糖脂代謝紊亂，高脂血癥又會進一步加重胰島素抵抗[6].本研究結果顯示: 刺五加多糖中、高劑量能夠有效降低 2 型糖尿病大鼠的血糖和血脂水平，進一步證明了刺五加多糖對 2 型糖尿病大鼠糖脂代謝的回調作用.

　　氧化應激是活性氧等物質因清除率下降所致 的體內抗氧化防御與自由基生成之間平衡失調，在糖尿病及其并發癥發生、發展過程中發揮重要作 用[7].SOD 是清除氧自由基的主要活性酶之一[8]; 過氧化氫酶能夠較好地清除細胞產生的過氧化氫， 在維持細胞氧化平衡中發揮重要作用[9]; 谷胱甘 肽過氧化物酶是在人體中廣泛存在的催化氧化酶，能夠清除氧自由基[10 血清SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平變化能夠較好地反映出體內脂質過氧化程度.本研究結果顯示：刺五加多糖低、中、高劑量組大鼠SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平明顯高于模型組，丙二醛水平明顯低于模型組，提示刺五加多糖能夠有效降低2型糖尿病大鼠的氧化應激水平，提高抗氧化能力.肝臟在維持血糖穩定方面發揮關鍵作用，是機體糖代謝的重要器官[1].本研究結果顯示：刺五加多糖能夠有效改善2型糖尿病大鼠肝臟病理學改變，減輕肝細胞腫脹及中心粒細胞浸潤程度，有利于糖脂代謝指標的改善.肝臟糖代謝異常能夠引發胰島素抵抗，胰島素在肝臟中主要通過1RS-21

　　P13K/磷酸化Akt信號通路發揮作用[12.同時，GLUT4功能異常是脂肪組織發生胰島素抵抗的主要原因[1;PPAR-y是配體活化的核轉錄因子，參與胰島素抵抗的發生與發展[1];脂肪組織是PPAR-y激活劑的主要靶點[5]本研究結果顯示：刺五加多糖中、高劑量能夠激活IRS-2/P13K/磷酸化Akt信號通路，同時上調GLUT4和PPAR-y表達;而刺五加多糖低劑量僅能夠上調GLUT4和PPAR-表達，無法有效激活IRS-2/P13K/磷酸化Akt信號通路.

　　綜上所述，本研究證實了刺五加多糖中、高劑量在改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝中的療效，同時能夠明顯降低氧化應激水平，保護肝組織正常結構和功能激活1RS2/P13K/磷酸化Akt信號通路和上調GLUT-4和PPAR-表達是其作用機制之一.

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