[摘要] 目的：通過整合分析甘草抗炎活性與性狀特征數據，研究感官評價的科學性。方法：基于核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白 3(NLRP3)炎癥小體細胞模型，建立甘草的抗炎生物效價測定方法，通過測定生物效價將采集的甘草樣品分級。通過電子鼻、色彩色差儀等方法采集不同等級甘草樣品的性狀信息，通過主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法(OPLS-DA)分析不同等級甘草的差異性，并進一步考察性狀特征與甘草抗炎活性關聯性。結果：實驗結果顯示甘草提取物對尼日利亞菌素誘導的小鼠原代骨髓巨噬細胞 NLRP3 炎癥小體的激活具有明顯抑制作用，根據甘草的抗炎生物效價，可將 10 批次甘草分為兩個等級，一等甘草的生物效價在 5.949~11.418U·mg–1 之間，二等甘草的生物效價在 1.575~1.887 U·mg–1 之間;PCA 結果顯示兩等級甘草可以聚成兩類;OPLSDA 結果顯示 R2X=0.534，R2Y=0.863，Q2=0.75，模型的擬合能力較好，預測能力較強，并且發現色度值 b*和斷面直徑 2R 的 VIP 值分別為 1.542 94、1.260 11，均大于 1，兩者可能是導致兩等級甘草藥效差異的關鍵參數，經過實測值比較，兩等級甘草在 b*上存在顯著性差異。結論：研究表明，甘草的色度值 b*與甘草抗炎活性具有顯著的相關性，是其質量評價的一個重要指標，也佐證了甘草傳統評價具有一定的科學性。

　　[關鍵詞] 甘草;感官評價;核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白 3;炎癥小體;主成分分析;正交偏最小二乘法

　　甘草來源于豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草 G. inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根莖[1]，是中藥大品種之一，在中藥應用中具有十分重要的地位，被譽為中藥中的“國老”。甘草質量是其臨床療效的保證。感官評價是甘草質量評價的一種重要方法，主要是根據藥材的形、色、氣味、斷面等性狀信息來判斷質量的優劣，這種質量評價方法來源于古代臨床應用的總結，具有直觀簡便[2]等優勢。

　　但是由于這種傳統的評價方法存在主觀性較強等問題，其是否還適用于現代的甘草質量評價，能否準確反映其臨床活性的差異性有待進一步探討。甘草調和諸藥，在臨床上應用廣泛，具有抗炎、保肝、調節免疫等多種藥理活性[3]。現代研究表明，多種疾病的發生和發展都伴隨著炎癥的產生[3-6]，抑制炎癥反應是甘草發揮多種藥效作用的共性特征。因此，抗炎可能是甘草質量評價的一個重要指標。炎癥小體是炎癥反應的重要組成部分，與眾多炎癥性疾病以及免疫性疾病密切相關，包括黑素瘤缺乏因子 2(AIM2)、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白 3(NLRP3)、NLR 家族 CARD 結構域包含蛋白 4(NLRC4)等[7]。

　　NLRP3 炎癥小體是它們中最具有特點的一種，能夠被多種刺激劑(如尼日利亞菌素、三磷酸腺苷等)激活，也因此成為目前國內外研究最廣泛、最深入的一類炎癥小體，激活后的炎癥小體可通過天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)對白介素-1β(IL-1β)及白介素-18(IL-18)前體物質進行水解，最終產生并釋放活性 IL1β、IL-18 炎癥因子，介導炎癥反應的發生[8]。本研究借助現代測量工具及分析儀器，將甘草的性狀特征定量化，與根據抗炎生物效價分級后的甘草樣品進行整合分析，考察各性狀特征與抗炎活性的關聯度，旨在考察甘草傳統感官評價能否準確地反映其抗炎活性，以期為甘草感官評價的實際應用提供參考，并為其科學性提供數據支持。

　　1 材料

　　1.1 儀器CM-5 型色彩色差儀

　　(日本柯尼卡美能達公司);FOX 3000 型電子鼻系統(法國 Alpha MOS 公司);聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)系統、TC10 型自動細胞計數儀均購自美國 Bio-Rad 公司;潔凈工作臺(北京冠鵬凈化設備有限公司);臺式高速離心機、恒溫二氧化碳培養箱均購自美國 Thermo公司;HW·SY11-K 型電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司);KQ-500DE 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);OV200 型臺式真空冷凍離心濃縮儀(北京吉艾姆科技有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器(重慶雅馬拓科技有限公司);微量移液器(德國 Eppendorf 公司);PromegaGloMax 20/20 型發光檢測儀(美國 Promega 公司)。

　　1.2 材料與試劑

　　C57BL/6 雌性小鼠 2 只(9~11 周齡)，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，實驗動物倫理審查編號為 IACUC-2020-0037。DMEM 培養基(批號：K0111200)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS，批號：K0911200)，乙二胺四乙酸(EDTA，0.5 mol·L–1，批號：K1905010)，胰蛋白酶(Trypsin)-EDTA 消化液(0.25%，批號：K1207050)，均購自美國 Macgene 公司;opti-MEM 培養基(批號：31985070，美國 Gibco 公司);巨噬細胞集落刺激因子(M-csf，批號：#87394，美國 MedChemExpresss 公司);胎牛血清(FBS，批號：2037144，以色列 Biolnd 公司);尼日利亞菌素(Nigericin，批號：HY100381)，脂多糖(LPS，批號：tlrl-ppglps)，均購自美國 Invivogen 公司;二甲基亞砜(DMSO，批號：No.1121E0327，德國 Sigma-Aldrich 公司)。

　　IL-1β ELISA 檢測試劑盒(批號：2018-3，北京達科為生物技術有限公司);CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay(批號：0000418489)，CaspaseGlo®1 Inflammasome Assay(批號：0000443211)均購自美國 Promega 公司。NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)及 Caspase-1 抗體均購自美國 Adipogen 公司;IL-1β 抗體購自美國 R&D 公司;辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠 IgG 抗體及辣根過氧化物酶標記羊抗兔 IgG 抗體購自美國 Santa Cruz 公司。10 個批次甘草樣品編號 S1~10，批號分別為 S1(J180228001)、S2(H190077001-3)、S3( 20032604 ) 、 S4 ( H190080001-3 ) 、 S5 ( H190074001-3 ) 、 S6 ( H190078001-3 ) 、 S7(C200015001)、S8(J170042001)、S9(H190075001-3)、S10(CA180140001)，經解放軍總醫院第五醫學中心肝病研究所肖小河研究員鑒定均為烏拉爾甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch。

　　2 方法

　　2.1 供試品的制備按照

　　《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020 年版方法[1]制備甘草提取液，抽濾，精密吸取續濾液 10 mL 分裝于專用離心管中，于臺式真空冷凍離心濃縮儀中揮干溶劑至恒重，–20 ℃保存，備用。給藥時現配現用，在離心管中加入 opti-MEM 培養基 1 mL 重溶，超聲 30 min 使其溶解至無明顯固體顆粒，0.22 µm 微孔濾膜濾過后即得。

　　2.2 甘草抗炎生物效價的測定

　　2.2.1 細胞的獲取及培養

　　酒精消毒后，取 C57BL/6 的雌性小鼠后腿骨，將裝滿 DMEM 培養基的 5mL 注射器注入骨髓，在裝有 20 mL DMEM 培養基的離心管中反復吹打骨髓 3 次，吹打過程中保持后腿骨在培養基液面以下，加入 5 µL M-csf，吹勻，將含有細胞的培養基轉移至細胞培養皿中，20 ℃恒溫二氧化碳培養箱內培養。3 天后，補充適量的 DMEM 培養基和 M-csf，繼續培養 2 天。

　　然后，將貼壁的小鼠原代骨髓巨噬細胞(BMDMs)細胞用消化液(Trypsin-EDTA∶EDTA=2∶1)消化 1~2 min 后，更換DMEM 培養基，并制成細胞密度為 1×106 cells/mL 的培養基溶液，吸取 500 µL 的含細胞的培養基于 24孔細胞培養板孔內，于 20 ℃恒溫二氧化碳培養箱內培養至細胞貼壁。2.2.2 NLRP3 炎癥小體細胞模型的構建 首先，棄去 24 孔細胞培養板孔內的 DMEM 培養基，加入含有 LPS(50 ng·mL–1)的 opti-MEM 培養基，20 ℃恒溫二氧化碳培養箱內靜置 4 h;然后，設置空白組、模型組及給藥組，棄去孔板內的 opti-MEM 培養基，給藥組分別加入生藥濃度為 0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL–1的藥液，空白組及模型組加入等量 opti-MEM 培養基，20 ℃恒溫二氧化碳培養箱內與細胞共培養 1 h;最后，模型組及給藥組內加入 Nigericin(50 µg·mL–1，DMSO)溶液，空白組加入含有等質量濃度 DMSO 的 opti-MEM 培養基，20 ℃下共培養 30 min，收集細胞上清液及裂解液。

　　2.2.3 關鍵指標的檢測

　　通過蛋白質印跡(Western blot)法對細胞上清液中的 IL-1β、Casepase-1 蛋白及裂解液 NLRP3、pro-IL-1β、pro-Casepase-1、ASC 等蛋白的表達進行檢測，并應用 Image J 1.8.0 軟件對目的蛋白條帶進行灰度值分析。取 BMDMs 上清液及裂解液前處理后，電泳，再經轉膜將蛋白條帶轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經過孵育相應的一抗及二抗抗體，顯影，在 X 光片上顯示蛋白條帶。通過 Caspase-Glo®1 Inflammasome Assay 檢測試劑盒對細胞上清液中 Casepase-1 的表達量進行檢測，具體操作按照試劑盒說明書進行。通過酶聯免疫吸附(ELISA)測定法對細胞上清液中 IL-1β 的表達量進行檢測，具體操作按照 IL-1βELISA 檢測試劑盒說明書進行。

　　通過 CellTiter-Glo(CTG)發光法檢測細胞毒性。取培養至對數生長期的小鼠 BMDM 細胞，分別設置空白孔、對照孔及梯度濃度給藥孔(生藥濃度為 0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL–1)，孵育 6 h 后，吸取細胞上清液 50 µL 轉移至 96 孔白板中，每孔加入 CTG 溶液 50 µL，振蕩 1 min，測定各孔發光值，并通過公式(1)計算細胞存活率。細胞存活率 =給藥孔發光值−空白孔發光值對照孔發光值−空白孔發光值 ×100% (1)

　　2.2.4 生物效價的標化

　　IL-1β 炎癥因子是 NLRP3 炎癥小體介導表達的下游關鍵蛋白，且實驗結果相對穩定，故采用 ELISA 測定法檢測 IL-1β 的表達量，來表征甘草的生物效價。以 MCC950 為陽性對照化合物，依據《中國藥典》2020 年版(四部)[9]【生物檢定統計法】項下的“量反應平行線法”對甘草醇提物抑制小鼠 BMDM 細胞分泌 IL-1β 活性的效價值進行標化。定義MCC950 的生物效價為 1000 U·mg–1，將抑制率和相應給藥濃度輸入效價計算軟件 BioCalculate V2.0 得到各個批次甘草抑制小鼠 BMDM 細胞分泌 IL-1β 的效價。

　　2.3 感官參數的數據采集

　　2.3.1 甘草斷面直徑的測量 10 個批次甘草樣品均為類圓形片，若為類橢圓形片，則以其短直徑作為斷面直徑測量結果。為了減小實驗誤差，每批次樣品隨機取 3 組，每組 100 個飲片作為測量對象[10]，記錄其斷面直徑 2R。2.3.2 甘草色度的測定 色度常用的評價系統是 CIE 1976 L*a*b*標準色度系統，其中 L*表示明度，a*和b*表示不同的色調方向。L*值越大明度越大，感覺越白;反之越暗。a*表示紅綠方向，+a*表示紅方向，–a*表示綠方向。b*表示黃藍方向，+b*表示黃方向，–b*表示藍方向[11]。采用色彩色差儀對甘草粉末進行色度測量。取適量甘草粉末加入專用容器中，在容器底部平鋪成3~5 mm 厚度，校準儀器后，將其放置于測定凹槽內進行色度測量，記錄甘草樣品的 L*、a*和 b*值。每批次樣品重復測定 3 次，取其色度指標的平均值。

　　2.3.3 甘草氣味的測定

　　為了使樣品在利用電子鼻檢測時響應值達到最佳狀態，參考文獻[12-13]方法對樣品進樣量、頂空溫度及頂空時間進行單因素考察。精密稱取甘草粉末 0.2 g，置于 10 mL 頂空瓶中，在頂空溫度 40 ℃，頂空時間 120 s 條件下，分別考察進樣量為 500、1000、2000、2500 µL 時樣品的響應值;精密稱取甘草粉末0.2 g，置于 10 mL 頂空瓶中，在頂空時間 120 s，進樣量 2500 µL 條件下，分別考察頂空溫度為 40、45、50、55 ℃時樣品的響應值;精密稱取甘草粉末 0.2 g，置于 10 mL 頂空瓶中，在頂空溫度 55 ℃，進樣量 2500 µL 條件下，分別考察頂空時間為 120、240、360 s 時樣品的響應值。

　　取同一批次甘草樣品(S7)重復測定 5 次，計算 12 個傳感器的 RSD(%)值以考察電子鼻儀器精密度。12 個傳感器 LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCTl、LY2/gCT、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2 的 RSD 值分別為 1.449%、2.933%、2.211%、0.435%、3.278%、1.356%、1.756%、1.133%、1.343%、0.935%、1.641%、1.536%，RSD 值均小于 4%，說明儀器精密度良好。

　　2.4 數據分析

　　將采集的甘草樣品感官數據及等級劃分數據導入 Simca 14.1 軟件中，進行主成分(PCA)分析，并基于 PCA 分析進行正交偏最小二乘法(OPLS-DA)分析，以增大組間差異，更好地挖掘與甘草抗炎活性相關的關鍵感官參數。根據 PCA 分析及 OPLS-DA 分析的得分圖，判斷兩等級甘草樣品的差異。根據OPLS-DA 分析的 loading 圖及 VIP 值確定兩者間的差異成分，并通過獨立 t 檢驗分析兩者差異成分的統計學差異，驗證 OPLS-DA 分析結果。3 結果3.1 甘草提取物對 Nigericin 誘導的小鼠原代骨髓巨噬細胞 NLRP3 炎癥小體的影響經過 Western blot 法檢測空白組、模型組及給藥組 BMDM 細胞上清液及裂解液中各關鍵蛋白的表達，結果見圖 3 A，再通過灰度值分析對關鍵蛋白 IL-1β、Casepase-1 及其前體蛋白 pro-IL-1β 及 proCasepase-1 的條帶進行量化，結果見圖 3 B~E，以判斷甘草提取物是否產生抑制作用。

　　Lamin B 為細胞裂解液的上樣量對照，考馬斯藍(Coomassie)染色為上清液的上樣量對照。實驗結果顯示，與模型組相比，給藥組細胞上清液中目的蛋白 IL-1β、Casepase-1 的灰度值明顯降低，即其表達量顯著減少，并且隨著給藥濃度的增大，兩種蛋白的表達量呈現逐漸減少的趨勢，而在裂解液中兩蛋白的前體蛋白 proIL-1β 及 pro-Casepase-1 的表達則恰恰相反，說明甘草提取物能夠抑制 pro-IL-1β 及 pro-Casepase-1 的剪切，從而抑制 LPS 聯合 Nigericin 誘導的小鼠 BMDM 細胞上清液中 IL-1β、Casepase-1 蛋白的表達。通過試劑盒進一步檢測 IL-1β 的表達及 Casepase-1 的活性，結果見圖 4 A、B，發現甘草提取物對 IL-1β 的表達有抑制作用，并能夠抑制 Casepase-1 的活性，且在 0.312 5~2.500 0 mg·mL–1質量濃度范圍內呈一定的劑量依賴性;并對甘草提取物的細胞毒性進行了檢測，甘草提取物在 2.500 0 mg·mL–1質量濃度時對 BMDM 細胞無毒性作用，故選取 0.312 5~2.500 0 mg·mL–1質量濃度范圍內進行藥效檢測。

　　4 討論

　　近年來，已經有研究報道了甘草中的活性成分對 NLRP3 炎癥小體的影響，并對其作用機制進行了深入研究。Li 等[14]研究發現，異甘草素通過抑制磷酸化核因子-ĸB(p-NF-ĸB)、NLRP3 的蛋白質的分泌，促進 Caspase-1、IL-1β 和消皮素蛋白 N 端(GSDMD-N)的裂解，上調微小核苷酸(miRNA)-27amRNA 表達，并降低脾酪氨酸激酶(SYK)的 mRNA 和蛋白質水平等方式抑制 NLRP3 介導的焦亡。付書彬等[15]報道，甘草查爾酮 A 可通過抑制 Caspase-1 前體的剪切，阻斷 Caspase-1 p20 介導的 pro-IL-1β的成熟,抑制 NLRP3 炎癥小體介導的免疫炎癥反應。Xu[16]等也發現了甘草中的活性成分對 NLRP3 炎癥小體的抑制作用。目前，甘草提取物對炎癥小體的作用尚無人進行驗證，本研究在前人研究的基礎上構建了炎癥小體細胞模型，確定了在體外甘草提取物對 LPS 誘導的小鼠 BMDM 細胞 NLRP3 炎癥小體激活的抑制作用，并通過檢測其下游關鍵蛋白 IL-1β 的表達量建立了不同批次甘草樣品的生物效價，為甘草質量評價提供新的方法。自古以來，顏色就在甘草質量評價中占據了重要地位。

　　中醫草藥論文投稿刊物：新中醫期刊投論文要求

　　《本草經集注》記載：“赤皮斷理，…最佳…[17]”《新編中藥志》記載：“甘草以皮細緊、色紅棕、斷面黃白色…為佳。[18]”可見，在古代，甘草以外皮色赤、色紅棕，斷面色黃白者為佳。隨著科技的進步，研究者們利用現代儀器對甘草的顏色進行了更深入的研究。曹光昭[19]等將甘草的止咳藥效與其色度值進行相關性分析，初步確定了色度值 b*與其止咳藥效的相關性。本研究通過現代機器視覺客觀量化了甘草的性狀參數，彌補了性狀評價方法過于依賴經驗的不足之處，大大提高了其客觀性，減低了因評價人員不同而導致的質量評價差異，并且經過進一步與其抗炎活性進行整合分析，確定了甘草的色度值 b*與甘草抗炎活性的相關性較強。但是，由于市場上多為烏拉爾甘草，本研究未收集到脹果甘草和光果甘草樣品，并且應用樣品量較小，可加大樣品量以及其他基原甘草樣品進行進一步驗證。

　　參考文獻

　　[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2020：88.

　　[2] 陳云華，王文全.甘草質量評價方法研究進展[J].時珍國醫國藥，2008，19(6)：1504-1505.

　　[3] 李葆林，麻景梅，田宇柔，等.甘草中新發現化學成分和藥理作用的研究進展[J].中草藥，2021，52(8)：2438-2448.

　　[4] KIM S H，HONG J H，YANG W K，et al.Herbal combinational medication of Glycyrrhiza glabra，Agastache rugosacontaining glycyrrhizic acid，tilianin inhibits neutrophilic lung inflammation by affecting CXCL2，interleukin-17/STAT3 signalpathways in a murine model of COPD[J].Nutrients，2020，12(4)：926.

　　[5] PAUDEL Y N，ANGELOPOULOU E，SEMPLE B，et al.Potential neuroprotective effect of the HMGB1 inhibitorglycyrrhizin in neurological disorders[J].ACS Chem Neurosci，2020，11(4)：485-500.

　　[6] YU J Y，HA J Y，KIM K M，et al.Anti-Inflammatory activities of licorice extract and its active compounds，glycyrrhizicacid，liquiritin and liquiritigenin，in BV2 cells and mice liver[J].Molecules，2015，20(7)：13041-13054.

　　[7] SHAO B Z，XU Z Q，HAN B Z，et al.NLRP3 inflammasome and its inhibitors：A review[J].Front Pharmacol，2015，6：262.

　　[ 8 ] MANGAN M S J ， OLHAVA E J ， ROUSH W R ， et al . Targeting the NLRP3 inflammasome in inflammatorydiseases[J].Nat Rev Drug Discov，2018，17(8)：588-606.

　　作者：王鈞楠 1，周永峰 2，3，崔園園 2，鞏穎 4，柏兆方 2，朱廣偉 5，華國棟 6*，張萍 2*