摘 要 為研究接種不同內(nèi)生真菌對藍莓幼苗生長生理效應(yīng)的影響，初步篩選出對藍莓幼苗促生較好的菌株。從畢節(jié)赫章和花溪高坡 2 個藍莓栽培地采集不同品種根系進行分離純化鑒定，并回接到 1 年生藍莓盆栽苗上，測定接種后藍莓幼苗侵染率、生長及生理效應(yīng)指標。結(jié)果表明：與 CK 相比，接種不同菌株的藍莓幼苗侵染率、苗高、地徑、總生物量差異顯著，其中 1 號和 2 號菌株的促生效果最好;接種不同菌株的藍莓葉片吸收光譜、反射光譜和透射光譜均在 470、550、670、780、880 nm 處出現(xiàn)峰值，其中葉片吸收率的峰值均大于 CK，葉片反射率的峰值均小于 CK，而葉片透射率與 CK 相比無明顯的變化規(guī)律;接種不同菌株對藍莓苗快速光響應(yīng)主要參數(shù)的影響差異顯著，以接種 4 號菌株對藍莓苗葉片電子傳遞速率快，對強光的耐受能力強于其他菌株處理。此外，接種不同菌株對藍莓幼苗葉綠素總含量與 CK 相比差異不明顯，增幅為 1.08%～51.35%，而藍莓根系活力指標與 CK相比差異顯著，其增幅為 32.46%～129.07%。隸屬函數(shù)綜合評價結(jié)果表明，對藍莓幼苗生長生理效應(yīng)有顯著促進作用的菌株有 1 號、2 號、4 號和 6 號，可初步篩選為藍莓幼苗生長較好的促生菌株。

　　關(guān)鍵詞 藍莓;內(nèi)生真菌;生長;生理效應(yīng);初步篩選

　　藍莓，也稱越橘，屬杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)多年生灌木果樹，是新興的經(jīng)濟林樹種之一[1]。藍莓含有豐富的多種維生素、糖類、酸類以及多種礦質(zhì)元素，具有多種食療保健功效，因此被營養(yǎng)學家稱為“21 世紀功能性保健漿果”，同時也是聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的人類五大健康食品之一[2]。藍莓的根系沒有根毛，根系結(jié)構(gòu)簡單，對水分和養(yǎng)分的吸收主要依賴于與其共生的菌根真菌[3]。1911 年，Coville[4]首先觀察到高叢藍莓根系中有菌根真菌寄生，并推測菌根真菌的侵染可能對藍莓生長有益。尤其是近 20 年來對藍莓菌根的研究已成為熱點，更多研究表明，接種菌根真菌可以促進藍莓對土壤中礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收，促進植株生長，同時還調(diào)節(jié)植株自身內(nèi)部的代謝活性，增強植株的抗性，提高藍莓的產(chǎn)量等[5-11]。

　　亦有研究表明，接種菌根真菌對宿主植物的生長并沒有起到促進作用，接種內(nèi)生真菌后宿主植物生長停滯、成活率降低等[12]。因此，接種后是否有促進效果受到多方面因素的影響，如植株因素、菌物因素等。對此，找出適合藍莓無性繁殖苗生長的共生菌根是有研究意義的。本文以 1 年生藍莓無菌組培苗為研究材料，接種從栽培藍莓植株根系上分離純化的內(nèi)生菌株菌液，通過定期監(jiān)測苗木的生長，于生長旺期測定生理生化指標，生長結(jié)束期采集根系觀察侵染情況，并采集植株測定生物量，最終初步篩選出適合藍莓生長的菌株，這對于生產(chǎn)實踐中藍莓高效栽培具有理論指導意義。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　(1)供試菌株。從畢節(jié)赫章和花溪高坡兩地采集不同栽培品種藍莓植株的根系，用冰盒帶回實驗室，將根系上土壤洗凈，用 75%酒精浸泡 1 min，然后用 1‰HgCl2浸泡 10 min，取其幼根，在無菌條件下，用經(jīng)過消毒的剪刀剪成長 0.5 cm 的根段，選用 PDA 培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿中放置 6 個根段，后將培養(yǎng)皿倒置在培養(yǎng)箱內(nèi)，25 ℃避光培養(yǎng)。待培養(yǎng)基長出菌落后再用接種環(huán)挑取無污染的菌落繼續(xù)在PDA 培養(yǎng)基進行純化培養(yǎng)，直至得到單一菌株。純化的菌株通過 rDNA-ITS 全序列分析，對 6 個菌株進行分子鑒定。(2)供試植株。選擇生長一致的 1 年生藍莓無菌組培苗，品種為萊克西。(3)栽培基質(zhì)。栽培基質(zhì)為泥炭、草炭和珍珠巖等量混合，栽植前于 121 ℃高壓滅菌 2 h。(4)栽培容器。外口徑 14.5 cm、內(nèi)口徑 13.5cm、高 12.5 cm 和底徑 10.2 cm 的塑料花盆于 0.1%高錳酸鉀溶液中浸泡消毒 0.5 h。

　　1.2 方法供試菌株

　　在 PDA 培養(yǎng)基上純化后，接入 PDB液體培養(yǎng)基上，于 25 ℃下?lián)u床培養(yǎng) 7 d 左右。無菌組培苗種植 5 個月后，將培養(yǎng)好的菌液澆灌藍莓苗根部，以不澆菌液為對照(CK)，每株苗木澆灌50 mL，每個處理 3 次重復，每次重復 10 株苗，隔5 d 澆無菌水，其間不施加任何肥料。澆菌液前測定每株藍莓苗的苗高、地徑(地徑是苗干靠近基質(zhì)處的直徑，在測量之前先標記好，便于后面的測量)，以后每隔 30 d 測 1 次，連續(xù)監(jiān)測 5 個月。

　　選擇持續(xù)向好的晴天，選擇苗木位置相同并充分展開的 5 株標準株功能葉片，測定藍莓苗木的快速光響應(yīng)指標和光譜效應(yīng)指標，并采集葉片測定葉綠素含量。苗木生長結(jié)束后，選取每個處理 10 株藍莓植株的生活根連帶部分根際土帶回實驗室，迅速清除根系表面的土粒和雜物，在自來水下沖洗干凈，放在已編號的包埋盒里，用蒸餾水反復沖洗干凈，放入 10%KOH溶液中，將其置于 90 ℃水浴鍋中 3 h，期間再換 1次 10%KOH 溶液，再通過一系列的染色、分色和制片過程后，在光學顯微鏡下觀察菌根的侵染特征并拍照記錄，同時采集植株根系測定根系活力、生物量等指標。

　　1.3 指標的測定

　　(1)苗高、地徑的測量。用卷尺(精度 0.1 cm)測量苗高，用游標卡尺(精度 0.01 mm)測量地徑。(2)生物量的測定。計算每個處理植株的平均地徑和平均苗高，按平均地徑和平均苗高±5%選取5 株標準株，采集植株前先把每株的所有葉片收集好，洗凈擦干后把根和莖(做好標記點以下的根系為根重，其余部分為莖重)分開，且分裝在不同的牛皮信封紙袋中，后放入 105 ℃烘箱中殺青 30 min，再用 80 ℃烘至恒重，并稱量根、莖、葉各部分的干重。

　　(3)侵染率的計算。經(jīng)染色的根段在乳酸甘油中脫色后，用剪刀剪取粗細均勻、長度約 1 cm 的根段放在干凈的載玻片上，每個載玻片放 5 個根段，加蓋干凈的蓋玻片，將壓片放在顯微鏡下進行觀察，每個處理放置 8 個載玻片觀察。在觀察中，能夠觀察有菌絲的根段記為侵染的根段，相反，沒有觀察到任何菌絲侵染的根段為無侵染的根段。侵染率(%)=(侵染的根段數(shù)/鏡檢根段總數(shù))×100(4)葉片光譜的測定。選擇持續(xù)向好的天氣，使用 CI-710 光譜儀測定苗木位置相同并充分展開的 5 株標準株功能葉片在 400～1 000 nm 波長范圍內(nèi)的透射率、吸收率和反射率參數(shù)，每個處理測定3 次，取平均值。

　　分析全部葉片測定的吸收、透射和反射的光譜曲線，發(fā)現(xiàn)固定波長范圍內(nèi)在 470、550、670、780、880 nm 處有吸收峰，峰值波長漂移范圍較窄，一般在±5 nm 內(nèi)。因此選擇波長位置位于 470、550、670、780、880 nm 處的吸收光譜、透射光譜、反射光譜作為特征光譜變量。(5)葉片光響應(yīng)參數(shù)的測定。選擇持續(xù)向好的晴天，用 Junior-PAM 葉綠素熒光儀測定 PAR(光合有效輻射)和 ETR(相對電子傳遞速率)等，對曲線進行擬合后得到光能利用效率(α)、最大電子傳遞速率(ETRm)以及最小飽和光強(Ik)3 個主要參數(shù)。(6)生理生化指標的測定。參照文獻[13]，葉綠素含量的測定采用丙酮乙醇等比混合液法，根系活力的測定采用 TTC 法。

　　1.4 綜合評價法的確定由于各指標的單位、性質(zhì)和數(shù)量的不同，故采用模糊數(shù)學隸屬度函數(shù)對各項指標測定值進行定量轉(zhuǎn)換[14]。即 f(Xi)=(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin)和 f(Xi)=(Ximax-Xij)/(Ximax-Ximin)，其中f(Xi)為各指標隸屬度，Xij 表示各指標值，Ximax和 Ximin 分別表示第 i 項指標的最大值和最小值。將各處理的隸屬函數(shù)值求和，數(shù)值越大則綜合評價越高，并對不同處理的數(shù)值求和進行排序。

　　1.5 數(shù)據(jù)分析與處理試驗

　　數(shù)據(jù)采用 Excel 2010 軟件進行統(tǒng)計和作圖 ， 采 用 SPSS 23.0 軟 件 進 行 分 析 處 理 ， 采 用Duncan’s 法進行多重比較。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 通過 ITS 序列分析的 6 株菌株通過鑒定分析，6 株菌株中有 1 株藍狀菌屬，4株青霉素，1 株枝孢屬。其中，1 號菌株的最相似種為棘狀踝節(jié)菌，相似度為 99.82%。2～5 號菌株雖然是同屬青霉素，但最相似種不同，2 號菌株的最相似種為柑橘青霉菌種，相似度為 100.00%;3 號和 5 號菌株最相似種為青霉菌種，相似度均為100.00%;4 號菌株的最相似種為油菜青霉菌種，相似度為 99.81%。6 號菌株的最相似種為枝孢菌種，相似度為 100.00%。

　　2.2 接種不同菌株的藍莓根系侵染特征及侵染率

　　通過臺盼藍染色法對所有藍莓根系進行顯微觀察發(fā)現(xiàn)，侵染主要發(fā)生在根系為黃棕色的根段部分，菌絲的形態(tài)是由較粗的菌絲組成的密致的團狀，細胞被菌絲充滿。接種不同內(nèi)生真菌處理的藍莓根系均觀察到有侵染現(xiàn)象，且與 CK相比差異顯著。其中，2 號菌株的侵染率最高，達57.5%;其次是 1 號和 4 號，侵染率均為 52.5%;5號菌株的侵染率最低，為 45.0%。6 個菌株處理的藍莓根系侵染率分別是 CK 的 4.2、4.6、4.0、4.2、3.6、3.8 倍。由此可見，沒有接種菌液的 CK 雖然有侵染，但人工接種菌液處理的侵染率顯著高于 CK。

　　2.3 接種不同菌株對藍莓苗生長的影響

　　2.3.1 苗高和地徑

　　人工接種菌液促進藍莓苗高生長。與 CK 相比，1 號、2 號和 4 號接種菌液處理的藍莓苗高生長顯著，3 號、5 號和 6 號接種菌液處理的藍莓苗高差異不顯著。其中，接種 1 號菌株處理的藍莓苗高生長最好，比 CK 增長 39.27%;其次是 2 號和 4 號菌株;苗高生長較差的是 5 號菌株處理，增幅僅為 15.25%。同樣，從表 3 可以看出，人工接種內(nèi)生真菌同樣促進藍莓苗木地徑的生長。其中，1 號、2 號和 5號菌株處理的藍莓苗地徑生長量較大，與 CK 相比差異顯著，3 號、4 號和 6 號菌株與 CK 相比差異不顯著，各菌株處理的藍莓苗地徑與 CK 相比增長幅度為 9.43%～21.43%。

　　2.3.2 生物量

　　接種內(nèi)生真菌的藍莓植株根、莖、葉的生物量和總生物量均高于 CK。其中，接種 2號菌株的藍莓植株葉生物量、根生物量和總生物量均高于 CK 且差異顯著，分別是 CK 的 1.56、1.36、1.33 倍，接種 1 號菌株的藍莓植株莖生物量最重，是 CK 的 1.48 倍。對于總生物量而言，接種菌根處理的藍莓植株均顯著高于 CK。

　　就生物量分配來看，各處理的植株呈現(xiàn)地上部分生物量>地下部分生物量;對于植株的不同部位，接種 2 號、3 號、6 號菌株處理以及 CK 的根生物量大于葉生物量、莖生物量;接種 1 號、4 號菌株處理的莖生物量大于根生物量、葉生物量;而接種 5 號菌株處理的則是葉生物量高于根生物量、莖生物量。可見，內(nèi)生真菌對藍莓植株的營養(yǎng)生長具有不同程度的促進作用，尤以接種 1 號和 2 號菌株的促進作用更明顯。

　　2.4 接種不同菌株對藍莓苗葉片光譜效應(yīng)的影響

　　2.4.1 葉片吸收率

　　在 470 nm 左右，各處理的藍莓葉片平均吸收率最大，隨著波長的增加，藍莓葉片吸收率呈下降趨勢，550 nm 左右各處理葉片出現(xiàn)較低的吸收率;隨后，隨著波長的增加，葉片吸收率呈上升趨勢，在波長為 670 nm 時藍莓葉片出現(xiàn)較大的吸收率，但隨著波長的繼續(xù)增加，藍莓葉片的吸收率明顯下降，在 780 nm 后平穩(wěn)下降。此外，接種內(nèi)生真菌的藍莓葉片吸收率在各波長段均大于 CK，表明接種菌株促進藍莓葉片對藍綠光和紅光的有利吸收。

　　2.4.2 葉片反射率

　　在測定波長范圍內(nèi)，接種不同菌株處理的藍莓葉片反射率變化一致，葉片反射率在 550 nm 左右出現(xiàn)峰值，之后在 670 nm 左右葉片反射率最低，隨著波長的增加，在 780 nm 左右反射率迅速上升，形成“紅邊”現(xiàn)象，最后在近紅外區(qū)域達到相對平穩(wěn)，這與藍莓葉片吸收率變化趨勢不一致。另外，接種不同菌株處理的藍莓葉片反射率變化的峰值均小于 CK。

　　2.4.3 葉片透射率

　　在測定波長范圍內(nèi)，接種不同菌株處理的藍莓葉片光譜在 550 nm 左右有較高的透射率，在 670 nm 左右其透射率降到最低，在 780 nm 左右透射率快速增加，后隨著波長的增加其透射率平穩(wěn)增加。另外，接種各菌株處理藍莓葉片透射率在 470nm 左右均大于 CK，而在 780 nm 和 880 nm 左右其葉片透射率均小于 CK，在其他波長范圍內(nèi)的透射率與 CK 相比無明顯的變化規(guī)律。

　　2.5 接種不同菌株對藍莓苗快速光響應(yīng)主要參數(shù)的影響通過對快速光響應(yīng)曲線進行擬合，得到初始斜率(α)、最大電子傳遞速率(ETRm)、最小飽和光強(Ik)主要參數(shù)。接種不同菌株對藍莓苗快速光響應(yīng)主要參數(shù)的影響差異顯著。其中，快速光響應(yīng)曲線的初始斜率表示光化學反應(yīng)的啟動速率，沒有接種菌株(CK)的藍莓苗初始斜率最高，而接種 1 號菌株處理的藍莓苗初始斜率顯著低于 CK，其他菌株處理的藍莓苗初始斜率與 CK 相比差異不顯著，可見在光能利用之初藍莓苗對光能利用效率變化不明顯。接種不同菌株藍莓苗葉片最大電子傳遞速率與 CK 相比差異顯著。

　　其中，接種 4 號菌株的藍莓苗葉片最大電子傳遞速率最高，其次是 1 號菌株。各接種菌株處理的最大電子傳遞速率比 CK 增加了33.11%～71.94%。接種不同菌株的藍莓苗最小飽和光強的變化與最大電子傳遞速率變化一致。接種不同菌株藍莓苗的最小飽和光強與 CK 相比差異顯著，其中，接種 4 號菌株的藍莓苗最小飽和光強最高，其次是 1號菌株。各接種菌株處理的最小飽和光強比 CK 增加了 53.55%～110.59%。綜合以上得出，接種 4 號菌株的藍莓苗葉片電子傳遞速率快，對強光的耐受能力強于其他菌株處理。

　　2.6 接種不同菌株對藍莓葉片葉綠素含量和根系活力的影響

　　2.6.1 葉綠素含量

　　葉綠素是植物生長的主要光合色素，其含量可以在一定程度上反映植株進行光合作用的潛力。接種 6 個不同內(nèi)生真菌處理的藍莓葉綠素 a 含量與 CK 相比差異不顯著;接種 6 號菌株處理的葉綠素 b 含量和葉綠素總含量與 CK 相比差異顯著，接種其他菌株處理的葉綠素 b 含量和葉綠素總含量與 CK 相比差異不顯著。此外，接種 6 號菌株處理的葉綠素總含量最高，為 2.80 mg/g，是 CK的 1.5 倍;其次是 2 號菌株處理，其葉綠素總含量為 2.34 mg/g，是 CK 的 1.3 倍;接種 5 號菌株處理的葉綠素總含量最低。相反，接種 5 號菌株處理的葉綠素 a/b 值最大，最小則為 6 號菌株處理。

　　2.6.2 根系活力

　　根系活力指標能夠間接反映根系生長情況和吸收營養(yǎng)狀況水平。接種不同菌株處理對藍莓苗木根系活力的影響差異顯著，其根系活力變化范圍為 103.08～236.13 µg/g FW·h。其中，1號菌株處理的藍莓苗木根系活力最大，為 236.13µg/g FW·h;其次是 2 號菌株處理，根系活力為186.57 µg/g FW·h;苗木根系活力最小的是 3 號菌株處理，為 136.54 µg/g FW·h。各處理的根系活力與 CK 相比增幅為 32.46%～129.07%。可見，接種菌株能顯著提高藍莓苗木的根系活力，從而促進植株對水分和養(yǎng)分的吸收。

　　2.7 接種不同菌株處理的綜合評價由于各指標的單位、性質(zhì)和數(shù)量的不同，采用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法對各項指標進行定量轉(zhuǎn)換。選用侵染率、苗高、地徑、生物量、最大電子傳遞速率(ETRm)、葉綠素總含量和根系活力作為隸屬函數(shù)綜合評價指標。評價結(jié)果表明，接種不同菌株后對藍莓苗促生效果最為顯著的是 1 號和2 號菌株，其次是 4 號和 6 號菌株，相對較差的是 3 號和 5 號菌株。由此可以初步篩選對藍莓苗促生效果較好的菌株為 1 號、2 號、4 號和 6 號。

　　3 討論與結(jié)論

　　根系侵染率是菌株侵染根系效果的直接體現(xiàn)，而根系的侵染受土壤條件和真菌源數(shù)量等因素的影響[15-16]，因此，有報道人工種植的藍莓菌根形成率普遍較低[17]。肖軍等以發(fā)酵菌液的方式對藍莓進行接種，接種后藍莓根系侵染率最高為 63.3%[18]。本研究結(jié)果表明，在人工栽培藍莓中接種不同種類的內(nèi)生真菌，其侵染率最高可達 57.5%，與前人的研究結(jié)果相似。另外，幾種菌株處理的侵染率不一致，可能的原因是不同菌株與藍莓根系的親和力以及受其他因素影響的適應(yīng)性不同所致。菌根真菌對宿主植物水分、養(yǎng)分吸收最終體現(xiàn)在對植株生長的影響上。

　　大量研究發(fā)現(xiàn)接種不同種類的菌株均對藍莓的生長有顯著的促進作用[19-22]。本研究結(jié)果同樣表明，接種內(nèi)生真菌均顯著促進了藍莓苗的生長，但各菌株對藍莓苗生長以及對植株的不同部位生長效果不同，可能原因是各個菌株發(fā)揮作用存在差異性。植物的生理生化特征決定了其對光譜的吸收、反射和透射的變化，而植物的生理特性又相應(yīng)地反映了它的長勢情況。其中，色素是影響植物在可見光區(qū)域內(nèi)光譜特征的決定性因素。因此，可以通過檢測植株對光吸收、反射和透射的變化間接估測葉綠素以及葉片水分含量的變化[23-24]。結(jié)合前人的研究，通過對比葉片吸收、透射和反射光譜曲線，選擇 470、550、670、780、880 nm 作為特征光譜波段，結(jié)果表明藍莓葉片對光的吸收、反射和透射率都會隨著波長的變化而有所不同。

　　總體變化規(guī)律為各處理的葉片吸收率的峰值均大于 CK，葉片反射率的峰值均小于 CK，而葉片透射率與 CK 相比無明顯的變化規(guī)律，說明接種內(nèi)生真菌能夠促進藍莓苗葉片對光能的吸收，而減弱光對葉片的反射和透射。根系是植物吸收外界養(yǎng)分和水分的主要器官，而根系活力綜合反映了根系養(yǎng)分吸收和物質(zhì)合成能力。有研究表明藍莓根系發(fā)育狀況及藍莓對菌根的依賴性與根系活力密切相關(guān)[25]。本研究中，接種6 種內(nèi)生真菌都顯著地提高了藍莓苗的根系活力，從而促進了藍莓植株的生長。

　　為了更直觀地評價接種某種菌株對藍莓苗侵染、生長生理效應(yīng)的影響，選用侵染率、苗高、地徑、生物量、最大電子傳遞速率、葉綠素總含量和根系活力作為隸屬函數(shù)綜合評價指標，評價結(jié)果表明，接種不同內(nèi)生真菌后對藍莓苗促生效果最為顯著的是 1 號和 2 號菌株，其次是 4 號和 6 號菌株，相對較差的是 3 號和 5 號菌株，由此可以初步篩選對藍莓苗促生效果較好的菌株為 1 號、2 號、4 號和 6 號。但對于自然環(huán)境中的栽培藍莓而言，某種菌根真菌并不是單獨孤立存在的，而是以多樣性的方式存在。因此為了更好地模擬自然界中真菌-植物根系的共生狀態(tài)，研究 2 種或 2 種以上的菌株共同接種對藍莓苗生長發(fā)育的影響是今后研究的重點，這樣能更好地提高植株的侵染率以及為生產(chǎn)實踐服務(wù)。

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　　選自期刊《中國果樹》2022(7)：16-22

　　作者信息：安常蓉 1，李 蕓 1，劉昌閎 1，崇慧影 1，文光琴 2，聶 飛 1，段如雁 1(1 貴州省生物研究所，貴陽 550009)(2 貴州省植物園)