摘要：海綿蛋糕備受廣大消費者喜愛，但高溫焙烤的加工方式使其產生多種有害產物，如晚期糖基化終末產物(advancedglycationendproducts，AGEs)、二羰基化合物、蛋白質氧化產物等。本文為了探究親水膠體對AGEs生成的抑制作用，首先采用牛血清白蛋白(bovinealbumin，BSA)-果糖(fructose，F(xiàn)ru)，BSA葡萄糖(glucose，Glu)、BSA-丙酮醛(methylglyoxal，MGO)，BSA-乙二醛(glyoxal，GO)等4個化學模型，考察了9種經(jīng)典親水膠體在化學模型中的抗糖基化能力，篩選出抑制效果最佳的海藻酸(alginicacid，ALA)和黃原膠(xanthangum，XG)作為研究對象，探究了不同親水膠體添加量(0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%,w/w)以及烘焙溫度、時間對海綿蛋糕品質屬性、AGEs形成和蛋白氧化產物的影響。明確了最佳烘焙溫度和時間為180℃/40min，在此條件下分別添加0.5%(w/w)的ALA或2.0%(w/w)XG能夠顯著降低海綿蛋糕中的熒光AGEs，非熒光AGEs和蛋白氧化產物含量。同時，ALA和XG的添加能夠改善蛋糕的質構，提高蛋糕的水分含量。綜上所述，ALA和XG是一類很有前途的天然AGEs抑制劑，可以在烘焙之前添加至原料中，以減少烘焙食品中AGEs的生成。

　　關鍵詞：海綿蛋糕;親水膠體;海藻酸;黃原膠;晚期糖基化終末產物(AGEs)

　　海綿蛋糕因其口感、風味而備受消費者喜愛，但高溫烘焙的加工方式以及烘焙過程中發(fā)生的美拉德反應使其產生一系列具有潛在健康危害的化合物的，如晚期糖基化終末產物(advancedglycationendproducts，AGEs)、二羰基化合物、蛋白質氧化產物等。

　　AGEs是由還原糖中的羰基與蛋白質、脂類和核酸中的游離氨基反應形成的一類糖基化產物[1]。AGEs包括具有熒光的交聯(lián)AGEs(如戊糖素)，沒有熒光的交聯(lián)AGEs(如精氨酸-賴氨酸咪唑復合物)及沒有交聯(lián)的AGEs(如Nε-羧甲基賴氨酸(Nε-carboxymethyllysine，CML)和Nε-羧乙基賴氨酸(Nε-carboxyethyllysine，CEL))[2]。其中，CML和CEL是AGEs最主要的單體之一。目前已經(jīng)有研究表明，食源性AGEs的攝入會增加人體血清中AGEs的水平，進而引發(fā)或加速許多慢性疾病，如癌癥，炎癥，糖尿病，動脈粥樣硬化和腎小球硬化[3,4]。

　　根據(jù)是否與蛋白質或多肽結合，AGEs可分為結合態(tài)和游離態(tài)[5]。與結合態(tài)AGEs相比，游離態(tài)的AGEs更容易被人體吸收進入血清中[6]。由于烘焙食品大都具有高糖、高脂特點，且經(jīng)高溫烘焙制得，制備過程中更容易因美拉德反應生成AGEs。因此，如何抑制烘焙過程中AGEs的生成是食品工業(yè)迫切需要面對的問題。目前研究較多的是在食品中添加植物多酚作為AGEs抑制劑，如白藜蘆醇能夠顯著降低中等水分食物中AGEs和不溶性蛋白水平[7]，在曲奇中添加迷迭香酸、白藜蘆醇和表兒茶素對AGEs抑制率可達28.60%~62.05%[8]。

　　但多酚易降解，同時也會極大地抑制風味物質的形成，這都會影響食品品質和AGEs抑制效果。MILDNER-SZKUDLARZS等人[9,10]在面團中加入2g/100g咖啡酸，沒食子酸，阿魏酸，兒茶素和槲皮素后，經(jīng)過210℃烘焙20分鐘，面包屑中的阿魏酸，咖啡酸和兒茶素的含量分別減少75%，47%和51%，同時美拉德反應產生的揮發(fā)性風味化合物分別降低了75.9%，74.3%，65.6%，62.4%和59.3%。

　　親水膠體大多數(shù)是多糖大分子及其衍生物，分子結構中含有大量的親水基團，例如羧基，羥基，氨基等[11]。在食品工業(yè)中，親水膠體常被用于增稠、保水、凝膠、乳化、穩(wěn)定等作用，不僅能夠改善食品品質，還具有營養(yǎng)價值[12,13]。在面團烘焙前，加入適量的親水膠體，如黃原膠(xanthangum，XG)，羥丙基纖維素，海藻酸鈉，結冷膠等，蛋糕的品質可以被改善，水分含量提高，儲藏時間延長[14-16]。

　　近年來，多種親水膠體被報道能夠抑制有害美拉德反應產物的生成，如丙烯酰胺(Acrylamide，AA)，雜環(huán)胺(heterocyclicamine，HAs)和AGEs。殼聚糖，柑橘果膠(orangepectin,OP)，瓜爾膠，羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose，CMC)，海藻酸(alginicacid，ALA)和XG均被報道具有顯著抑制食品加工過程中AA生成的能力[17-19]。羧甲基纖維素鈉，殼聚糖和κ-卡拉膠在抑制HAs上也表現(xiàn)出了良好的效果，在牛肉餅模型中，它們對主要HAs的抑制率分別可達78.8%，61.1%和90%[20,21]。

　　本研究評價了9種親水膠體，包括植物膠(角豆膠(Carobgum，CG)、柑橘果膠(orangepectin，OP))、動物膠(明膠(Gelatin，GEL))、微生物膠(XG)、海藻膠(瓊脂(agar，AG)、ALA、卡拉膠(carrageenan，CAR))和化學改性膠(CMC、羥丙基磷酸雙淀粉(hydrogenphosphate，HDP))。在糖基化化學模型中對AGEs形成的抑制作用。選出抑制效果最佳的兩種親水膠體，分別加入海綿蛋糕，評價兩者對其品質及AGEs形成的影響，為海綿蛋糕以及烘焙類休閑食品的安全生產提供理論基礎。

　　1材料與方法

　　1.1材料與試劑

　　牛血清白蛋白(bovinealbumin，BSA)、AG(150~250mPa·s)、CAR(≥0.005Pa·s)、MGO(質量分數(shù)40%溶液)、乙二醛(glyoxal，GO)(質量分數(shù)40%溶液)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;ALA(300~500mPa·s)、XG(2500~3000mPa·s)、正己烷(色譜純)、甲醇、甲酸均為質譜純美國Sigma-Aldrich公司;果糖(fructose，F(xiàn)ru)、葡萄糖(glucose，Glu)、CMC(2500~4500mPa·s)、GEL(5~20mPa·s)、磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer，PBS)、鄰苯二胺上海麥克林生化科技有限公司;CG(300~600mPa·s)、HDP(900～1100mPa·s)、OP(100~200mPa·s)上海源葉生物科技有限公司。

　　1.2儀器與設備

　　F-7000型熒光分光光度計日本日立公司;SPX-250B-2型恒溫生化培養(yǎng)箱上海博迅實業(yè)有限公司;SCIEXTripleQuad6500+LC-MS/MS質譜儀美國Agilent公司;WatersACQUITYUPLCIClass超高效液相色譜美國沃特世公司;SHA-CA型數(shù)顯恒溫水浴振蕩器常州普天儀器制造有限公司;DK-320S數(shù)顯恒溫水浴鍋上海精宏實驗設備有限公司;DK-TO02電烤箱廣東新寶電器股份有限公司;CR-400便攜式色差儀日本美能達公司;Ez-Test-500N質構儀日本島金公司。

　　1.3方法

　　1.3.1糖基化化學模型中9種親水膠體對AGEs抑制效果的評價1.3.1.1BSA-Fru/Glu模型的建立BSA-Fru和BSA-Glu模型的建立參考Wang等人[22]和Peng等人[23]的方法，稍加修改。用50mmol/LPBS(含0.02%NaN3pH7.4)分別配制60mg/mLBSA溶液、1.5mol/LFru溶液和0.8mol/LGlu溶液。取1mLFru或Glu溶液，1mLBSA溶液和1.0%(w/w)的親水膠體加入有螺帽的10mL試管中混勻作為實驗組[18]，空白組不加親水膠體，作為對照。在恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育7天后，測定反應體系中熒光AGEs含量。每個樣品做3組平行。

　　1.3.1.2BSA-MGO/GO模型的建立BSA-MGO和BSA-GO模型的建立參考按照Wang等人[24]的方法，但稍加修改。用50mmol/LPBS(含0.02%NaN3pH7.4)分別配制30mg/mLBSA、60mmol/L的MGO和GO溶液。取1mLMGO或GO溶液和1.0%(w/w)的親水膠體在有螺帽的10mL試管中混勻作為實驗組，空白組不加親水膠體，作為對照。在37℃孵育2h后，分別在試管中加入1mL30mg/mLBSA繼續(xù)孵育7天后測定熒光AGEs含量。每個樣品做3組平行。

　　1.3.2化學模型中熒光AGEs測定方法參考Huang等人[25]的方法，取1.3.1.1、1.3.1.2模型反應體系中的液體樣品通過F-7000型熒光分光光度計測量激發(fā)/發(fā)射波長325/440nm處的熒光強度來確定溶液中熒光AGEs的含量。

　　1.3.3化學模型中ALA和XG添加量對AGEs形成的影響

　　選用1.3.2中篩選出的對熒光AGEs抑制效果最佳的ALA和XG作為研究對象。分別將1.3.1.1、1.3.1.2實驗組中1.0%(w/w)的親水膠體分別替換為0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(w/w)的ALA和XG，其它步驟不改變。孵育后測定各個模型體系中熒光AGEs，蛋白氧化產物，游離態(tài)和結合態(tài)CML和CEL的含量，進一步探究在BSA-Fru/Glu和BSA-GO/MGO模型中，ALA和XG添加量對AGEs形成的影響。每個樣品做3組平行。

　　1.3.4化學模型中非熒光性AGEs含量測定方法游離態(tài)CML和CEL檢測樣品的前處理參考卞華偉等人[26]建立的方法，即將模型反應體系中液體樣品用Milli-Q水稀釋至5mL。7000g/min，4℃離心15min。取1mL上層清液，過固相萃取柱(CleanertPCX,150mg/6mL)去除雜質。

　　然后加3mLMilli-Q水洗脫，收集洗脫液，過0.22μm尼龍膜后待測。結合態(tài)CML和CEL檢測樣品的前處理參考Assar等人[27]和Chen等人[28]的方法。向前處理完成后的樣品中加入Milli-Q水定容至50mL，使用0.22μm的有機濾頭過濾。取1mL濾液，通過預先平衡好的固相萃取柱(CleanertPCX,150mg/6mL)，收集液體待測。采用SCIEXTripleQuad6500+UPLC-MS/MS對CML和CEL進行定量分析，測量方法參考Chen等人[28]。利用X-BridegeC18柱(4.6mm×150mm，5μm)對CML和CEL進行了色譜分離，線性范圍為3~300ng/mL。

　　UPLC條件：X-BridegeC18色譜柱(4.6mm×150mm，5μm);流動相為A相(0.3%(v/v)甲酸水溶液)和B相(甲醇);流動相流速0.3mL/min;柱溫30℃;進樣量2μL。采用以下梯度洗脫：0~0.4min，10%B;0.4~3.5min，10%~60%B;3.5~4.0min，60%~10%B;4.0min~6.0min，10%B。MS/MS條件：ESI+模式。監(jiān)測方式：MRM模式;離子源溫度300℃;錐孔電壓20eV;毛細管電壓4kV。CML：205>84;CEL：219>84。

　　1.3.5ALA和XG添加量對MGO和GO清除率的影響

　　參考王佳琦等人[29]建立的方法，向10mL試管中分別加入2mL60mmol/LMGO或60mmol/LGO，然后分別加入0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(w/w)的ALA或XG，混勻。在90℃油浴鍋中避光反應30min后迅速取出試管，冰浴冷卻終止反應。

　　空白組則不添加ALA和XG，作為對照。測定樣品中MGO或GO殘留量。由于二羰基化合物無法直接測定，將MGO和GO衍生成甲基喹諾啉和喹諾啉，然后用SCIEXTripleQuad6500+UPLC-MS/MS進行定量。標準品和樣品按照趙瓊暉等人[30]建立的方法衍生化處理后過0.22μm膜后注入SCIEXTripleQuad6500+UPLC-MS/MS進行定量。UPLC條件：X-BridegeC18色譜柱(4.6mm×150mm，5μm);流動相為A相(0.1%(v/v)甲酸水溶液)和B相(0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液);流動相流速0.5mL/min;柱溫30℃;進樣量2μL。采用以下梯度洗脫：0~1.0min，60%A;1.0~3.0min，60%~30%A;3.0~4.0min，30%~60%A;4.0min~6.0min，60%A。

　　MS/MS條件：ESI+模式。監(jiān)測方式：MRM模式;離子源溫度300℃;錐孔電壓20eV;毛細管電壓4kV。MGO衍生物：145>77;GO衍生物：131>104。按公式(1)計算ALA和XG對MGO或GO的清除率。每個樣品做3組平行。

　　1.3.6烘焙溫度和烘焙時間對海綿蛋糕中AGEs含量和品質的影響

　　1.3.6.1海綿蛋糕樣品的制備蛋糕的基本配方為100g低筋面粉，100g鮮雞蛋，白糖100g，含鹽黃油10g。蛋糕的制備方法參照Wang等人[31]，每個面糊的質量為100g，面糊分別在不同的溫度、時間下進行烘焙(155℃下分別烘焙30、35、40、35、50min;180℃下分別烘焙25、30、35、40、45min;205℃下分別烘焙15、20、25、30、35min;230℃下分別烘焙15、17、19、21、23min)。冷卻后，蛋糕被細磨并儲存在-20℃以作進一步分析。每組處理的蛋糕做3個平行。

　　1.3.7ALA和XG添加量對海綿蛋糕中AGEs含量和品質的影響分別將0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(w/w)ALA或XG與100g低筋面粉混合，親水膠體的百分比是以面粉的質量為基礎。按1.3.7.1節(jié)的方法制備蛋糕，每個面糊在180℃的烤箱中烘焙40min。不添加ALA和XG的海綿蛋糕作為空白對照組。按1.3.7.2節(jié)和1.3.7.3節(jié)中的方法測定不同ALA和XG添加量對海綿蛋糕色度、水分含量以及熒光AGEs、蛋白氧化產物、結合態(tài)和游離態(tài)CML和CEL含量的影響。蛋糕的老化程度由硬度的變化率來表示，用質構儀測定室溫放置0d和4d的海綿蛋糕硬度，分別記為H1和H2，硬度變化率按公式(4)計算。硬度變化率/%=

　　2結果與分析

　　2.1化學模型中親水膠體對熒光AGEs生成量的影響

　　以熒光強度為指標，考察了9種親水膠體對4個不同階段糖基化反應化學模型(BSA-Fru、BSA-Glu、BSA-MGO和BSA-GO模型)中熒光AGEs生成量的影響。選用BSA-Fru/Glu模型用來評估整個糖基化反應的過程，其中Fru的羰基結構與氨基殘基反應的程度高于Glu，反應比Glu更活躍[33]。二羰基化合物(如GO和MGO)與蛋白質的氨基酸殘基發(fā)生不可逆的反應，最終導致AGEs的形成[34]。

　　因此BSA-GO/MGO模型通常用于評估蛋白質糖基化的中間階段。BSA-Fru中，在1%(w/w)添加量下，除了CG與空白組對比不顯著外，其他不同親水膠體都能在一定程度上降低熒光性AGEs的形成。其中，XG和ALA顯著降低了熒光AGEs的熒光強度(P<0.05)，抑制率可達34.55%和25.20%。

　　在BSA-Glu模型中，9種親水膠體抑制熒光AGEs生成的順序同BSA-Fru模型相似。在BSA-MGO/GO模型中，XG和ALA均顯著降低熒光AGEs的形成，推測兩種膠體可能是通過阻止二羰基化合物與蛋白質結合來抑制AGEs的生成。對比BSA-GO和BSA-MGO反應模型，后者中所有親水膠體的熒光AGEs的抑制率明顯高于前者，且與空白相比抑制效果更顯著。

　　這意味著親水膠體可能對BSA與MGO的結合具有更強的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，多酚的羥基和羧基可以與MGO和GO發(fā)生親電取代反應[8]，而氨基酸主要是通過氨基對二羰基化合物的加合作用來阻斷AGEs的形成[35]。因此，含有羥基、氨基和羧基的親水膠體可能具有與多酚和氨基酸類似的AGEs抑制機制。在上述四個化學模型中，不同親水膠體對AGEs形成的抑制效果不同，這可能是由于膠體中不同官能團的親核性不同[21]。綜上，選用AGEs抑制效果最佳的ALA和XG進行后續(xù)研究。

　　2.2化學模型中ALA和XG添加量對AGEs生成量的影響

　　2.2.1添加量對熒光AGEs生成量的影響

　　ALA和XG的添加量對BSA-Fru、BSA-Glu、BSA-MGO和BSA-GO模型中的熒光AGEs抑制作用。ALA對化學模型中熒光性AGEs的抑制作用隨著添加量的升高而增強。

　　當添加量達到2%(w/w)時，ALA對BSA-Fru、BSA-Glu、BSA-MGO和BSA-GO模型的熒光AGEs抑制率分別達到33.26%、21.25%、45.65%和21.07%，這說明ALA對熒光AGEs有良好的抑制效果，且抑制率與ALA的添加量呈正相關。在BSA-Fru和BSA-Glu模型中，當XG增加至0.5%(w/w)時，熒光AGEs含量顯著降低(P<0.05)，當其添加量從0.5%增加至2.0%(w/w)時，熒光AGEs含量逐漸升高。這可能是由于XG在高添加量下黏度增加，阻礙了體系內反應的進行[36]。在BSA-MGO模型中，ALA和XG的抑制效果均隨著添加量的增加而升高，推測是ALA和XG與MGO之間發(fā)生了反應從而抑制了AGEs的生成，這意味著更多的二羰基化合物變成了其他產物[37]。

　　2.3烘焙條件對海綿蛋糕中AGEs含量和品質的影響

　　2.3.1烘焙條件對海綿蛋糕中AGEs和蛋白氧化產物含量的影響

　　蛋白質的氧化通常伴隨著AGEs的形成，蛋白氧化產物的含量是測定AGEs生成的一個重要標志。在AGEs形成的過程中蛋白質被氧化成二酪氨酸,犬尿氨酸和N′-甲酰犬尿氨酸[39]。其中，犬尿氨酸在人體內的產生與神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茲海默癥、帕金森癥等)、炎癥和抑郁癥等病癥有關[40]。在未烘焙之前，面糊中熒光AGEs和蛋白氧化產物的熒光強度為0，非熒光AGEs含量低于3ng/mL，可忽略不計。

　　烘焙后熒光性AGEs傾向于在低溫烘焙條件下積累。在烘焙初期，熒光性AGEs快速累積達到峰值后開始出現(xiàn)下降趨勢，溫度越高達到峰值所需的時間越短。當烘焙溫度為155℃時，熒光AGEs和蛋白氧化產物含量直到50min也未達到峰值。而在180℃下，35min時出現(xiàn)熒光AGEs的峰值，隨后40min和45min含量相對于峰值分別下降15.23%和24.55%。

　　當焙烤溫度為230℃時，熒光AGEs含量在17min時即達到峰值，隨后大幅度下降，同時二酪氨酸含量也發(fā)生了下降，較15min時下降了12.61%，在19min時又出現(xiàn)上升趨勢。游離態(tài)和結合態(tài)CML含量隨著烘焙溫度升高的變化趨勢與熒光性AGEs相同，在初期快速積累，達到峰值后出現(xiàn)下降，而CEL受烘焙溫度的影響不明顯，這可能是由于烘焙強度的增大使CML發(fā)生分解或參與其他反應，如形成類黑精等[41]。高溫的烘焙方式會減少AGEs在蛋糕中的累積，如205℃下烘焙21min和23min的蛋糕中熒光AGEs、非熒光AGEs及蛋白氧化產物含量均顯著低于其他烘焙條件下的蛋糕。

　　2.4ALA和XG添加量對海綿蛋糕品質、AGEs和蛋白氧化產物含量的影響

　　2.4.1添加量對海綿蛋糕品質的影響

　　海綿蛋糕中加入適量親水膠體能夠改善結構，提高水分含量，延長儲藏時間和延緩淀粉的老化作用[42]。添加ALA和XG的海綿蛋糕品質屬性分析。與空白對照組相比，除了ALA添加量為0.5%和1.5%(w/w)以及XG添加量為1.5%(w/w)時，其他添加量的ALA和XG對海綿蛋糕的顏色(E值)均不產生顯著影響(P>0.05)。

　　儲藏期蛋糕的硬度變化率與蛋糕的老化程度呈正相關，其中數(shù)據(jù)可以看出ALA和XG的加入明顯降低了放置4d的蛋糕硬度變化率，提高了海綿蛋糕的水分含量，說明親水膠體的加入可以延緩蛋糕中淀粉的老化，這可能是因為海藻酸在蛋糕組織中形成保水性較好的凝膠結構，ALA添加量的增大使得分子間相互作用增強，凝膠性能也更好，持水能力得到增強[43]。而黃原膠作為一種天然多糖大分子，能夠填充到蛋糕膨脹的淀粉三維網(wǎng)狀組織中，形成膜壁，從而阻礙淀粉羥基之間的締結，進而增大海綿蛋糕的水分含量和持水能力[44]。

　　結論

　　本實驗在糖基化化學模型中證明了ALA和XG具有良好的熒光AGEs抑制能力，且AGEs抑制率隨著ALA添加量的增加而提高，XG添加量在低濃度時的抑制率高于高濃度，二者對蛋白氧化產物也有良好的抑制作用。此外，實驗還證明了ALA或XG能夠顯著降低二羰基化合物MGO和GO的含量，當二者添加量為2.0%(w/w)時，MGO清除率分別為34.92%和42.08%，GO清除率分別為14.45%和21.48%，推測原因可能是ALA和XG能夠捕獲MGO和GO形成加合產物。烘焙條件對蛋糕的品質屬性和AGEs生成量均有顯著影響，隨著溫度的上升和時間的延長，蛋糕的顏色加深，硬度增加，水分含量降低。

　　蛋糕中游離態(tài)和結合態(tài)的CML、CEL含量均隨著烘焙時間的延長呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，焙烤溫度升高會使CML積累量的峰值提早達到，CEL則受溫度影響較小。結合品質屬性和AGEs含量，確定了最佳烘焙條件為180℃烘焙40min。蛋糕中親水膠體最佳添加量為2.0%(w/w)ALA或0.25%(w/w)XG，在此濃度下，蛋糕的品質屬性良好且AGEs含量較低。

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　　作者：王申宛1,2，鄭曉燕2，艾斌凌2，鄭麗麗2，楊旸2，校導2，張海德1,*，盛占武2,*