摘要：采用組織分離法從黃皮疣柄牛肝菌、小美牛肝菌、雙色牛肝菌的子實體中，分離純化獲得株內(nèi)生真菌，經(jīng)菌落、菌絲、孢子形態(tài)學(xué)觀察及rDNAITS分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果顯示：菌株LCTG12為蓋姆斯木霉Trichodermagamsii、LCCK為克魯伊假絲酵母Candidakruisii、BSHC18為黃瘤孢菌Hypomyceschrysospermus、BBFO10為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysprum。對株內(nèi)生真菌生物學(xué)特性進(jìn)行研究，其中蓋姆斯木霉菌絲生長速度較快，在CPDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)5d菌絲長滿平板;液態(tài)培養(yǎng)時，該菌株在25℃、搖床轉(zhuǎn)速160r/min、pH5.5、8d，可獲得菌絲干基生物量4.13g/L。平板對峙實驗結(jié)果：蓋姆斯木霉LCTG12對黃瘤孢菌BSHC18和尖孢鐮刀菌BBFO10菌絲生長均有拮抗作用，并且，黃瘤孢菌BSHC18和尖孢鐮刀菌BBFO10兩者之間也具有拮抗作用，表明牛肝菌內(nèi)生真菌中蓋姆斯木霉對腐敗菌具有拮抗作用，可為生物防腐提供優(yōu)良的菌株。

　　關(guān)鍵詞：野生牛肝菌，組織分離法，內(nèi)生真菌，ITS分子鑒定

　　牛肝菌(Boletaceae是真菌界(Fungi)，擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，傘菌目(Agaricates)的大型真菌[1]，我國已知牛肝菌科有28屬，397種及變種[2]，主要產(chǎn)地在云南。牛肝菌是一個復(fù)雜的生命體，其整個生命周期都伴隨著內(nèi)生真菌，內(nèi)生菌之間可通過相互作用共同促進(jìn)宿主的生長發(fā)育，也可與大型真菌的協(xié)同作用促進(jìn)宿主產(chǎn)生更多的次生代謝產(chǎn)物。

　　生物真菌論文范例：構(gòu)樹葉投喂草魚腸道真菌群落多樣性研究

　　內(nèi)生真菌(Endophyticfungi)定殖于健康的生物組織內(nèi)部[3]，是構(gòu)成菌物生態(tài)系統(tǒng)的天然組分。目前，具有抑菌、抗癌等活性的大量次生代謝產(chǎn)物從內(nèi)生真菌中分離出來[47]，內(nèi)生真菌將成為開發(fā)生物活性物質(zhì)的資源寶庫[8]。野生牛肝菌是優(yōu)良的外生菌根真菌，其生長對寄主要求嚴(yán)格，大多數(shù)種類仍不能通過人工栽培形成子實體[910]，在野生牛肝菌子實體獲得母種菌絲的分離過程中，研究明確與其內(nèi)生真菌的關(guān)系，是獲得原種、栽培種的基礎(chǔ)，也是獲得新的真菌資源途徑之一。牛肝菌子實體含有大量人體必需氨基酸、礦物質(zhì)、以及多種生物活性成分[1112]，具有降血脂、抗氧化、護(hù)肝、抗腫瘤、降血糖、清熱解煩等功能[1317]。對于牛肝菌的研究主要集中在化學(xué)成分、生物活性等方面[1819]，而對于牛肝菌內(nèi)生真菌的報道較少，丁小維等[20]從牛肝菌子實體中分離出毛霉屬Mucorsp.)和黃瘤孢菌Hypomyceschrysospermus株內(nèi)生真菌，并發(fā)現(xiàn)株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液都能抑制豆芽的生長。岳萬松等[21]從種牛肝菌子實體中分離出株內(nèi)生真菌，分別為毛栓菌Trameteshitsuta、假絲酵母屬Candidasp.)、被孢霉屬Mortierellasp.)、散囊菌屬Eurotiumsp.)、金色毛殼菌Chaetomiumaureum。組織分離法是分離內(nèi)生真菌的重要方法之一，本研究通過組織分離法從種新鮮野生牛肝菌中分離獲得株內(nèi)生真菌，結(jié)合菌株的形態(tài)特征和rDNAITS序列分析，對菌株進(jìn)行鑒定，構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹，并對幾種內(nèi)生真菌生長規(guī)律及內(nèi)生真菌之間的拮抗關(guān)系等生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在為深入研究野生牛肝菌與內(nèi)生真菌之間的關(guān)系進(jìn)行初步探究，并為牛肝菌生長過程及采摘后的生物防腐提供優(yōu)良的生防菌株，也可為開發(fā)新資源化合物提供菌種資源[2224]。

　　1材料與方法

　　1.1材料與儀器

　　鮮野生牛肝菌子實體：黃皮疣柄牛肝菌Leccinumcrocipodium(Letellier)watl.)、小美牛肝菌BoletusspeciosusFrost)、雙色牛肝菌BoletusbicolorPeck)分別采摘于云南省楚雄彝族自治區(qū)祿豐縣和南華縣，無菌袋、冰袋封裝，空運24h內(nèi)分離。GK2043(膠回收試劑盒)GK1071(DNA提取試劑盒)引物ITS1和ITS4上海捷瑞生物工程有限公司合成。

　　固體培養(yǎng)基CPDA：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KHPO43g，MgSO·7HO1.5g，VB1mg，蛋白胨0.5，瓊脂20g，水，pH自然(液態(tài)培養(yǎng)基去掉瓊脂);固體培養(yǎng)基Pachlewski：葡萄糖20g，酒石酸銨0.5，KHPO41g，MgSO·7HO0.5g，VB0.1mg，瓊脂20g，mL/L微量元素混合液(BO8.45mg，MnSO5mg，F(xiàn)eSOmg，CuSO0.625mg，ZnCl2.77mg，(NHMoO0.27mg)，去離子水1L;固體培養(yǎng)基MMN：NaCl0.025g，葡萄糖10g，KHPO40.5g，麥芽浸粉3.0g，VB0.1mg，CaCl0.05g，(NHHPO40.25g，瓊脂20g，F(xiàn)eCl0.012g，MgSO·7HO0.15g;75%乙醇;JY300C電泳儀北京君意電泳設(shè)備有限公司;JY02G凝膠成像系統(tǒng)北京君意電泳設(shè)備有限公司;BeckmanJT25R高速冷凍離心機美國貝克曼庫爾特有限公司;ABI3730測序儀北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司。

　　1.2實驗方法

　　1.2.1野生牛肝菌內(nèi)生真菌分離與純化

　　將新鮮野生牛肝菌子實體用自來水沖洗數(shù)次，去除表面雜質(zhì)，無菌水沖洗遍，75%乙醇漂洗2min，再用無菌水沖洗次，無菌紗布擦干子實體表面。采用組織分離法進(jìn)行以下操作，用無菌解剖刀將牛肝菌子實體縱切開后，將內(nèi)部的組織切割成0.5cm左右的小塊，接種于CPDA培養(yǎng)基中，25℃恒溫避光培養(yǎng)5d。待小塊組織周圍有內(nèi)生真菌菌絲長出后，挑取少許菌絲，采用點植法純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接次。共獲得23株純菌株，并移接至斜面試管4℃保存。

　　1.2.2野生牛肝菌內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)鑒定

　　將23株真菌分別點植固體平板培養(yǎng)，挑選出形態(tài)、顏色有明顯差異的菌落株，分別接種到CPDA固體平板上，25℃避光培養(yǎng)5d，觀察菌落形態(tài)，顯微鏡觀察菌絲及分生孢子顏色、形態(tài)，以十字交叉法記錄菌落直徑，且移接至斜面試管，待培養(yǎng)長出菌絲體后，4℃保存。

　　1.2.3基于rDNAITS序列分析的內(nèi)生真菌分子鑒定

　　采用GK1071提取試劑盒，對株純化菌株進(jìn)行DNA提取。使用真菌ITS鑒定通用引物：ITS1：’TCCGTAGGTGAACCTGCGG’和ITS4：’TCCTCCGCTTATTGATATGC’對DNA的ITS片段進(jìn)行PCR擴增。擴增體系為30µL反應(yīng)體系，包括：10TaqBuffer3µL，dNTP1µL，Taq酶1µL，上游引物(10µmol/L)和下游引物(10µmol/L)各1µL，DNA模板2µL，ddH補足至30µL。

　　反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，5min，95℃，15s，95℃，15s，95℃，45s，35個循環(huán)，72℃，5min保存。PCR擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳體系檢測，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物用膠回收試劑盒GK2043回收，送到上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行測序。將株內(nèi)生真菌所測序列在GenBank中進(jìn)行BLAST對比，選擇同源性高于95%的序列，運用MEGA軟件進(jìn)行多重比較，通過NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并以bootstrap對發(fā)育樹進(jìn)行自舉法檢驗1000次，從而確定菌株的親緣關(guān)系及分類地位。

　　1.2.4液態(tài)發(fā)酵及干基生物量的測定

　　接種1cm菌絲塊于裝液量為80mL的250mL三角瓶中，在25℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，分別稱量10d的生物量干重，每組設(shè)置個重復(fù)，將發(fā)酵液在5000r/min離心10min，收集菌絲體移至干燥皿中，置于70℃烘箱中，每隔1h取出稱量，直到重量不再改變，即為生物量干重。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1菌株的形態(tài)特征

　　從云南省個地區(qū)采摘的個種的野生牛肝菌子實體，共分離出可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌23株，通過菌落形態(tài)初步判斷多數(shù)為木霉屬，從中篩選出具有菌落形態(tài)、顏色、氣味等差異大的株菌種，接種于CPDA培養(yǎng)基上，在25℃下培養(yǎng)5d，平板生長的菌落形態(tài)、光學(xué)顯微鏡觀察的菌絲、孢子形態(tài)，利用MoticImagesPlus2.0軟件進(jìn)行顯微形態(tài)(10×100)拍攝。

　　2.24種內(nèi)生真菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及分析

　　利用ITS通用引物(ITS1、ITS4)對株內(nèi)生真菌進(jìn)行序列擴增得到條基因序列，序列長度分別是LCTG12為620bp;LCCK為421bp;BSHC18為606bp;BBFO10為550bp。將以上條序列分別在NCBI庫中進(jìn)行在線BLAST比對，每種菌下載條同源性高于95%的序列，以測序得到的基因序列為基礎(chǔ)，同公共數(shù)據(jù)庫下載的相似序列合并，采用MEGA軟件，按照neighborjoiningmethod(法)，經(jīng)過自舉法1000次進(jìn)行檢驗構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以此對菌株進(jìn)行種水平的分類鑒別。

　　株菌在NCBI中LAST比對結(jié)果顯示：在100條序列比對結(jié)果中，LCTG12與76株木霉屬序列Trichodermasp.)的序列同源性為99%以上，說明該菌為木霉屬;LCCK與55株念珠菌屬Candida的序列同源性為90%以上說明該菌為念珠菌屬;BSHC18與50株菌寄生屬Hypomycessp.)的序列同源性為90%以上說明該菌為菌寄生屬;BBFO10與94株Fusariumoxysprum的序列同源性為99%以上。系統(tǒng)發(fā)育樹樹枝的長短表示各菌株之間的遺傳距離，同一支說明親緣關(guān)系很近，以系統(tǒng)發(fā)育方法可以對關(guān)系較為密切的菌株序列進(jìn)行較好的判別。

　　結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定及BLAST對比及系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果：LCTG12與NCBI數(shù)據(jù)庫中的Trichodermagamsii聚類在同一支上，自檢支持率100%，鑒定該菌為蓋姆斯木霉;LCCK與Candidakruisii聚類在同一支上，自檢支持率為100%，鑒定該菌為克魯伊假絲酵母;BSHC18與Hypomyceschrysospermus聚類在同一支上，自檢支持率為100%，鑒定該菌為黃瘤孢菌;BBFO10與Fusariumoxyspru聚類于同一株上，自檢支持率達(dá)100%，鑒定該菌為尖孢鐮刀菌。

　　2.3野生牛肝菌內(nèi)生真菌的生物學(xué)特性

　　2.3.1種培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌生長速度的影響為掌握株內(nèi)生真菌(LCTG12、LCCK、BSHC18、BBFO10)的生物學(xué)特性，選擇CPDA、Pachlewski、MMN為供試培養(yǎng)基，研究種培養(yǎng)基對菌絲生長速度的影響，25℃培養(yǎng)，在cm的平板上采用十字交叉法測量菌落直徑，結(jié)果如圖所示。由圖可知，在培養(yǎng)第4d時進(jìn)行菌落直徑測量，PDA上的生長速度明顯優(yōu)于其他種培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌LCTG12培養(yǎng)5d，LCCK培養(yǎng)6d，BSHC18培養(yǎng)7d，BBFO10培養(yǎng)8d可長滿平板，故選擇CPDA培養(yǎng)基為種內(nèi)生真菌的最適培養(yǎng)基。

　　結(jié)論

　　目前對于牛肝菌中的內(nèi)生真菌報道較少，為探究野生牛肝菌中內(nèi)生真菌資源，及分析其內(nèi)生真菌間是否存在拮抗關(guān)系，本文以種新鮮野生牛肝菌子實體為分離材料，經(jīng)過組織分離純化共得到23株純菌株，從中篩選出株具有典型特征的純菌進(jìn)行形態(tài)觀察和ITSrDNA現(xiàn)代分子生物學(xué)鑒定，鑒定出內(nèi)生真菌LCTG12為蓋姆斯木霉Trichodermagamsii;LCCK為克魯伊假絲酵母Candidakruisii;BSHC18為黃瘤孢菌Hypomyceschrysospermus;BBFO10為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysprum，并對幾種內(nèi)生真菌生長規(guī)律及內(nèi)生真菌之間的拮抗關(guān)系等生物學(xué)特性進(jìn)行研究。

　　得出結(jié)論：CPDA培養(yǎng)基較適合這株菌的生長，其中蓋姆斯木霉的生長速度較快，5d即可長滿9cm的平板，其余種菌株長滿板的時間分別為6、7d、8d，并且蓋姆斯木霉對黃瘤孢菌和尖孢鐮刀菌菌絲生長均有拮抗作用，黃瘤孢菌和尖孢鐮刀菌兩者之間也具有拮抗作用。

　　牛肝菌等大型真菌生長過程中會出現(xiàn)腐敗菌導(dǎo)致其菇體腐爛和根腐病[2628]，且內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物豐富[290]，故進(jìn)一步研究其內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性廣泛的次級代謝產(chǎn)物對新型藥用資源開發(fā)具有重要的意義。本文旨在為深入研究野生牛肝菌與內(nèi)生真菌之間的關(guān)系進(jìn)行初步探究，并為牛肝菌生長過程中可能出現(xiàn)的病害及采摘后的的生物防腐提供優(yōu)良的生防菌株。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1]卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出版社,2000:315.MaoXL.Chinesemacrofungi[M].Zhengzhou:HenanScienceandTechnologyPress,2000:315.

　　[2]李泰輝宋斌中國牛肝菌已知種類[J].貴州科學(xué)2003,31):7886.LiTH,SongB.oletespeciesknownfromChina[J].GuizhouScience,2003,31):7886.

　　[3]PetriniO.Fungalendophytesoftreeleaves[C]//AndrewsJH,HiranoSS,eds.Microbialecologyofleaves.NewYork:SpringerVerlag,1991:179197.

　　作者：徐偉，張雪，王植朔，謝紅瑤，吳凡，邵百琪