摘要：自然環境中的微/納米塑料污染日趨嚴重，但納米塑料對農作物生長的潛在影響尚不清楚。通過營養液培養方式，探討了粒徑為80nm的聚苯乙烯納米塑料(polystyrenenanoplastics,PS-NPs)對金鄉大蒜(AlliumsativumL.)葉綠素含量、抗氧化性能和營養品質的影響。結果顯示，添加PS-NPs處理的大蒜，其葉片葉綠素含量均顯著低于對照組，葉綠素的合成受到抑制。大蒜葉片SOD、APX活性和脯氨酸含量隨著PS-NPs質量濃度的增加呈先升高后降低的趨勢。10d處理時大蒜葉片POD活性隨PS-NPs質量濃度的增加而上升，但在20d處理時，各處理組POD活性均受到抑制。大蒜葉片MDA含量隨PS-NPs質量濃度的增加而增加，在ρ(PS-NPs)為100mg·L-1處理下，10d和20d處理時其含量相比對照分別增加43.24%和89.70%。同時，經ρ(PS-NPs)為100mg·L-1脅迫處理10d后，大蒜葉片可溶性蛋白質、可溶性糖和維生素C含量均高于對照組，但20d后，維生素C含量較對照則降低了26.53%。以上結果表明PS-NPs能對大蒜產生較為顯著的氧化脅迫效應，且較高質量濃度的PS-NPs脅迫會對大蒜葉片的營養品質產生一定的影響。

　　關鍵詞：金鄉大蒜;納米塑料;生長生理;抗氧化酶;營養品質

　　據統計，全球每年塑料生產量已超過3.2億t，多達74%的塑料垃圾最終被排放到環境中[1]。在物理、化學和微生物等作用下，塑料垃圾會被分解成無數微小的塑料碎片或顆粒[2]。同時，個人護理品中的塑料微珠以及人造紡織品聚合纖維等微塑料，也會直接進入環境。早在2004年，英國學者Thompson等[3]在研究海洋塑料垃圾污染時提出“微塑料”這一概念。

　　一般認為，當塑料碎片或顆粒的尺寸小于5mm時，即被定義為微塑料[4]。理論上，環境中的微塑料仍然會進一步分解，最終可形成尺寸小于100nm的納米塑料[5]。Besseling等[6]通過研究證實，在條件充分時，一個微塑料顆粒可以破碎成1014個以上的納米塑料。納米塑料體積小，比表面積大，使其很容易吸附攜帶其它污染物[7]。相較于微塑料，納米塑料也更容易被生物體吞食或被動攝入[8]，然后通過食物鏈在高營養層生物體內富集[9,10]，其毒性實驗也表明納米塑料對生物體和人類健康存在潛在危害[11]。

　　近年來，陸地生態系統中納米塑料污染受到廣泛重視，尤其是農業生態系統中的納米塑料對農作物生長的潛在危害[12-16]。連加攀等[17]的研究指出，粒徑為50nm的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、線性低密度聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯納米塑料能夠對小麥(TriticumaestivumL.)種子的發芽和生長產生抑制作用。Jiang等[18]的研究發現100nm的聚苯乙烯微球能夠干擾蠶豆(ViciafabaL.)生長過程中營養物質的運輸，并對作物產生遺傳毒性。

　　Giorgetti等[19]的研究結果也表明：50nm的聚苯乙烯微球能誘導洋蔥(AlliumcepaL.)細胞毒性(降低有絲分裂指數)、基因毒性(細胞遺傳異常和微核的誘導)和氧化損傷。整體而言，關于納米塑料對高等植物的影響研究仍然偏少，納米塑料對作物生長和品質的影響尚不清晰。大蒜是著名的食藥兩用植物，其蒜頭和蒜葉均可作蔬菜食用。聚苯乙烯是使用最為廣泛的塑料材料，常用于塑料杯、塑料薄膜等包裝盒和建筑保溫等產業，已成為土壤、湖泊和海洋的主要污染物[20]。因此，本研究選用廣泛種植的金鄉大蒜(AlliumsativumL.)作為供試材料，以粒徑為80nm的聚苯乙烯納米顆粒(polystyrenenanoplastics,PS-NPs)作為脅迫物質，探討不同質量濃度的PS-NPs對大蒜葉片葉綠素含量、抗氧化性能和營養品質的影響，以期為后續評估納米塑料對農作物的影響提供參考依據。

　　1材料與方法

　　1.1塑料微球

　　本研究采用由Nileblue熒光染料標記的紅色熒光PS-NPs，購自大鵝(天津)科技有限公司。PS-NPs呈球形，平均粒徑為80nm，變異系數<5%，在水相中分散和保存，原液中ρ(PS-NPs)為10000mg·L-1。

　　1.2供試大蒜和培養實驗

　　挑選飽滿且大小一致的金鄉大蒜蒜瓣，先用2%H2O2溶液浸泡約30min，進行表面滅菌，隨后用超純水多次漂洗去除殘留H2O2。用吸水紙擦拭干凈后，放置于直徑12cm的玻璃培養皿中。每盤處理放置12粒蒜瓣，加入20%Hoagland營養液160mL，隨后整盤置于光照培養箱(SPX-250B-G，上海博迅)中培養6d，待其莖盤長出短根及頂部冒出細牙后進行脅迫實驗。在脅迫實驗中，取適量PS-NPs原液，用20%Hoagland營養液稀釋，使培養液中ρ(PS-NPs)分別為1、10、50和100mg·L-1，取160mL培養液繼續培養。設置培養箱溫度為22℃±1℃，光照時間為13h，光照強度約9900lx。培養過程中每日早晚各添加適量純水補充蒸發量，每3d更換一次培養液。

　　在PS-NPs處理第10d和第20d采集植物葉片后測定。Hoagland營養液[21]成分為5.00mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O、5.04mmol·L-1KNO3、1.99mmol·L-1MgSO4·7H2O、1.03mmol·L-1KH2PO4、8.99μmol·L-1Fe2(C4H4O6)3、9.70μmol·L-1H3BO3、2.02μmol·L-1MnCl2·4H2O、0.31μmol·L-1ZnSO4、0.20μmol·L-1CuSO4·5H2O和0.09μmol·L-1H2MoO4·4H2O。取PS-NPs原液時，先超聲(120W)振動5min以保證取樣均勻。

　　同時培養液中每天早晚補水后適當攪拌，以保證培養液中納米塑料質量濃度均勻。葉片采集和后處理：先使用去離子水清洗大蒜葉片表面，用吸水紙擦拭干凈，然后使用手術剪刀分別剪取大蒜葉片中段。取樣完成后迅速完成部分指標測定，其余樣本先液氮速凍，然后迅速置于超低溫冷凍儲存箱(DW-HL100，中科美菱)中保存待測。

　　1.3指標測定方法葉綠素采用丙酮乙醇浸提法測定[22]，超氧化物歧化酶(SOD)采用黃嘌呤氧化酶法測定[23]，過氧化物酶(POD)采用愈創木酚顯色法測定[24]，抗壞血酸過氧化物酶(APX)采用紫外分光光度法測定[25]，脯氨酸采用酸性茚三酮顯色法測定[26]，丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸顯色法測定[26]，可溶性蛋白質采用考馬斯亮藍法測定[25]，可溶性糖采用蒽酮比色法測定[25]，維生素C采用比色法測定[25]。以上所有指標均采用試劑盒檢測。所有試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，詳細實驗步驟嚴格按照說明書進行。

　　1.4數據處理本實驗數據均使用SPSS26.0進行單因素ANOVA檢驗分析，以Duncan檢驗進行事后多重比較(P<0.05)。實驗數據均以平均值±標準偏差(Mean±SD)表示，圖形均采用Origin2018軟件繪制。

　　2結果與討論

　　2.1PS-NPs對葉綠素含量的影響

　　光合作用是植物必需的重要生理過程，能為植物生長和生物量的增加提供重要幫助，葉綠素含量的多少又能直接影響光合作用的強弱[27]。可見，添加PS-NPs處理后，葉片葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量都顯著低于對照組(P<0.05)，且都在ρ(PS-NPs)為1mg·L-1處理時出現最低值。Lian等[28]的研究結果表明，在100nm的PS-NPs脅迫下，生菜(LactucasativaL.)葉片的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量皆低于對照，與本研究結果一致。

　　葉綠素的合成是一個由多酶參與的復雜過程[29]，PS-NPs脅迫可能會降低合成關鍵酶活性，從而使得葉片葉綠素含量下降。本實驗中添加PS-NPs處理后，葉綠素含量均隨PS-NPs質量濃度的增加而上升，這可能是因為非生物逆境脅迫促使葉片濃縮，從而導致單位面積的葉綠素含量增加[30]，還有可能是在逆境脅迫下，葉綠素與葉綠體蛋白間的結合逐漸松弛，葉綠素更容易被提取，最終導致葉綠素含量增加[31]。

　　2.2PS-NPs對大蒜葉片的氧化損傷

　　SOD作為抗氧化防御的第一道防線，對機體氧化和抗氧化的平衡至關重要[32]。經PS-NPs脅迫處理10d和20d后，SOD活性隨PS-NPs質量濃度的增加均呈先升高后降低的趨勢，在ρ(PS-NPs)為10mg·L-1時，SOD活性相比對照分別上升了17.98%和7.33%，且差異顯著(P<0.05)。當ρ(PS-NPs)增大至100mg·L-1時，第10d和20d處理下，SOD活性相比對照分別降低了13.42%和20.87%，這表明高質量濃度的PS-NPs處理會顯著抑制大蒜葉片的SOD活性。

　　PS-NPs對大蒜葉片POD活性的影響。10d處理時，POD活性隨PS-NPs質量濃度的增加而上升，在ρ(PS-NPs)為100mg·L-1時，POD活性相比對照上升了138.55%，差異顯著(P<0.0520dpodps-npsps-nps50mgl-1100mgl-1pod46.2251.6910dps-npspodpodapxh2o233ps-npsapx2cps-nps10dapx74.33897.17179.937.57ps-nps10dapx20dapxps-nps1mgl-1100mgl-129.1158.44p>0.05)。這表明在本實驗PS-NPs質量濃度范圍內，PS-NPs脅迫處理20d內不會顯著抑制APX活性。

　　脯氨酸是一種可溶性滲透劑，能作為滲透調節介質、自由基清除劑和高分子結構穩定劑來幫助植物抵御外界環境脅迫[34]。PS-NPs對大蒜葉片脯氨酸含量的影響。可見，脯氨酸含量隨PS-NPs質量濃度的增加呈先增加后減少的趨勢。在ρ(PS-NPs)為10mg·L-1時，10d處理下，葉片脯氨酸含量達到峰值，最高脯氨酸含量相比對照增加了308.27%。而當ρ(PS-NPs)增加至100mg·L-1時，在20d處理下，葉片脯氨酸含量相比對照則減少12.77%。

　　MDA常常反映機體內脂質過氧化程度，也可間接地反映出細胞的氧化損傷程度[26]。經PS-NPs脅迫處理后，大蒜葉片MDA含量隨著PS-NPs質量濃度的增加而增加，在ρ(PS-NPs)為100mg·L-1、脅迫處理20d時，MDA含量達到最高，相比對照增加了89.70%。且在同一質量濃度的PS-NPs處理時，脅迫時間越長，MDA含量也越高。這表明隨著PS-NPs質量濃度增大和脅迫時間延長，大蒜葉片的脂質過氧化程度和細胞損傷程度在逐漸加重。SOD可清除機體內過量產生的超氧陰離子自由基(O2-·)，使之發生歧化反應，生成H2O2和O2[35]。

　　隨后，POD和APX活性也將被激活，催化分解H2O2生成H2O和O2[36]。Zhou等[37]的研究表明，在粒徑20nm的PS-NPs作用下，水稻根系SOD活性隨著PS-NPs質量濃度的增加而上升，與本實驗中ρ(PS-NPs)≤10mg·L-1處理10d時的結果較一致。同時，本實驗結果顯示，經ρ(PS-NPs)為100mg·L-1脅迫處理后，大蒜葉片的SOD活性被顯著抑制，這可能是由于產生的過量自由基已超過酶作用閾值[37]，且生成的過量H2O2也會抑制SOD活性[38]。

　　此外，在ρ(PS-NPs)為100mg·L-1時，10d后大蒜葉片的POD和APX活性均高于對照，這可能是因為氧化脅迫增強，植物體通過提高這兩種酶活性使自身免受傷害[25];但20d后兩者活性都受到抑制，這可能是由于H2O2的積累速度大于植物保護系統清除的速度，造成H2O2過度積累，從而導致酶活性出現抑制現象[39]。NPs具有顯著誘導APX酶基因表達的能力[40]，如在粒徑為100nm的PS-NPs脅迫下，黃瓜(CucumissativusL.)葉片APX酶基因相對表達水平提高了600%以上[25]。

　　本實驗中，在ρ(PS-NPs)為10mg·L-1時，10d脅迫下APX活性達到最大，推測可能是此時PS-NPs誘導的APX酶基因表達量顯著增加，從而使得APX活性顯著上升。本實驗中脯氨酸含量總體呈現先增大后減小的趨勢，這表明在一定PS-NPs質量濃度脅迫時，大蒜體內的脯氨酸能作為有效的抗氧化劑清除自由基，調節大蒜體內的氧化平衡狀態。從MDA含量變化來看，由于抗氧化酶活性在ρ(PS-NPs)為100mg·L-1、脅迫處理20d時都被抑制，導致機體內脂質過氧化程度顯著上升，即MDA含量顯著增加(P<0.05)，這也間接反映出高質量濃度PS-NPs的存在可對大蒜造成氧化損傷[41]。

　　2.3PS-NPs對大蒜葉片營養品質的影響

　　蛋白質、糖類和維生素等是植物體內重要的營養素，其含量的多少也可直接或間接反映出植物營養品質的高低[42]。PS-NPs脅迫下大蒜葉片可溶性蛋白質含量，經PS-NPs處理10d后，當ρ(PS-NPs)≤50mg·L-1時大蒜葉片可溶性蛋白質含量略低于對照，但當ρ(PS-NPs)增加至100mg·L-1時，可溶性蛋白質含量較對照增加9.45%。

　　在PS-NPs脅迫處理20d后，大蒜葉片可溶性蛋白質含量均高于對照，但增加均不顯著(>0.05)。可溶性糖含量在ρ(PS-NPs)為10mg·L-1和50mg·L-1時均顯著低于對照，PS-NPs的存在降低了大蒜葉片可溶性糖含量，表現出抑制作用;但在ρ(PS-NPs)為100mg·L-1時，處理10d和20d后，可溶性糖含量相比對照分別升高了2.50%和44.65%，表現出促進作用。

　　10d處理時，PS-NPs脅迫使得維生素C含量顯著增加。但20d處理時，維生素C含量呈先上升后下降的趨勢，并在ρ(PS-NPs)≥10mg·L-1時開始低于對照。當ρ(PS-NPs)增加至100mg·L-1時，維生素C含量較對照降低26.53%，達到差異顯著水平(<0.054344l.sativaps-npslian28ps-nps1mgl-1l.sativaps-nps1mgl-110d>0.05)，而此時可溶性糖含量要顯著高于對照，這可能是可溶性糖含量的增加緩解了PS-NPs的脅迫，進而可溶性蛋白質含量并未發生顯著變化[45]。

　　維生素C具有清除體內自由基、預防癌癥的作用，還有增強人體免疫功能、預防和治療缺鐵性貧血等多種功能，同時，維生素C作為植物抗氧化系統中的非酶性物質，對于抵御外界的非生物脅迫具有重要作用[46]。本研究中，10d處理時維生素C含量顯著增加，表明此時維生素C參與了緩解PS-NPs帶來的脅迫效應。在ρ(PS-NPs)為100mg·L-1時，20d脅迫使得維生素C含量顯著下降，可能是高氧化脅迫環境造成維生素C合成量下降，也可能是清除體內過量的自由基需要消耗大量的維生素C，消耗量大于合成量所致[47]。

　　3結論

　　(1)在粒徑為80nm的PS-NPs脅迫下，大蒜葉片的光合色素(葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素)含量均顯著低于對照，表明80nm的PS-NPs能顯著影響金鄉大蒜葉片葉綠素的合成過程。(2)80nm的PS-NPs能對大蒜葉片造成氧化脅迫，植物則可以通過提高SOD、POD、APX酶活性和脯氨酸含量來緩解一定程度的氧化脅迫環境。(3)80nm的PS-NPs對大蒜葉片可溶性蛋白質含量的影響不顯著，對可溶性糖、維生素C含量的影響和PS-NPs質量濃度、脅迫時間有關，納米塑料對大蒜葉片營養品質的影響還需進一步研究。

　　參考文獻：

　　[1]AlimiOS,FarnerBJ,HernandezLM,etal.Microplasticsandnanoplasticsinaquaticenvironments:Aggregation,deposition,andenhancedcontaminanttransport[J].EnvironmentalScience&Technology,2018,52(4):1704-1724.

　　[2]任欣偉,唐景春,于宸,等.土壤微塑料污染及生態效應研究進展[J].農業環境科學學報,2018,37(6):1045-1058.RenXW,TangJC,YuC,etal.Advancesinresearchontheecologicaleffectsofmicroplasticpollutiononsoilecosystems[J].JournalofAgro-EnvironmentScience,2018,37(6):1045-1058.

　　[3]ThompsonRC,OlsenY,MitchellRP,etal.Lostatsea:Whereisalltheplastic?[J].Science,2004,304(5672):838-838.

　　[4]LawKL,ThompsonRC.Microplasticsintheseas[J].Science,2014,345(6193):144-145.

　　[5]楊婧婧,徐笠,陸安祥,等.環境中微(納米)塑料的來源及毒理學研究進展[J].環境化學,2018,37(3):383-396.YangJJ,XuL,LuAX,etal.Researchprogressonthesourcesandtoxicologyofmicro(nano)plasticsinenvironment[J].EnvironmentalChemistry,2018,37(3):383-396.

　　[6]BesselingE,RedondoHP,FoekemaEM,etal.Quantifyingecologicalrisksofaquaticmicro-andnanoplastic[J].CriticalReviewsinEnvironmentalScience&Technology,2019,49(1):32-80.

　　[7]ShenMC,ZhangYX,ZhuY,etal.Recentadvancesintoxicologicalresearchofnanoplasticsintheenvironment:Areview[J].EnvironmentalPollution,2019,252,doi:10.1016/j.envpol.2019.05.102.

　　作者：邱陳陳1，李國新1*，李青松1，顏昌宙2